En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Sommario

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto < 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

Abstract

La complessa struttura laminare della retina presenta sfide significative per una mappatura molecolare spaziale completa. Le attuali tecniche per studiare l'architettura dei tessuti e le interazioni molecolari sono limitate da vincoli tecnici che compromettono le relazioni spaziali o limitano la profilazione molecolare. I metodi esistenti come il sezionamento trasversale, le preparazioni di montature intere, le dissociazioni chimiche o meccaniche e le sezioni spesse en face interrompono l'integrità dei tessuti, perdono il contesto spaziale critico o, più spesso, sono semplicemente incompatibili con le piattaforme di sequenziamento spaziale ad alta dimensione.

Questo studio introduce una tecnica di criosezione che produce sezioni sottili (<20 μm) del viso preservando le relazioni spaziali essenziali per la mappatura delle distribuzioni cellulari retiniche. Il metodo mantiene l'integrità dell'RNA e l'architettura dei tessuti, generando sezioni compatibili con le piattaforme di analisi molecolare ad alto rendimento. L'integrità dell'RNA viene mantenuta perché questa tecnica seziona il tessuto fresco congelato, che i produttori di piattaforme trascrittomiche spaziali supportano ufficialmente rispetto al tessuto postfissato. Convalidiamo questo approccio utilizzando diversi metodi di profilazione molecolare, dimostrando un'integrazione di successo sia con l'ibridazione manuale in situ dell'RNAscope (12 target) che con il sequenziamento spaziale dello Xenium (300 target). La tecnica preserva costantemente l'architettura dei tessuti tra i campioni, mantenendo al contempo la qualità dell'RNA adatta a queste applicazioni molecolari sensibili.

Questo progresso metodologico consente nuove indagini sulle distribuzioni dei tipi di cellule retiniche, sui gradienti molecolari tra le lamine e sugli aspetti spaziali della patologia retinica. La versatilità della tecnica e la compatibilità con le moderne piattaforme di biologia spaziale forniscono una base per una mappatura molecolare completa della complessa organizzazione cellulare della retina.

Introduzione

I neuroni retinici hanno sviluppato topografie spaziali che facilitano l'elaborazione delle informazioni, che in molte specie si traduce in specializzazioni grossolane come fovee, area centrale e striature ^1,2,3. In contrasto con la ben nota diversità della distribuzione dei fotorecettori, la specializzazione spaziale dell'output retinico, formato dalle cellule gangliari retiniche (RGC), è meno chiara. Per la maggior parte delle specie, le distribuzioni spaziali delle RGC sono del tutto sconosciute. Anche per il topo, probabilmente uno se non il modello di vertebrato più studiato della funzione visiva, meno di un terzo dei sottotipi di RGC è stato mappato con tecniche tradizionali come l'immunoistochimica^a montatura intera 2. Queste tecniche falliscono perché la maggior parte dei sottotipi di RGC non ha un marcatore genetico specifico. Invece, sono necessarie informazioni molecolari di dimensioni più elevate per un'accurata classificazione RGC⁴ tramite sequenziamento dell'RNA a singola cellula ^5,6,7.

Le informazioni sulla distribuzione delle RGC sono importanti, poiché le topografie osservate nel topo dimostrano chiari correlati ecologici tra il posizionamento delle RGC e la funzione visiva. L'esempio più eclatante è l'organizzazione spaziale delle RGC ɑON-S, che si raggruppano nella retina temporale. Questa regione riceve l'immagine della preda⁸ durante i comportamenti di caccia⁹. È anche ben noto che i sottotipi di RGC sono differenzialmente suscettibili alla malattia¹⁰ e che alcune malattie comuni come il glaucoma hanno una componente spaziale nella loro progressione^11,12. Pertanto, una domanda importante che il campo deve affrontare è: qual è l'organizzazione spaziale dei sottotipi RGC mentre piastrellano la retina¹? Questa lacuna nella conoscenza sta attualmente limitando le intuizioni su altri comportamenti e malattie guidate visivamente.

L'obiettivo del presente metodo è quello di colmare queste lacune di conoscenze molecolari attraverso un approccio di criosezione en face che preserva le relazioni spaziali consentendo al contempo l'analisi molecolare ad alta risoluzione. Le moderne piattaforme di sequenziamento spaziale come Xenium di 10X rappresentano un progresso trasformativo nella profilazione molecolare, offrendo intuizioni senza precedenti sull'organizzazione dei tessuti e sulle interazioni cellulari. Tuttavia, queste piattaforme, insieme a tecniche a plesso inferiore come l'RNAscope e ai metodi di sequenziamento con codice a barre spaziale come Visium, condividono un vincolo tecnico critico: richiedono sezioni di tessuto più sottili di 20 μm. Questo requisito rappresenta una sfida particolare per il tessuto retinico, che in genere misura 200 μm di spessore.

Ad oggi, i ricercatori si sono basati principalmente su sezioni trasversali quando hanno applicato queste tecnologie al tessuto retinico¹³. Mentre le sezioni d'urto rivelano efficacemente le relazioni molecolari all'interno degli strati nucleari e plessiformi nel contesto dei circuiti verticali, sono meno adatte a catturare le più ampie distribuzioni spaziali delle cellule retiniche che le preparazioni di intere montature hanno tradizionalmente rivelato⁸. I recenti tentativi di sezionamento en face sono stati limitati dai vincoli di spessore della sezione, con studi che hanno raggiunto sezioni di soli 50 μm^{di spessore 14} troppo alto per le moderne piattaforme di analisi molecolare ad alto plex. Altri approcci storici che sono stati utilizzati per studiare la lamina retinica individuale, ma che non sono compatibili con le moderne tecniche di sequenziamento spaziale, includono la digestione enzimatica, combinata con la dissociazione meccanica^15,16, o le sole dissociazioni meccaniche 17,18,19,20. Qui presentiamo una nuova tecnica di criosezione specificamente progettata per il tessuto retinico sottile e curvo che supera queste limitazioni. In breve, il nostro metodo prevede l'estrazione della camera posteriore dell'occhio, la creazione di tagli in rilievo sia attraverso la retina che la sclera, l'appiattimento del tessuto con la retina interna contro un vetrino, l'inclusione del tessuto nell'OCT e, infine, la criosezione dalla retina esterna a quella interna (Figura 1). Il nostro metodo mantiene le relazioni spaziali producendo sezioni sufficientemente sottili (<20 μm) per strumenti di biologia spaziale ad alta dimensione, come convalidato attraverso l'implementazione di successo sia con RNAscope manuale (12 target) che con la piattaforma automatizzata Xenium (300 target), dimostrando la compatibilità tra diverse scale di complessità dell'analisi molecolare.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità e con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e delle linee guida istituzionali pertinenti che approvano questi metodi supervisionati dall'Università del Colorado. Tutte le fasi relative all'uso degli animali e all'eutanasia devono seguire le normative locali e i permessi sperimentali. Tutti i topi sono stati ospitati con cure standard in una struttura veterinaria accreditata con accesso gratuito a cibo e acqua. Questa tecnica di criosezione en face si basa su tecniche standard di dissezione retinica ottimizzate per i topi C57BL/6. Per sviluppare questa tecnica sono stati utilizzati circa 150 topi di entrambi i sessi di età compresa tra 6 settimane e 2 anni. L'ultima tecnica qui comunicata ha un tasso di successo di circa il 95% indipendentemente dalle caratteristiche demografiche del topo. Si noti che se una temperatura non è elencata per un passaggio, è prevista una temperatura ambiente di circa 20-25 °C. Le soluzioni senza temperatura elencata funzioneranno se refrigerate e quindi l'intervallo di temperatura di lavoro per le soluzioni è 4-25 °C.

1. Dissezione

1. Anestetizzare il topo con isoflurano e convalidare l'anestesia con il pizzicamento delle dita dei piedi, oppure seguire le norme e i regolamenti locali per indurre e confermare l'anestesia poiché altri metodi sono ugualmente appropriati.
2. Sopprimere il topo per lussazione cervicale: fissare la testa del topo con una mano e la base della coda con l'altra, quindi tirare in direzioni opposte. Eseguire l'eutanasia secondaria per decapitazione.
3. Marchiare il polo temporale del globo sulla cornea per mantenere l'orientamento e creare un punto debole per la dissezione (Figura 2B e Figura 3A).
4. Immergere il globo in una soluzione di Ames in un piatto contenente un pezzo di carta da filtro (più grande del globo ma più piccolo del piatto).
   NOTA: L'uso di soluzioni diverse da Ames provocherà il deterioramento della retina (Figura 4A).
5. Utilizzando una pinza affilata #5 e forbici dell'iride, rimuovere con cura tutta la muscolatura, la fascia, la vascolarizzazione e i nervi dal globo (Figura 2E, F e Figura 3B) senza perforare la sclera (Figura 2D).
   NOTA: La perforazione della sclera durante questa fase (Figura 4B) provocherà un'ernia tissutale (Figura 4C).
6. Posizionare la punta di una lama della forbice dell'iride perpendicolarmente alla marca corneale, con le forbici parallele alla testa del nervo ottico. Forare il globo in questa posizione (Figura 3C, D).
7. Praticare un'unica incisione pulita attraverso la cornea e il limbus, proseguendo nella sclera e nella retina verso la testa del nervo ottico (Figura 3E).
   NOTA: Non tagliare la testa del nervo ottico o la sclera e la retina si separeranno. La lunghezza esatta di questa incisione varierà a seconda delle dimensioni del globo, che può variare notevolmente tra animali vecchi e giovani, così come in alcune linee Cre relative agli animali di tipo selvatico. Si consiglia di lasciare circa 1 mm di tessuto tra l'estensione più profonda di questa incisione e la testa del nervo ottico.
8. Posizionare la lama perpendicolarmente al taglio iniziale (Figura 3F,G), circa 1 mm posteriormente al limbus (Figura 2C). Inizia a tagliare radialmente attraverso la sclera e la retina.
   1. Mantenere una linea di taglio coerente posteriore e parallela al limbus utilizzando una pinza affilata per guidare e ruotare il globo. Sebbene la riduzione al minimo dei tagli sia l'ideale, è consigliabile mantenere un percorso radiale pulito. Se la retina e la sclera si separano, riposiziona la lama della forbice dell'iride per tagliarle insieme.
      NOTA: Il taglio del limbus può causare la separazione della retina dalla sclera durante l'estrazione della lente. Sono accettabili piccoli tagli e rotazioni. Evitare di applicare forza per fissarlo, poiché ciò rischia l'ernia retinica.
   2. Stimare la distanza posteriore di 1 mm utilizzando la larghezza media della lama della forbice dell'iride. Quando non si è sicuri, si opta per una posizione più posteriore, poiché la connessione della retina con il limbus si curva internamente. Un taglio più posteriore facilita l'estrazione della retina piatta.
9. Dopo aver completato il taglio radiale parallelo al limbus, ispezionare le connessioni retiniche rimanenti. Tagliali con cura con le forbici dell'iride fino a quando le sezioni del globo anteriore e posteriore non sono separate.
10. Utilizzando due paia di pinze affilate #5, separare delicatamente le parti anteriore e posteriore del globo (Figura 3H). Nei topi più anziani, le fibre trasparenti possono collegare la lente alla coppa retinica; Tagliali accuratamente con le forbici dell'iride riducendo al minimo la separazione retinico-sclerale.
    NOTA: La lente deve rimanere attaccata al limbus e alla cornea.
11. Usando la carta da filtro come piattaforma di supporto, taglia la retina in un modello a foglia di trifoglio (noto anche come croce di ferro) con le forbici dell'iride (Figura 3I-K).
    NOTA: Le incisioni delle foglie di trifoglio devono essere più corte dell'incisione di orientamento primaria inizialmente praticata attraverso il limbus se si desidera registrare l'orientamento con questa fetta. Si consiglia di ridurre le dimensioni di queste tre nuove incisioni radiali in modo che siano circa 1-2 mm più corte dell'incisione primaria. Se per l'orientamento verrà utilizzata una caratteristica diversa, come il gradiente di opsina, è opportuno che tutte le incisioni abbiano la stessa lunghezza, pur mantenendo sempre circa 1 mm di tessuto tra la parte più profonda dell'incisione e la testa del nervo ottico per evitare la separazione della retina e della sclera.
12. Ripetere la dissezione con il secondo occhio. Per ridurre al minimo la necrosi, completare la rimozione della camera anteriore del secondo occhio entro 10 minuti dall'eutanasia.

2. Crioconservazione

1. Preparare una pipetta di plastica monouso per il trasferimento tagliando la punta per creare un'apertura più grande della retina sezionata e della sclera (di seguito denominata retina).
2. Aspirare delicatamente la retina nella pipetta e depositarla su un vetrino da microscopio. Usando una salvietta da laboratorio, rimuovere con cura la soluzione di Ames in eccesso intorno alla retina fino a quando non può più galleggiare liberamente e può essere appiattita.
3. Usando due pinze affilate #5, apri la retina e posizionala in piano con l'oculare interno rivolto verso l'alto. A seconda delle dimensioni del tessuto, praticare tagli in rilievo di 0,5-2 mm in ciascun segmento del quadrifoglio per appiattire ulteriormente la retina, regolando attentamente il tessuto per evitare il ripiegamento (Figura 5A). Rimuovere l'ulteriore soluzione di Ames fino a quando il liquido rimane solo adiacente alla retina.
4. Utilizzando un vetrino coprioggetti, premere e trasferire rapidamente la retina (Figura 5B) con il liquido circostante in modo che la sclera esterna sia rivolta verso l'alto e la conchiglia oculare interna entri in contatto con il vetrino coprioggetti, ovvero le cellule gangliari retiniche siano rivolte verso l'alto (Figura 5C).
5. Verificare che la retina non sia piegata e apportare le regolazioni necessarie; aggiungere la soluzione di Ames per una più facile manipolazione. Poiché il liquido in eccesso causerà l'arricciamento del tessuto, utilizzare una salvietta da laboratorio per rimuovere tutta la soluzione di Ames in eccesso e lasciare asciugare la retina all'aria per 5-10 s.
   NOTA: La mancata autorizzazione di una breve asciugatura all'aria può causare in modo casuale la separazione tessuto-OCT durante la criosezione. Un'eccessiva essiccazione all'aria può causare danni ai tessuti legati ai cristalli di sale.
6. Applicare il terreno OCT per coprire la retina e utilizzare una pinza per distribuire uniformemente questo strato sul vetrino, prevenendo la flottazione retinica. Attendere 30 s affinché il terreno OCT penetri nella retina.
7. Congelare la retina in OCT (Figura 5D) utilizzando una piastra metallica raffreddata indirettamente con vapore di azoto liquido o portandola a diretto contatto con ghiaccio secco.
8. Conservare le retine su ghiaccio secco se le si utilizza immediatamente o in un congelatore a -80 °C in un sacchetto di plastica o in un contenitore contenente essiccanti se lo si conserva a lungo termine.

3. Criosezione

1. Impostare la camera del criostato a -18 °C e il tavolino a -12 °C. Posizionare la retina nella camera per equilibrarla alla temperatura.
2. Create una cupola OCT sul mandrino del campione. Se si utilizza lo stesso modello di criostato, assicurarsi che questa cupola occupi i 2-3 anelli interni. Una volta congelata, rifilare la cupola OCT per creare una superficie di tavolino piatta parallela alla lama sul mandrino per mantenere la planarità laminare (Figura 6A).
3. Creare o annotare la guida di orientamento che collega il mandrino allo stadio del criostato.
   NOTA: Sul modello criostato che consigliamo, la guida di orientamento è una linea centrale incisa nella posizione a ore 12 sopra il supporto del mandrino, mentre il mandrino stesso ha un taglio triangolare sull'anello più esterno. Insieme, ci riferiamo a queste funzioni come guida all'orientamento. Se il tuo criostato non ha tali caratteristiche, ti consigliamo di utilizzare un pennarello indelebile per crearne uno tuo.
4. Preparare la retina per il trasferimento utilizzando una lama di rasoio rimuovendo l'OCT in eccesso che circonda la retina lateralmente e poi, separando accuratamente la retina dal vetrino coprioggetti per renderlo mobile.
5. Rimuovere il mandrino dal tavolino e applicare una piccola goccia di OCT liquido sulla superficie piatta del tavolino OCT preparata.
6. Posizionare la retina direttamente sull'OCT liquido. Utilizzando un vetrino preraffreddato (-18 °C), premere e tenere premuta la retina contro il tavolino OCT per 10-30 s fino a quando non si congela.
7. Applicare ulteriore OCT sulla retina e sul tavolino per garantire un legame completo. Congelare l'area di congelamento rapido del criostato. Incubare lo stadio retina/OCT nel criostato per almeno 30 minuti per garantire un legame completo.
8. Inizia il sezionamento:
   1. Tagliare con cura l'OCT in eccesso fino a quando la retina non diventa visibile (Figura 6B). Usa la lama del rasoio per rimuovere l'OCT in eccesso dai bordi dei blocchi.
      NOTA: Ritrarre sempre il tavolino prima di riprendere il sezionamento dopo qualsiasi rifilatura manuale radiale. Per la rifilatura delle fette in faccia, si consiglia di utilizzare lo stesso spessore di taglio che verrà utilizzato per le sezioni desiderate; Tuttavia, lo spessore di rifilatura può essere compreso tra 10 μm e 100 μm in base alle preferenze dell'utente.
   2. Continua a tagliare mentre controlli le sezioni per la presenza di sclera. Quando la sclera è visibile, regolare l'angolazione del tavolino secondo necessità. Continua a tagliare fino a quando le sezioni non mostrano una distribuzione uniforme della sclera, che garantisce una planarità ottimale e la massima area del quadrifoglio in ogni sezione.
   3. Raccogliere sezioni di tessuto (Figura 6C).
      NOTA: Lo spessore ottimale dipenderà dal test finale eseguito e deve aderire a questo protocollo a valle. Ad esempio, se si utilizza lo xinio 10X, si consigliano sezioni spesse 20 μm. Mentre per 10X Visium, sono più appropriate sezioni di 15 μm di spessore.
   4. Usa diapositive preraffreddate e manipola le sezioni in posizione usando due pennelli.
   5. Posizionare un dito sotto la sezione fino a quando l'OCT non si scioglie e il tessuto aderisce (circa 5 s).
   6. Riposizionare il vetrino su una superficie fredda per il ricongelamento dei tessuti.
      NOTA: Quando si raccolgono sezioni in piccole aree (ad esempio, per lo Xenium), potrebbero essere necessari più cicli di congelamento-scongelamento. Sebbene ciò non influisca sulle tecniche basate su sonda, può influire sulla qualità dell'RNA per approcci di sequenziamento imparziali.
9. Conservare i vetrini su ghiaccio secco per un uso immediato, a -20 °C per RNAscope il giorno successivo e a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

4. Rilevamento del bersaglio e microscopia

NOTA: Sebbene la tecnica sia compatibile con altri metodi di profilazione molecolare, dettagliamo RNAscope come esempio convalidato.

1. Preparazione del campione:
   1. Togliere i vetrini dalla conservazione a -80 °C e riscaldarli a -20 °C per 1 ora.
      NOTA: I vetrini possono essere conservati a -20 °C per un massimo di 12 ore prima di iniziare il resto di questa procedura, ma non devono essere lasciati a -20 °C troppo a lungo per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA.
2. Riscaldare rapidamente i vetrini a 37 °C per 10 s.
3. Fissare il fazzoletto immergendo i vetrini in PFA fresco al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Lavare accuratamente i vetrini con 1x PBS.
5. Disidratazione tissutale attraverso serie di etanolo: etanolo al 50% per 5 minuti, etanolo al 70% per 5 minuti, etanolo al 100% per 5 minuti, etanolo fresco al 100% per 5 minuti.
   NOTA: Questa è una fase critica del controllo di qualità per il montaggio dei tessuti. Se il distacco del tessuto si verifica durante la disidratazione, indica la sovrapposizione dell'OCT dalle sezioni adiacenti durante il montaggio. Un'attenta rifilatura dell'OCT in eccesso durante il sezionamento e il montaggio previene questo problema.
6. Preparazione della barriera:
   1. Asciugare all'aria i vetrini sul piano di lavoro per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Utilizzando una penna barriera idrofobica, disegnare una barriera attorno a ciascuna sezione di tessuto. Lasciare asciugare completamente la barriera per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Rilevamento molecolare:
   1. Applicare il trattamento Protease IV per la permeabilizzazione dei tessuti.
   2. Procedere con il protocollo del produttore per l'ibridazione della sonda target (2 h a 40 °C), le fasi di amplificazione del segnale (tre amplificatori sequenziali), il rilevamento del fluoroforo (quattro cicli sequenziali per la colorazione a tre plex).
8. Imaging:
   1. Eseguire la controcolorazione nucleare DAPI prima di ogni montaggio del vetro di copertura.
   2. Montare il vetro di copertura utilizzando un mezzo di montaggio antisbiadimento.
   3. Immagine mediante microscopia a fluorescenza con set di filtri appropriati.
   4. Per il rilevamento multiplex, acquisire lo stesso campo in tutti e quattro i cicli di rilevamento per la registrazione computazionale.
   5. Mantieni impostazioni di esposizione coerenti tra i round per un confronto accurato del segnale.
      NOTA: Per i dettagli completi sull'implementazione di RNAscope, fare riferimento ai protocolli del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Per le piattaforme completamente automatizzate come Xenium, seguire tutti i passaggi del protocollo del produttore esattamente come fornito. Per tutti i protocolli, prevedere che il fallimento dovuto al distacco del tessuto si verificherà molto probabilmente durante una fase iniziale di disidratazione o lavaggio, a causa della sovrapposizione dell'OCT, come indicato in questo protocollo esemplare.

Risultati

L'implementazione di successo di questo protocollo produce sezioni retiniche intatte en face adatte a molteplici approcci di profilazione molecolare, mantenendo le relazioni spaziali attraverso la superficie retinica. Dimostriamo l'utilità del protocollo attraverso un approccio di convalida sistematico, che passa dall'immunoistochimica convenzionale attraverso la rilevazione manuale dell'RNA multiplex fino alla profilazione molecolare automatizzata ad alto rendimento.

La validazione i...

Discussione

Il metodo qui presentato affronta una barriera tecnica critica nella biologia spaziale retinica consentendo la produzione di sezioni sottili en face adatte alle moderne tecnologie di profilazione molecolare. Le fasi più critiche del protocollo sono incentrate sulla manipolazione dei tessuti durante la dissezione iniziale e sul controllo preciso della temperatura e dell'idratazione durante la crioconservazione e il sezionamento. Il successo dell'implementazione si basa in partico...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ames&primo; Medium	Sigma-Aldrich	A1420-10X1L	Marca specifica non importante
Beadsmith Thread Zap, Thread Burner	The Beadsmith Store	7.90524E+11	È possibile utilizzare cauterizzatori alternativi
Criostato	Leica	cm1950	Considerazioni importanti è il volume controllabile separatamente rispetto alla temperatura del tavolino.
Ghiaccio secco	NA	NA	NA
Fine Science Tools Dumont #5 Forcipe	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	Marca specifica non importante
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Marca specifica non importante
Fisherbrand Pinzette/pinze a punta fine dritte sottili ad alta precisione	Fisher Scientific	12-000-127	Marca specifica non importante
Fisherbrand Forbici da dissezione standard	Fisher Scientific	08-951-20	Marca specifica non importante
Fisherbrand Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	22-037-246	Marca specifica non importante
Integra Miltex Noyes Forbici per iride	Integra Miltex 181510	12-460-278	Marca specifica non importante
Microscopio a epifluorescenza a disco rotante Olympus IX81	per Figura 7
	Scientific	12-567-400	Marca specifica non importante
World Precision Instrument Microscopio trinoculare con zoom stereo di precisione (IV) su supporto	a braccio World Precision Instrument PZMTIVBS	50-253-8607	Marca specifica non importante
Microscopio a epifluorescenza Zeiss Axio Imager.M2			Sezionamento ottico abilitato (per la Figura 8)