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Articolo metodologico

Spatola Montevideo Dispositivo per la vitrificazione di embrioni di mammiferi

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DOI:

10.3791/68176

⸱

6 giugno 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory Animal Biotechnology Unit, Institut Pasteur de Montevideo, 2Centro de Esterilidad Montevideo, 3Fundación IRAUy, Instituto de Reproducción Animal de Uruguay

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo il protocollo Spatola Montevideo per la vitrificazione di embrioni preimpianto di topi e pecore, che consiste in una spatola fatta in casa e utilizza soluzioni fatte in casa. Gli embrioni vengono rapidamente equilibrati in due soluzioni crioprotettive a concentrazione crescente, caricati sulla spatola, immersi in azoto liquido e infine sigillati con una cannuccia da 0,5 mL.

Abstract

Questo studio descrive un metodo di vitrificazione efficiente ed economico per la crioconservazione di embrioni di topi e pecore noto come Spatola Montevideo (MVD). Questo protocollo utilizza una spatola fatta in casa come dispositivo di trasporto, che viene preparata con una punta di caricamento del gel. Gli embrioni vengono rapidamente equilibrati in due soluzioni crioprotettive fatte in casa a concentrazione crescente, caricate nella spatola e quindi immerse direttamente nell'azoto liquido. Circa 30-40 embrioni di topo in fase preimpianto possono essere caricati sulla spatola, che viene successivamente sigillata con una cannuccia da 0,5 ml. L'uso di spatole al posto dei criotubi, che vengono spesso utilizzati per conservare gli embrioni vitrificati, ottimizza lo spazio nei dewar di azoto liquido. Inoltre, il processo di riscaldamento richiede solo una soluzione di saccarosio fatta in casa a concentrazione decrescente per reidratare gli embrioni e ripristinare la loro morfologia. Il nostro laboratorio utilizza con successo la Spatola Montevideo per embrioni preimpianto di topi e pecore da oltre 10 anni. La Spatola Montevideo ha dimostrato un tasso medio di recupero (embrioni recuperati/vitrificati) dell'84% e un tasso di sopravvivenza (embrioni vitali/recuperati) del 97% negli embrioni di topo. La vitrificazione di embrioni murini ha prodotto risultati migliori rispetto al congelamento lento, sebbene non siano state osservate differenze negli esiti riproduttivi (gravidanza, parto e tassi di natalità). Negli embrioni di pecora, con la Spatola Montevideo sono stati raggiunti tassi di sopravvivenza e di sviluppo embrionale simili rispetto a un dispositivo commerciale. Sebbene il tasso di gravidanza fosse più alto per il dispositivo commerciale, il tasso di sopravvivenza dell'agnello non era significativamente diverso tra i dispositivi. Il metodo di vitrificazione Spatula Montevideo è una semplice tecnica di crioconservazione che può essere utilizzata per conservare gli embrioni in eccesso, eseguire il backup di linee di topi geneticamente modificati e modelli di pecore e facilitare il loro scambio tra i ricercatori di tutto il mondo.

Introduzione

L'efficienza della generazione animale geneticamente modificata (GM) è aumentata in modo significativo grazie allo sviluppo di metodi basati sull'endonucleasi, in particolare CRISPR/Cas9. Molti laboratori in tutto il mondo producono varie linee di topi e ratti geneticamente modificati che dovrebbero essere crioconservate per prevenire la deriva genetica e mantenere l'integrità del fenotipo originale1. Inoltre, l'archiviazione elimina la necessità di un allevamento costante, che spesso si traduce in un numero eccessivo di animali. Alcuni laboratori inviano linee di topi GM come embrioni o spermatozoi crioconservati a depositi internazionali, facilitando lo scambio di questi modelli ed evitando il trasporto di animali vivi. Ciò garantisce l'accessibilità alle linee senza la generazione ripetitiva di modelli di animali GM identici2. Per questi motivi, la crioconservazione di embrioni e spermatozoi è fondamentale in qualsiasi struttura per animali geneticamente modificati. In generale, la crioconservazione degli embrioni è preferita per la conservazione delle linee GM perché gli embrioni contengono il genoma diploide completo con modifiche e possono essere facilmente recuperati tramite trasferimento embrionale.

La vitrificazione è un processo di non equilibrio caratterizzato da uno squilibrio tra l'acqua che entra nella cellula e l'acqua che forma cristalli extracellulari attorno ad essa. Questo metodo previene la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari, distinguendolo dal metodo di congelamento lento (SLF)3 (vedi Figura 1). L'alta concentrazione di crioprotettori e il contatto diretto con l'azoto liquido (LN2) consentono un raffreddamento ultrarapido (~40 °C/s), raggiungendo uno stato vitreo dei campioni in pochi secondi. Inoltre, la vitrificazione è più veloce, più facile e meno costosa del congelamento lento4. Richiede un LN2 minimo e in genere impiega apparecchiature semplici che possono essere acquistate commercialmente o fatte in casa5 (vedi Figura 1).

Inoltre, il processo di riscaldamento è generalmente veloce e replicabile. Dovrebbe essere eseguito rapidamente per evitare la tossicità del crioprotettore e per mantenere lo stato vitreo3. Quando si congelano gli embrioni, molti laboratori considerano la comodità del dispositivo portante, la sua affidabilità, robustezza, capacità di tenuta e costi.

Preferiamo il metodo di vitrificazione a spatola a volume minimo per la crioconservazione di routine di embrioni di ovini e topi, utilizzando il dispositivo Spatola Montevideo (MVD)6. Inizialmente, abbiamo impiegato il metodo di congelamento lento7 , ma siamo passati rapidamente alla vitrificazione. Per creare un dispositivo più semplice ed efficiente in termini di spazio per il dewar LN2 , abbiamo modificato la spatola fatta in casa da Tsang e Chow (2009)8, che è collegata a un criotubo, per sviluppare la spatola MVD che è sigillata con una cannuccia da 0,5 ml (vedi Tabella dei materiali). La spatola è dotata di una punta di caricamento del gel (vedi Tabella dei materiali), dove una piattaforma di circa 1 mm² è formata fondendo delicatamente la punta con una pinza fine, creando una piastra simile a un petalo per caricare gli embrioni. Questa piattaforma può ospitare fino a 40 embrioni di topo in una piccola goccia di vitrificazione. Un'asta di identificazione (vedi Tabella dei materiali) è inserita nell'estremità aperta della punta del caricatore di gel.

Lo scopo di questo metodo è quello di vitrificare gli embrioni in un metodo semplice, veloce ed economico che, inoltre, consente di risparmiare spazio nel dewar con azoto. Questo sistema è stato utilizzato con successo per molti anni, fornendo eccellenti tassi di sopravvivenza embrionale (~97%) e risultati riproduttivi, in particolare negli embrioni di topo. Poiché la spatola MVD viene preparata in laboratorio, è un metodo a basso costo rispetto ai dispositivi commerciali9. Inoltre, consente di risparmiare spazio nel dewar con azoto rispetto all'uso di criotubi 8,10.

figure-introduction-1
Figura 1: Confronto tra le due principali tecniche utilizzate per la crioconservazione degli embrioni. Questa figura è stata modificata con il permesso di Crispo et al.1. Creato nel BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Gli animali utilizzati per ottenere embrioni di topo sono stati alloggiati e gestiti secondo la legge nazionale 18.611 e le linee guida internazionali per la cura degli animali11. Il protocollo sperimentale (numero di permesso #007-18) è stato opportunamente approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Institut Pasteur de Montevideo (è stato dato il consenso scritto). I protocolli sperimentali per ovociti/embrioni di pecora sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura degli Animali Fundación IRAUy (protocollo #001-2017), conformi alle linee guida ARRIVE12 e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida internazionali per la cura degli animali11.

1. Vitrificazione (Figura 2)

  1. Spatola MVD preparazione
    1. Accorciare la punta del gel-loader (vedi Tabella dei materiali) tagliando i primi 10 mm e il cono della punta.
      NOTA: In questo modo si crea una punta più corta e diritta, facilitando la sigillatura finale con la cannuccia da 0,5 ml (vedere la Tabella dei materiali).
    2. Tenere l'estremità della punta del caricatore di gel con la pinza #5 dell'orologiaio (vedi Tabella dei materiali) a circa 1,0 cm dalla punta. Posizionare delicatamente la punta nella fiamma di un bruciatore Bunsen (vedi Tabella dei materiali) e tenere premuto per 8-10 s fino a formare una piattaforma simile a un petalo di circa 1 mm2.
    3. Togliere dal fuoco e tenere forte con la pinza per 5 s.
    4. Utilizzando uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali), verificare che la piattaforma a forma di petalo (~ 1 mm2) sia formata e che il bordo distale sia sigillato.
      NOTA: La piattaforma deve essere chiusa all'estremità distale per evitare l'infiltrazione di LN2 durante la vetrificazione. Assicurarsi che la piattaforma sia pulita e priva di fili di plastica. Se è troppo piccola o ha dei fili, tagliare la punta e ripetere la procedura.
    5. Ripetere i passaggi 1.1.1-1.1.4 per preparare il numero necessario di spatole (1 spatola = fino a 40 embrioni di topo).
    6. Sterilizzare le spatole utilizzando raggi ultravioletti (UV) o ossido di etilene e conservarle in una provetta o scatola sterile.
    7. Il giorno della vetrificazione, recuperare le spatole, maneggiandole dall'estremità opposta della piattaforma. Inserire un'asta di identificazione (vedi Tabella dei materiali) in ciascuna spatola e posizionarla sulla base dello stereomicroscopio. Etichettare l'asta con un pennarello indelebile o un'etichetta adesiva resistente all'azoto liquido.
      NOTA: Evitare sempre di toccare la piattaforma quando si maneggiano le spatole. La lunghezza totale dell'intero dispositivo (spatola + 0,5 ml di cannuccia + asta di identificazione) non deve superare 1 cm della lunghezza del calice.
  2. Preparazione di soluzioni di vitrificazione
    1. Preparare la soluzione FS: Sciogliere 1,5 g di terreno con gradiente di densità (vedere la Tabella dei Materiali) e 0,85 g di saccarosio (vedere la Tabella dei Materiali) in 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; vedere la Tabella dei Materiali). Scaldare a bagnomaria bollente fino a completa dissoluzione, quindi sterilizzare con un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
    2. Preparare la soluzione di pre-vitrificazione (PV): il giorno della vetrificazione, miscelare il 10% di glicole etilenico (vedere la Tabella dei Materiali), il 10% di dimetilsolfossido (vedere la Tabella dei Materiali) e l'80% di M2 di terreno (vedere la Tabella dei Materiali). Per 5 spatole è necessario un volume totale di 100 μl.
    3. Preparare la soluzione di vitrificazione (V): il giorno della vetrificazione, combinare il 15% di glicole etilenico, il 15% di dimetilsolfossido, il 10% di terreno M2 e la soluzione di FS al 60%. Per 5 spatole è necessario un volume totale di 100 μl.
  3. Processo di disidratazione e vitrificazione degli embrioni
    1. Preparare LN2: Versare LN2 in un contenitore adatto (ad esempio, un contenitore di polistirene isolato di 10 cm x 30 cm x 20 cm) e posizionare tante cannucce da 0,5 ml quante sono le spatole da utilizzare.
      NOTA: Per facilitare la visualizzazione della piattaforma della spatola durante la manipolazione sotto LN2, si suggerisce di utilizzare un contenitore di polistirene isolato con fondo colorato per creare un effetto di contrasto.
      ATTENZIONE: Indossare occhiali e guanti adeguati (vedere la tabella dei materiali) quando si maneggia LN2.
    2. Preparare le soluzioni: Su una piastra di Petri di plastica da 100 mm (vedi Tabella dei materiali), posizionare le seguenti gocce: 100 μl di M2, 20 μl di soluzione PV e 20 μl di soluzione V per ogni spatola.
    3. Vitrificare gli embrioni: Posizionare gli embrioni da vitrificare nella goccia M2. Maneggiare 30-40 embrioni alla volta, incubandoli nella goccia di soluzione PV per 30 s, e poi nella goccia di soluzione V per altri 30 s a temperatura ambiente (RT).
    4. Utilizzare un capillare di vetro tirato (vedi Tabella dei materiali) con un tubo aspiratore (vedi Tabella dei materiali). Precaricare il capillare con almeno 1 μL della rispettiva soluzione prima di posizionare gli embrioni.
      NOTA: Gli embrioni saranno a diverse altezze nelle gocce, quindi regola il micrometro dello stereomicroscopio per localizzarli. Recupera gli embrioni da ogni goccia quando rimangono 10 s. Tutte le manipolazioni degli embrioni devono essere condotte allo stereomicroscopio.
    5. Caricare gli embrioni: aspirare gli embrioni utilizzando una soluzione di V minima (ad es. ~ 0,1 μL) e posizionarli rapidamente sulla piattaforma della spatola.
    6. Immersione in LN2: Dopo aver caricato gli embrioni, immergere immediatamente la piattaforma della spatola in LN2 per 5 s (tenendo la spatola a mano, per l'asta). Quindi, mantenendo la spatola nei vapori di LN2 , sigillarla con una cannuccia da 0,5 ml utilizzando una pinzetta lunga in acciaio inossidabile (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Rimuovere LN2 dalla cannuccia prima di sigillare per evitare l'espansione durante il riscaldamento. Assicurati che la spatola e la cannuccia siano allineate correttamente per evitare il contatto tra la goccia dell'embrione e la parete della paglia. Per comodità, le spatole sigillate possono rimanere nel contenitore LN2 fino a quando tutte le spatole non sono caricate con embrioni, riempiendole nuovamente con LN2 se necessario.
    7. Ripetere la procedura: Ripetere i passaggi da 1.3.3 a 1.3.7 per ogni gruppo di embrioni, utilizzando un paio di gocce PV e V fresche.
    8. Stoccaggio: Trasferire le spatole nei calici (vedi Tabella dei materiali) e poi in un dewar di stoccaggio LN2 (vedi Tabella dei materiali).

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Figura 2: Schema del processo di vetrificazione utilizzando Spatola MVD. Si veda il testo per maggiori dettagli. Creato in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/x96y902. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Riscaldamento (Figura 3)

  1. Preparazione della soluzione
    1. Preparare una soluzione di saccarosio 1 M sciogliendo 0,85 g di saccarosio in 2,5 mL di terreno M2. Sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,22 μm.
      NOTA: Questa soluzione può essere preparata e conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    2. Preparare le soluzioni di saccarosio 0,5 M e 0,25 M diluendo la soluzione di saccarosio 1 M con il volume appropriato di terreno M2.
    3. Mantenere le soluzioni di saccarosio a 37 °C su una piastra calda (vedi Tabelle dei materiali) fino all'inizio del riscaldamento.
  2. Preparazione della piastra riscaldante
    1. Su una piastra di Petri di plastica da 100 mm, posizionare le seguenti gocce di soluzione: una goccia da 500 μl di saccarosio 0,5 M, una goccia da 50 μl di saccarosio 0,5 M e una goccia da 50 μl di saccarosio 0,25 M per ogni spatola da riscaldare. Mettere tre gocce di terreno M2 (100 μl ciascuna) per il lavaggio.
  3. Processo di riscaldamento
    NOTA: Il processo di riscaldamento avviene a RT, ad esempio 20-22 °C sulla base di uno stereomicroscopio.
    1. Recupera le spatole sigillate dal dewar. Metterli in un contenitore appropriato con LN2. Vedere la Figura 3.
    2. Posizionare la piastra riscaldante sullo stereomicroscopio. Uno alla volta, afferra la base della spatola con una pinzetta in acciaio inossidabile e, con una mano guantata, estrai l'asta di identificazione e poi la cannuccia. Immergi rapidamente la piattaforma contenente gli embrioni nella goccia di saccarosio 0,5 M da 500 μl.
    3. Assicurarsi che tutti gli embrioni siano caduti nella goccia; Se necessario, muovere delicatamente la spatola per favorirne il rilascio. Caricare gli embrioni in un capillare di vetro tirato, metterli nella goccia da 50 μl di soluzione di saccarosio 0,5 M e incubare per 2 minuti.
    4. Immergere gli embrioni nella goccia da 50 μl di soluzione di saccarosio 0,25 M e incubare per altri 2 minuti.
      NOTA: Prima di inserire gli embrioni in ogni soluzione, precaricare il capillare con la soluzione da utilizzare.
    5. Infine, lavare gli embrioni tre volte in diverse gocce di terreno M2 per rimuovere il saccarosio.
    6. Incubare gli embrioni in condizioni appropriate per ciascuna specie per almeno 1 ora prima dell'uso.

figure-protocol-2
Figura 3: Schema del processo di riscaldamento MVD della spatola. Si veda il testo per maggiori dettagli. Creato in BioRender. Meikle, M. (2025) https://BioRender.com/k91k191. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Inizialmente abbiamo utilizzato il tradizionale metodo di congelamento lento basato su soluzioni di glicole propilenico, cannucce e apparecchiature di congelamento a velocità controllata7. Tuttavia, dopo aver considerato il metodo di vitrificazione un'opzione potenzialmente più semplice ed economica, abbiamo condotto uno studio per confrontare i risultati del congelamento lento tradizionale (SLF) rispetto alla MVD a spatola in embrioni di topo derivati in vivo...

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Discussione

La spatola MVD è un dispositivo di vetrificazione facile da montare, a basso costo e a volume minimo, con un'elevata capacità di ritenzione dell'embrione e un'occupazione ottimale del dewar con azoto liquido. Questo metodo ha dimostrato di essere semplice, veloce e robusto. In media, abbiamo ottenuto non solo alti tassi di recupero e sopravvivenza degli embrioni vitrificati (~90%), ma anche buoni risultati riproduttivi quando si esegue il trasferimento di embrioni nei topi (~80% di tasso...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo Alejo Menchaca per il suo contributo allo sviluppo della Spatola MVD. GS ha ricevuto finanziamenti dal Programma Post-Laurea in Biotecnologie - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (Numero di sovvenzione: GS 2437 347). GS, MNM e MC hanno ricevuto finanziamenti da FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (Numero di sovvenzione: COF 03/11). GS e MC sono membri del Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay. (https://www.anii.org.uy/). I finanziatori (Biotechnology Postgraduate Program - Facultad de Ciencias -Universidad de la República; FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur; Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay) non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m filtro Sartorius16534Filtro per siringa Minisart 0,2 & micro; L
0,5 ml di cannucciaMinitubo13408/0044Paillette media di tipo francese
Assemblaggio tubo aspiratore SigmaCodice: A5177
Bruciatore Bunsen Indulab7000134
Dimetilsolfossido SigmaD2650
Glicole etilenico Sigma102466
Ficoll PM70 SigmaF2878Gradiente di densità medio
Punta per il caricamento del gelEppendorf 10411193
Capillare in vetro Marienfeld2900000Tubo capillare per microematocrito
Guanti per movimentazione LN2 Scudo temporaneoCE0338Guanti criogenici
CaliciMinitubo16913/1133
Occhiali per la movimentazione LN2   3M  40661-00000-10Rivestimento antiappannamento e antigraffio
Piastra riscaldanteLabecLA-SH-II-5BModello digitale
Asta di identificazione Tecnologie IMV6326Non steril LG48 mm
Contenitore isolato in polistirolo
Dewar di stoccaggio LN2Taylor-WhartonXT21-AICrioscienza
Pinzette lunghe in acciaio inoxStrumenti per la scienza11000-25
M2 SigmaCodice: M7167
PBS CasareccioSoluzione salina tamponata con fosfato. Di solito viene preparato 1 litro di tampone concentrato 5x e poi diluito a 1x. Ricetta: 40 g di cloruro di sodio, 1 g di cloruro di potassio, 7,2 g di fosfato disodico anidro, 1,2 g di fosfato monopotassico. Aggiungere acqua distillata e sterilizzare in autoclave.
Piastra di Petri in plastica Falcone    351029Piastra di Petri batteriologica non trattata con TC
Stereomicroscopio OlimpoSZ2-LGB
Saccarosio SigmaS1888
Orologiaio' S #5 Pincipe Strumenti per la scienza11254-20

Riferimenti

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