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Articolo metodologico

Frequenza e distribuzione dei crossover nella meiosi di Caenorhabditis elegans mediante genotipizzazione SNP mediante PCR in tempo reale

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DOI:

10.3791/68183

⸱

11 luglio 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo per misurare le frequenze di crossover e la distribuzione durante la meiosi in Caenorhabditis elegans. La genotipizzazione del polimorfismo a singolo nucleotide con PCR in tempo reale è stata utilizzata per determinare l'origine dei cromosomi. La mappatura a 4 punti ha permesso di determinare le distribuzioni crossover delle regioni del braccio sinistro, centrale e destro di ciascun cromosoma.

Abstract

Caenorhabditis elegans è un eccellente organismo modello per lo studio della meiosi. Oltre ai vantaggi generali, come un ciclo riproduttivo breve, molte progenie e un corpo trasparente per l'imaging, ci sono sei coppie di cromosomi olocentrici omologhi. C'è una forte interferenza crossover e una regolazione della distribuzione crossover. Per misurare la frequenza di crossover, sono stati sviluppati la mappatura dei marcatori visibili, la mappatura snip-SNP e la quantificazione dei marcatori citologici come precursori della formazione di crossover. Qui, introduciamo un metodo di genotipizzazione SNP modificato per misurare la frequenza e la distribuzione del crossover nell'ovogenesi di C. elegans . Questo metodo può omettere le laboriose fasi della digestione di restrizione e dell'elettroforesi su gel ed evitare il giudizio ambiguo delle bande di DNA non tagliate. La genotipizzazione del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) viene eseguita utilizzando il ceppo ibrido Bristol/Hawaiian. L'incrocio di ermafroditi con maschi che esprimono myo-3p::GFP ci permette di concentrarci sull'ovogenesi. Un singolo lisato di verme produce una quantità sufficiente di DNA per tutti e sei i cromosomi. Le sonde TaqMan per la chimica TaqMan a base di esonucleasi 5' e le sonde MGB (Minor Groove Binder) specifiche per SNP consentono la rilevazione precisa di SNP con un tasso di genotipizzazione di circa il 97,7%. Utilizziamo il rilevamento accurato degli SNP per misurare la frequenza di crossover in C. elegans. Questo metodo può essere applicato anche per determinare la frequenza di crossover nei mutanti maschi o con difetti di crossover, nonché per intervalli cromosomici più specifici.

Introduzione

La formazione di crossover tra cromosomi omologhi è essenziale per la corretta segregazione dei cromosomi e anche per la generazione della diversità genetica1. Gli errori nella formazione del crossover causano aneuploidia, che può portare a infertilità, aborto spontaneo e difetti alla nascita2. La frequenza di crossover varia in base alla regione cromosomica, al tipo di mutante, all'età e al sesso, sottolineando la necessità di misurare accuratamente la frequenza di crossover in ciascuna di queste condizioni 3,4,5. L'obiettivo generale di questo metodo è misurare con precisione la frequenza di crossover di ciascun dominio cromosomico e quindi determinare con precisione la distribuzione dei crossover sull'intera lunghezza del cromosoma C. elegans.

Tradizionalmente, la mappatura a due punti utilizzando marcatori morfologici è stata utilizzata per misurare la frequenza di crossover 6,7,8,9,10. In C. elegans, i fenotipi tozza, corto, corpo grasso (Dpy) e movimento non coordinato (Unc) sono spesso utilizzati per creare mappe cromosomiche6. I vantaggi di questo metodo sono il suo basso costo e la capacità di analizzare molte progenie. Gli svantaggi di questi metodi includono la limitazione della scelta dei loci di interesse e l'impossibilità di utilizzare progenie letali perché i loro fenotipi non sono visibili. Al fine di ovviare all'inconveniente della scelta del sito, i trasposoni Tc1 sono stati utilizzati come marcatori per siti polimorfici marcati con sequenze (STS)11,12. I Tc1 possono essere rilevati utilizzando la PCR e l'elettroforesi. Mentre il ceppo standard di Bristol N2 aveva 30 copie del trasposone Tc1, gli isolati di C. elegans di Bergerac in Francia (RW7000 e DP13) avevano 500 copie di Tc1. Pertanto, il numero e la distribuzione dei trasposoni Tc1 variano tra gli isolati e questo viene utilizzato per analizzare i cromosomi della progenie di vermi ibridi tra gli isolati mediante PCR. Successivamente, gli SNP sono stati utilizzati anche per misurare la frequenza e la distribuzione del crossover13,14. L'SNP tra i ceppi Bristol N2 e Hawaiian CB4856 è apparso ogni 1.000 bp15,16. Gli SNP vengono rilevati come polimorfismi di lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) utilizzando la PCR, la digestione di restrizione e l'elettroforesi. Recentemente, piccoli siti di inserimento/delezione (InDel) e SNP tra Bristol N2 e Hawaiian CB4856 sono stati proposti come marcatori più efficienti17. Tuttavia, la misurazione della frequenza di crossover utilizzando Tc1, RFLP e InDel richiede processi ad alta intensità di lavoro come la PCR, il trattamento con enzimi di restrizione e l'elettroforesi. Se ogni processo non è ottimizzato in un'analisi su larga scala, i risultati possono essere interpretati in modo errato a causa di fattori quali l'accuratezza della PCR, il tipo di enzima di restrizione utilizzato, l'efficienza della scissione del DNA e la chiarezza e la separazione delle bande durante l'elettroforesi. Al contrario, il metodo proposto utilizza la genotipizzazione degli SNP mediante PCR in tempo reale per facilitare una quantificazione accurata e precisa.

I crossover non sono distribuiti casualmente lungo i cromosomi. In C. elegans, i singoli incroci tendono a formarsi più frequentemente nelle braccia e sono soppressi al centro 3,5. La mappatura morfologica a due punti non è in grado di identificare dove si verificano i crossover al di fuori dei geni marcatori. Al contrario, la mappatura SNP consente un aumento dei marcatori ed è stato dimostrato che facilita la determinazione della regione esatta di un crossover lungo l'intero cromosoma 5,14,18. In questo studio, abbiamo utilizzato i confini del dominio cromosomico proposti da Rockman e Kruyglyak5 e selezionato quattro SNP per l'analisi: ad entrambe le estremità del cromosoma e ad entrambe le estremità dei confini centro/braccio.

Sfruttando i metodi precedenti, abbiamo proposto un metodo di rilevamento SNP accurato e rapido mediante PCR in tempo reale utilizzando TaqMan, 5' nucleasi19 per misurare il crossover tra il braccio sinistro, il centro e il braccio destro di ciascun cromosoma. I vantaggi del nostro metodo rispetto alle tecnologie alternative, rispetto agli studi precedenti 20,21,22, sono l'accuratezza e la semplicità. Questo metodo è un metodo di analisi crossover applicato alla qPCR per C. elegans ed è ampiamente adatto per i ricercatori che studiano la meiosi.

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Protocollo

1. Primo incrocio genetico

  1. Preparare piastre di accoppiamento che comprendano normali piastre NGM (Nematode Growth Medium) con un piccolo punto OP50 (~5 mm di diametro) nella piastra da 35 mm.
  2. Aggiungere tre ermafroditi L4 del ceppo Bristol N2 (o mutanti con un background Bristol) e nove giovani maschi adulti del ceppo hawaiano CB4856 su una placca di accoppiamento (Figura 1A).
    NOTA: Per analizzare mutanti con elevata letalità embrionale, è necessario utilizzare mutanti bilanciati con background sia Bristol che hawaiano in questo incrocio. Per ottenere mutanti con un background hawaiano, i mutanti di Bristol devono essere incrociati con il ceppo hawaiano almeno sei volte fino a quando tutti i siti SNP di interesse hanno un background hawaiano. Di conseguenza, il mutante hawaiano contiene il background di Bristol solo nella regione mutata e nel cromosoma bilanciatore.
  3. Incubare la piastra per 1,5 giorni a 20 °C per accoppiare i due ceppi. Trasferire ogni ermafrodito su una nuova piastra NGM individuale con OP50.
  4. Mettere le piastre in un'incubatrice a 20 °C per 1 giorno per consentire loro di deporre le uova fecondate. Trasferire ogni ermafrodito su una nuova piastra NGM individuale con OP50.
  5. Mettere le piastre in un'incubatrice a 20 °C per 1 giorno per consentire la deposizione delle uova fecondate. Rimuovi gli ermafroditi. Conservare le piastre per 0,5 - 1 giorno in un'incubatrice a 20 °C per far crescere le progenie fino a L4.

2. Seconda croce

  1. Prelevare sei maschi incrociati di L4-ermafroditi (ibridi Bristol/Hawaii) e 12-15 maschi di Bristol (Figura 1B) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitocondriale GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) su una nuova placca di accoppiamento (Figura 1B).
    NOTA: Il ceppo inserito ccIs4251 è ottenuto dal Caenorhabditis Genetics Center e deve essere incrociato con il ceppo N2 wild-type più di sei volte.
  2. Conservare la piastra per 1,5 giorni a 20 °C in un'incubatrice per accoppiarla. Trasferire ogni ermafrodita su una nuova piastra NGM con OP50.
  3. Mettere le piastre in un'incubatrice a 20 °C per 1 giorno per consentire loro di deporre le uova fecondate. Trasferire ogni ermafrodito su una nuova piastra NGM individuale con OP50.
  4. Conservare le piastre per 1 giorno in un'incubatrice a 20 °C per consentire loro di deporre nuovamente le uova fecondate. Trasferire ogni ermafrodita parentale in una provetta PCR con 3 μL di tampone di lisi per verificare se il primo incrocio ha avuto successo.
  5. Controllare i genotipi dei genitori come un ibrido Bristol/Hawaiian mediante PCR in una regione del cromosoma V. Separare le bande mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2,5%.
    1. Nell'SNP, WBVar01973670, la lunghezza dell'amplicone PCR dal genoma di Bristol è di 220 bp e dal genoma hawaiano è di 196 bp. Se i risultati della PCR indicano che i genitori sono omozigoti di Bristol, ciò è dovuto all'autofecondazione del primo incrocio. Non utilizzare la progenie di questi vermi per ulteriori analisi.

3. Campionamento

  1. Preparare il tampone di lisi dei vermi come segue: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8.2, 2.5 mM MgCl2, 0.45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0.45% Tween 20 e 0.01% gelatina. Sterilizzare mediante filtrazione e conservare a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 3 μL di 20 mg/mL di proteinasi K (in H2O) a 1 mL di tampone di lisi e conservare in aliquote a -20 °C.
  2. Controllare l'espressione della GFP sul muscolo della parete corporea delle progenie della seconda croce con un microscopio da dissezione fluorescente prima di aggiungere i vermi alle singole provette per PCR. L'ingrandimento è 6,1-55x e la lunghezza d'onda utilizzata è 440-460 nm.
  3. Scegliere un singolo verme positivo alla GFP e aggiungerlo a ciascuna provetta PCR contenente 3 μL di tampone di lisi del verme (Figura 1C). Raccogliere un totale di 360 (90 x 4 repliche biologiche) progenie maschili adulte incrociate in ciascuna delle 360 provette PCR.
    NOTA: Per evitare di raccogliere prole autofecondata, i vermi GFP-positivi dovrebbero essere selezionati per il campionamento. Gli ermafroditi non accoppiati più giovani di L4 sono disponibili anche per l'analisi degli autosomi, ma poiché hanno un numero diverso di cromosomi X, i maschi e gli ermafroditi devono essere identificati dopo essere cresciuti a L4 e campionati durante l'analisi del cromosoma X.
  4. Mettere i campioni in un congelatore a -80 °C per 5 minuti. I campioni possono essere conservati a -80 °C fino all'inizio della lisi.
  5. Quando si analizzano mutanti con elevata letalità embrionale, raccogliere gli embrioni morti invece delle larve vive per ottenere risultati imparziali. Per raccogliere gli embrioni, utilizzare un puntale per pipetta con 0,5 μL di soluzione di chitinasi (20 mg/mL di chitinasi, 50 mM di NaCl, 70 mM di KCl, 2,5 mM di MgCl2, 2,5 mM di CaCl2). Raccogliere gli embrioni entro 4 ore dalla deposizione.
    NOTA: Gli embrioni morti deposti più di 4 ore fa non sono adatti per l'analisi PCR, probabilmente a causa della degradazione del DNA genomico.

4. Lisi del campione

  1. Impostare le provette per PCR nel termociclatore a 60 °C per 1 ora, quindi a 95 °C per 15 minuti. Aggiungere 100 μL di acqua priva di nucleasi a ciascuna provetta e mescolare bene.
  2. Conservare i campioni a -20 °C fino all'inizio della genotipizzazione degli SNP mediante PCR in tempo reale.

5. Genotipizzazione SNP

  1. Preparare un composto come segue (Figura 2). In una provetta da 1,5 mL, aggiungere 125 μL di Master Mix, 6 μL di SNP Genotyping Assay (40x), 280 μL di acqua distillata (DW), Primer diretto (450 nM), Primer inverso (450 nM), Sonda 1 (100 nM), Sonda 2 (100 nM).
    NOTA: Le sonde e gli inneschi sono elencati nella Tabella 1.
  2. Miscelare accuratamente pipettando più volte per garantire una concentrazione uniforme. Aggiungere 4 μl di miscela a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti sulla base di supporto con una micropipetta a 12 canali.
  3. Aggiungere 1 μL di lisato contenente ciascun DNA genomico a ciascun pozzetto e mescolare pipettando più volte.
  4. Preparare controlli positivi, cioè omozigoti di Bristol, omozigoti hawaiani e ibridi Bristol/Hawaii, e tre controlli senza stampo come controlli negativi (Figura 3A).
  5. Sigillare la piastra con una pellicola adesiva ottica. Premere la pellicola concentrandosi sui bordi di ogni pozzetto utilizzando un applicatore.
  6. Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il liquido sul fondo e rimuovere le bolle d'aria dal liquido.
  7. Caricare la piastra sullo strumento PCR in tempo reale. Fare clic sul pulsante Crea nuovo esperimento nel software.
  8. Nell'impostazione Proprietà, impostare Tipo di strumento su Sistema QuantStudio 1, Tipo di blocco su Blocco da 0,2 ml a 96 pozzetti, Tipo sperimentale su Genotipizzazione, Chimica su Reagenti TaqMan e Modalità di esecuzione su Veloce.
  9. Nell'impostazione Metodo, impostare Volume su 5 μL (assicurandosi che il volume di reazione corretto corrisponda alla configurazione), Conteggio cicli su 40 cicli (impostazione predefinita). Impostare le impostazioni di temperatura e tempo come segue: fase di pre-lettura a 25 °C per 30 s, fase di mantenimento (attivazione enzimatica, avvio a caldo) a 95 °C per 20 s, fase PCR a 95 °C per 1 s, 60 °C per 20 s e fase di post-lettura a 25 °C per 30 s.
  10. Nell'impostazione Piastra, abbinare le posizioni dei campioni e dei controlli a ciascun pozzetto sullo schermo del software.
  11. Salva l'esperimento in un dispositivo USB, caricalo nello strumento PCR in tempo reale e fai clic sul pulsante Esegui .

6. Analisi dei dati

  1. Salva i risultati su una USB e trasferiscili su un computer per l'analisi dei dati.
  2. Analizza i dati delta Rn (dRn) in tempo reale utilizzando la formula seguente, dove Rn (normalized reporter) è il segnale di fluorescenza del colorante reporter, VIC e FAM, normalizzato dividendo per il segnale di fluorescenza del colorante di riferimento passivo, ROX.
    dRn = Rn - linea di base
  3. Rivedi il grafico della discriminazione allelica.
  4. Confermare la separazione dei cluster (Figura 3B). Nel grafico di discriminazione allelica, gli omozigoti di Bristol sono raggruppati nell'angolo in basso a destra, gli ibridi di Bristol/Hawaiian sono raggruppati nell'angolo in alto a destra, gli omozigoti hawaiani sono raggruppati nell'angolo in alto a sinistra e i controlli negativi sono raggruppati nell'angolo in basso a sinistra. Utilizzare i seguenti codici colore:
    Rosso: allele di Bristol
    Blu: allele hawaiano
    Verde: Eterozigote
    Nero: Controllo negativo
  5. Esporta i risultati in un foglio di calcolo e assembla i dati di genotipizzazione da tutte e quattro le posizioni SNP. Se ci sono chiamate indeterminate in quattro posizioni consecutive, escludere i dati dal valore N. Utilizzare 90 campioni per piastra per l'analisi.
    1. Identificare i crossover come segue: Se l'SNP in posizione #1 è un ibrido Bristol/Hawaiian, e le posizioni #2-#4 sono tutti omozigoti di Bristol [B/H]-[B/B]-[B/B] o la posizione #1 è un omozigote di Bristol e la posizione #2-#4 sono tutti ibridi di Bristol/Hawaiian [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Questi risultati indicano un singolo crossover tra le posizioni #1 e #2 (da qualche parte sul braccio sinistro del cromosoma). Allo stesso modo, nel caso di [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] o [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], si verifica un singolo crossover tra #2 e #3 (da qualche parte nella regione centrale del cromosoma), e nel caso di [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] o [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Un singolo crossover si verifica tra #3 e #4 (da qualche parte sul braccio destro del cromosoma).
      NOTA: Ci sono sei modelli di doppi crossover. Sinistra e destra: [B/B]-[B/H]-[B/B] e [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], sinistra e centro: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] e [B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H], centro e destra: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] e [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].

7. Analisi statistica

  1. Inserire i valori nel software SPSS Statistics (IBM). Per il confronto della distribuzione del crossover al braccio sinistro, alla regione centrale e al braccio destro dei cromosomi, inserire 82 cromosomi con un crossover al braccio sinistro, 20 cromosomi con un crossover alla regione centrale e 68 cromosomi con un crossover al braccio destro.
  2. Eseguire la correzione ANOVA e Bonferroni e determinare la significatività statistica utilizzando un valore p a due code. Esegui tutti i confronti necessari, ad esempio braccio sinistro contro centro o WT contro mutante.

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Risultati

Abbiamo rilevato i quattro siti SNP sul cromosoma II in C. elegans mediante saggio di genotipizzazione SNP per quantificare la formazione di crossover per l'intera lunghezza del cromosoma, nel braccio sinistro, nella regione centrale e nel braccio destro. Il rilevamento degli SNP viene eseguito secondo le istruzioni del produttore. La miscela master contiene Taq DNA polimerasi, uracil-N-glicosilasi termolabile (UNG), dNTP con dUTP e colorante ROX di riferimento passivo. La Taq DNA polimerasi viene attivata a 95 ...

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Discussione

Qui, abbiamo introdotto un metodo per misurare la frequenza e la distribuzione del crossover nella meiosi di C. elegans basato sulla genotipizzazione SNP di progenie incrociate dalle specie ibride Bristol/Hawaiian. Mentre il metodo convenzionale snip-SNP (RFLP) richiede l'elettroforesi su gel dopo la PCR e il rilevamento delle bande di DNA richiede un sistema di documentazione su gel14,18, la genotipizzazione degli SNP m...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

I ceppi sono stati gentilmente forniti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Ringraziamo i membri del Laboratorio Saito per le loro utili discussioni riguardo a questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant JP23K05868 a TTS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
101-1000μ l Puntale per pipettaQSP111-N-Q
Soluzione 0,5mol/I-EDTA (pH 8,0)Nacalai tesque14347-21
Soluzione di idrossido di sodio 10mol/I-Nacalai tesque94611-45
10X DreamTaq Tampone VerdeThermo Fisher Scientific EP0713
10μ L, punta lunga, granduataFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200μ L, punta standard, graduataFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Polvere di agarNacalai tesque01028-14
AgarosioPH GiapponePH108
Autoclave TOMY modello ES-215 Sterilizzatore a vapore ad alta pressioneTOMY SEIKOES-215
Bacto peptone digesto enzimatico delle proteineThermo Fisher Scientific 211677
Acido boricoNacalai tesque05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol wild-type Centro di Genetica CaenorhabditisN2
Caenorhabditis elegans hawaiano wild-typeCentro di Genetica CaenorhabditisCB4856
Cloruro di calcioNacalai tesque06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::GFP mitocondriale + dpy-20(+)] ILaboratorio SaitoTTS24originariamente da PD4251
ColesteroloNacalai tesque08721-62
Saggi di genotipizzazione TaqMan SNP personalizzatiThermo Fisher Scientific 4332077
Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP)Biolaboratori del New EnglandN04470
DigPrint Doc Tablet DP-T130zStrumenti biologiciDP-T130z
di-Potassio IdrogenofosfatoNacalai tesque28726-05
Microscopio da dissezioneNikonSMZ-745 C-DS
Dream Taq DNA polimerasiThermo Fisher Scientific EP0713
Soluzione di bromuro di etidioNacalai tesque14631-94
Primer in avanti per WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
gelatinaNacalai tesque166-31
Gilson PIPETMAN Pipetta classicaThermo Fisher Scientific 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Solfato di magnesio eptaidratoNacalai tesque21003-75
Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmpThermo Fisher Scientific N8010560
Pellicola adesiva ottica MicroAmpThermo Fisher Scientific 4311971
MiniAmp  termociclatoreThermo Fisher Scientific MiniAmplificatore
Sistema di elettroforesi orizzontale Mini-Sub Cell GT, vassoio 7 x 10 cmLaboratori Bio-Rad1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII MULTINichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
Cloruro di potassioNacalai tesque285-38
Diidrogenofosfato di potassioNacalai tesque28720-65
proteinasi KThermo Fisher Scientific EO0491
Sistema PCR in tempo reale QuantStudio 1, 96 pozzetti, 0,2 mLThermo Fisher Scientific Codice A40426
Scala DNA Viola 1KB Plus a caricamento rapidoBiolaboratori del New EnglandN0550S
Primer inverso per WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
Cloruri di sodioNacalai tesque31319-45
TaqPath ProAmp Master MixThermo Fisher Scientific Codice A30866
Piatto TC 35, standardSARSTEDT83.3900
Tris (idrossimetil) amminometanoNacalai tesque35406-75
Base TrizmaSigma-Aldrich  T1503-1KG
Interpolazione 20Reagente Yoneyama03706
WormStuff Piccone di vermeGenesee Scientifico59-AWP
Punte per plettri a vite senza fine WormStuff (90/10% pt/ir, calibro 30)Genesee Scientifico59-30PI36

Riferimenti

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