Un sistema interattivo in tempo reale per lo studio del comportamento di inseguimento conflittuale nei roditori

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare e quantificare il comportamento di inseguimento predatorio in un modello murino. Questa piattaforma fornisce un nuovo paradigma di ricerca per studiare le dinamiche e i meccanismi neurali del comportamento di inseguimento predatorio nei topi e fornirà una piattaforma standardizzata per lo studio del comportamento di inseguimento.

Abstract

Il comportamento di inseguimento predatorio coinvolge una serie di importanti processi fisiologici, come la locomozione, l'apprendimento e il processo decisionale che sono fondamentali per il successo di un animale nella cattura della preda. Tuttavia, ci sono pochi metodi e sistemi per studiare il comportamento di inseguimento predatorio in laboratorio, specialmente nei topi, un modello di mammifero comunemente usato. I principali fattori che limitano questa ricerca sono l'incontrollabilità delle prede vive (ad esempio, i grilli) e la sfida di armonizzare gli standard sperimentali. L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare una piattaforma interattiva per rilevare e quantificare i comportamenti di inseguimento predatorio nei topi su un'esca robotica. La piattaforma utilizza la visione artificiale per monitorare le posizioni relative del mouse e dell'esca robotica in tempo reale per programmare i modelli di movimento dell'esca robotica e i cursori bidimensionali interattivi controllano magneticamente il movimento dell'esca robotica per ottenere un sistema a circuito chiuso. L'esca robotica è in grado di eludere i topi affamati in avvicinamento in tempo reale e la sua velocità e direzione di fuga possono essere regolate per imitare il processo di inseguimento predatorio in diversi contesti. Dopo un breve periodo di allenamento senza supervisione (meno di due settimane), i topi sono stati in grado di eseguire il compito di predazione con un'efficienza relativamente elevata (meno di 15 s). Registrando parametri cinematici come la velocità e le traiettorie dell'esca robotica e dei topi, siamo stati in grado di quantificare il processo di inseguimento in diverse condizioni. In conclusione, questo metodo fornisce un nuovo paradigma per lo studio del comportamento predatorio e può essere utilizzato per indagare ulteriormente le dinamiche e i meccanismi neurali del comportamento di inseguimento predatorio.

Introduzione

L'inseguimento delle prede da parte dei predatori non è solo una vivida dimostrazione della lotta per la sopravvivenza, ma anche un fattore chiave dell'evoluzione delle specie, mantenendo l'equilibrio ecologico e il flusso di energia in natura ^1,2. Per i predatori, l'attività di inseguire la preda è un'impresa sofisticata che coinvolge una varietà di processi fisiologici. Questi processi includono gli stati motivazionali che spingono il predatore a cacciare³, le capacità percettive che gli permettono di individuare e seguire la preda ^4,5,6, le capacità decisionali che dettano il corso della caccia⁷, la funzione locomotoria che abilita l'inseguimento fisico ^8,9 e i meccanismi di apprendimento che affinano le strategie di caccia nel tempo ^{10, 11}. Pertanto, la ricerca predatoria ha ricevuto molta attenzione negli ultimi anni come modello comportamentale importante e complesso.

Come modello di mammifero ampiamente utilizzato in laboratorio, è stato documentato che i topi cacciano i grilli sia nel loro habitat naturale che in studi di laboratorio¹². Tuttavia, la diversità e l'incontrollabilità delle prede vive nel quantificare il comportamento di inseguimento predatorio limita la riproducibilità degli esperimenti e lo scambio di confronti tra diversi laboratori¹³. In primo luogo, i ceppi di grillo possono essere diversi tra i laboratori, con conseguenti differenze nelle caratteristiche delle prede che potrebbero influenzare il comportamento di inseguimento. In secondo luogo, i singoli grilli hanno caratteristiche uniche che possono influenzare l'esito delle interazioni predatorie¹⁴. Ad esempio, la velocità di fuga di ogni grillo può essere diversa, portando a variabilità nelle dinamiche di inseguimento. Inoltre, alcuni grilli possono avere una breve distanza di preavviso, il che potrebbe portare a una mancanza di processo di inseguimento, poiché il predatore potrebbe non avere l'opportunità di impegnarsi nell'inseguimento. Infine, alcuni grilli possono mostrare un comportamento difensivo e aggressivo quando sono stressati, il che complica l'interpretazione dei dati sperimentali¹⁵. È difficile determinare se i cambiamenti nel comportamento del predatore siano dovuti alle strategie difensive della preda o siano inerenti ai modelli comportamentali del predatore. Questa linea sfocata tra la difesa delle prede e le strategie dei predatori aggiunge un altro livello di complessità allo studio dell'inseguimento predatorio.

Riconoscendo queste limitazioni, i ricercatori si sono rivolti alle prede artificiali come mezzo per controllare e standardizzare le condizioni sperimentali^16,17. Sette specie di roditori, tra cui i topi, hanno dimostrato di mostrare un comportamento predatorio significativo nei confronti delle prede artificiali¹³. Pertanto, un'esca robotica controllabile può essere fattibile nello studio del comportamento di inseguimento predatorio. Progettando diverse prede artificiali, i ricercatori possono esercitare un livello di controllo sulle condizioni sperimentali, che non è possibile con prede vive^18,19. Inoltre, un piccolo numero di studi precedenti ha utilizzato pesci o prede robotiche controllati artificialmente per studiare il comportamento di branco e la predazione nei pesci 15,17,19. Questi studi hanno evidenziato il valore dei sistemi robotici nel fornire stimoli coerenti, ripetibili e manipolabili per la ricerca sperimentale, ma nonostante questi progressi, il campo del comportamento dei roditori, in particolare nei topi, manca di una piattaforma dedicata per rilevare e quantificare il comportamento di inseguimento predatorio utilizzando esche robotiche.

Sulla base dei motivi di cui sopra, abbiamo progettato una piattaforma interattiva open-source in tempo reale per studiare il comportamento di inseguimento predatorio nei topi. L'esca robotica nella piattaforma può sfuggire ai topi in tempo reale e l'esca robotica è altamente controllabile, quindi possiamo impostare diverse direzioni di fuga o velocità per simulare diversi scenari di predazione. Un programma Python sul computer è stato utilizzato per generare i parametri di movimento della preda robotica, che è stato combinato con un microcontrollore STM32 per azionare i servomotori e controllare il movimento dell'esca robotica. Il sistema hardware modulare può essere adattato allo specifico ambiente di laboratorio in tempo reale e il sistema software può regolare la difficoltà del sistema e gli indicatori per servire meglio lo scopo della ricerca in base alle esigenze sperimentali. Il sistema leggero consente una significativa riduzione dei tempi di elaborazione del computer, essenziale per l'efficacia del sistema e ne migliora la portabilità. La piattaforma supporta le seguenti caratteristiche tecniche: prede artificiali flessibili e controllabili per una facile ripetizione e modellazione; massima simulazione del processo venatorio in ambiente naturale; interazione in tempo reale e bassa latenza del sistema; la scalabilità dell'hardware e del software, nonché la scalabilità; economicità e facilità d'uso. Utilizzando questa piattaforma, abbiamo addestrato con successo i topi a svolgere compiti predatori in varie condizioni e siamo stati in grado di quantificare parametri come traiettoria, velocità e distanza relativa durante l'inseguimento predatorio. La piattaforma fornisce un metodo rapido per stabilire un paradigma di inseguimento predatorio per indagare ulteriormente i meccanismi neurali alla base dell'inseguimento predatorio.

Protocollo

I topi adulti C57BL/6J (maschi, 6-8 settimane) sono forniti dall'Army Medical University Laboratory Animal Center. Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e sono approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Medicina dell'Esercito (n. AMUWEC20210251). I topi sono alloggiati in condizioni di temperatura controllata (22-25°C) con un ciclo inverso luce/buio di 12 ore (luci accese 20:00-8:00) e libero accesso a cibo e acqua.

1. Predisposizione hardware per piattaforma interattiva in tempo reale

1. Monta una webcam su una traversa sopra l'intera piattaforma per monitorare in tempo reale le posizioni del topo e dell'esca robotica nell'arena sottostante e trasmettere le immagini al computer (Figura 1A).
2. Progetta una grande arena circolare (800 mm di diametro, 300 mm di altezza) composta da un pannello acrilico quadrato nella parte inferiore e da un tubo acrilico come bordo. Posiziona quattro icone equidistanti (quadrato, triangolo, cerchio e croce) sulle pareti interne dell'arena per fungere da spunti visivi (Figura 1B).
   NOTA: La parete interna del tubo acrilico e la superficie della lastra acrilica quadrata devono essere coperte con un adesivo opaco.
3. Utilizzare un magnete rotondo al neodimio (40 mm di diametro, 10 mm di altezza, i grilli^{sono lunghi circa} 2-4 cm ^4,22) con pellet di cibo (5 × 0,2 mg) come esca robotica. Attacca un adesivo blu sulla superficie del magnete per l'identificazione e la localizzazione.
4. Montare un cursore bidimensionale (con una corsa effettiva di 1000 mm) sotto l'arena. Installa un altro magnete al neodimio sul suo supporto come magnete di trazione per tirare magneticamente e a distanza l'esca robotica.
5. Azionare il magnete dell'estrattore tramite servomotori controllati da una scheda STM32 e da un circuito di commutazione. Utilizzando la modalità velocità-direzione per pilotare un servomotore (75 mm per 16.000 impulsi), la frequenza dell'onda PWM sulla porta di uscita sulla scheda STM32 codifica la velocità e i livelli alti o bassi (3,3 V o 0 V) codificano la direzione avanti o indietro (Figura 1C).
   NOTA: Il circuito di commutazione è mostrato nella Figura 1 supplementare, che mostra solo lo schema di collegamento del segnale di velocità e direzione necessari per il movimento di una guida e il controllo dell'altra guida allo stesso modo. I fili di terra nei due circuiti di controllo a slitta possono essere collegati tra loro.

2. Progettazione software per piattaforma interattiva in tempo reale

1. Utilizzare il programma principale per rilevare la posizione relativa del mouse e dell'esca robotica e per trasmettere il segnale di movimento dell'esca robotica al microcontrollore STM32 (Figura 1D).
2. Quando il computer riceve le immagini dalla webcam, elabora i fotogrammi nell'ambiente Python.
3. Converti ogni fotogramma dal modello di colore RGB al modello di colore HSV utilizzando il modulo OpenCV²⁰ (cv2.cvtColor).
   NOTA: Poiché i topi sono bottinatrici notturne e per la stabilità dell'identificazione, gli esperimenti dovrebbero essere condotti in condizioni di illuminazione bassa e stabile, garantendo condizioni di illuminazione costanti nell'arena ed evitando ombre parziali. L'illuminazione in questo esperimento era di circa 95 lux.
4. Acquisisci immagini maschera del topo e dell'esca robotica in base alle loro gamme di colori nel modello di colore HSV, rispettivamente (cv2.inRange).
5. Applica il filtro mediano all'immagine della maschera per rendere i contorni del mouse e dell'esca robotica più chiari e stabili (cv2.medianBlur).
6. Ottenere le informazioni sul contorno del mouse e dell'esca robotica utilizzando la funzione di rilevamento del contorno (cv2.findContours) e quindi trovare un rettangolo minimo in grado di coprire l'area del contorno. Usa le coordinate centrali di questo rettangolo rispettivamente come posizione del mouse e dell'esca robotica e salvale come file TXT.
7. In base alle informazioni sulla posizione del mouse e dell'esca robotica in ogni fotogramma, calcola la velocità del mouse e la distanza relativa dall'esca robotica e salva questi parametri come file TXT.
   NOTA: Considerando il costo in termini di tempo dei calcoli relativi all'elaborazione delle immagini, la velocità di elaborazione effettiva dello script è di circa 41 fps, il che significa che il sistema è in grado di rilevare i movimenti del mouse e dell'esca robotica in circa 24 ms. Il ritardo del sistema tra l'invio di un comando di movimento e il rilevamento del movimento è di 59,4 ± 7,3 ms (n = 8), quindi il ritardo tra il movimento del mouse e il movimento della preda innescato dal mouse è di circa 83 ms (i grilli hanno un tempo di reazione inferiore a 250 ms²²).
8. A seconda della distanza relativa tra il topo e l'esca robotica e delle rispettive posizioni nell'arena, determinare la strategia di fuga dell'esca robotica 21,22,23.
   NOTA: Se il topo è relativamente lontano dall'esca robotica (>250 mm), si presume che l'esca robotica si trovi in una zona sicura. Supponiamo che il topo sia abbastanza vicino all'esca robotica (<80 mm, poiché la distanza relativa in questo metodo è determinata in base al centro del topo e all'esca robotica, abbiamo regolato questa distanza di soglia in base alla lunghezza del corpo del topo, circa 11 cm, e al diametro dell'esca, 4 cm). In tal caso, si considera una cattura riuscita e l'esca robotica si fermerà, consentendo al topo di consumare i pellet di cibo su di essa (Figura 2A). Nella strategia di fuga in linea retta, se l'esca si trova nell'area centrale dell'arena (distanza dal confine >75 mm), indicando uno spazio sufficiente in tutte le direzioni di fuga, si sposterà nella direzione in cui il topo si sta muovendo verso se stesso. Al contrario, se l'esca è vicina al muro dell'arena come indicato dall'area circostante (distanza dal confine ≤75 mm), il che significa spazio insufficiente per un movimento continuo, farà una rotazione di 90° di lato con una distanza maggiore dal confine dell'arena (più spazio disponibile, Figura 2B). Nella strategia di fuga a turni, l'esca robotica girerà di 90° di lato con più spazio per fuggire, giudicata a intervalli di 0,5 s (Figura 2C).
9. Dopo aver determinato la strategia di fuga, fare in modo che lo script Python codifichi separatamente i segnali di velocità e direzione e li invii all'STM32 tramite la porta seriale (ser.port = 'COM3') a un bit rate di 115200.
   NOTA: Gli script in STM32 sono compilati in ambiente C. Quando il segnale di velocità viene ricevuto, viene convertito in un'onda PWM della frequenza corrispondente dal divisore di frequenza e dall'uscita dell'oscillatore a cristallo (la frequenza del cristallo STM32 è 72000000). Dopo aver ricevuto il segnale di direzione, il segnale digitale viene convertito tirando verso l'alto o verso il basso la tensione della porta di uscita (0 o 3,3 V).
10. Utilizzare il masterizzatore della porta seriale per masterizzare un programma C compilato sull'STM32.
11. Usa il programma di ripristino per spostare l'esca robotica al centro dell'arena.
    NOTA: Rilevando la posizione dell'esca robotica nell'arena, l'esca robotica viene continuamente spinta verso la posizione centrale (5 cm/s) e quando viene rilevata una distanza di <20 mm dalla posizione centrale, si considera che abbia raggiunto il centro dell'arena e smette di muoversi. Eseguire il programma di ripristino prima di eseguire il programma principale.

3. Assuefazione (Figura 2D)

1. Fissare il mouse per 12 ore per ridurre il peso corporeo dell'animale al 90-95% del normale, con libero accesso all'acqua durante questo periodo.
2. Innanzitutto, esegui il programma di ripristino per spostare l'esca robotica al centro dell'arena, quindi isola il topo affamato ai margini dell'arena con un deflettore.
3. Imposta il percorso di salvataggio del file e la velocità di movimento dell'esca robotica (5 cm/s) nel programma principale. Quindi fare clic su Esegui e osservare nella finestra pop-up del video se il mouse e le esche del robot vengono riconosciute in modo stabile.
4. Rimuovere il deflettore e avviare il timer per osservare il comportamento predatorio del topo per 20 minuti, registrando il tempo in cui il topo prende per la prima volta una pallina di cibo dall'esca robotica. Se il topo non lo fa, ferma l'esca e posizionala accanto al topo per l'alimentazione.
5. Rimetti il topo nella sua gabbia e lascia un periodo di recupero di 24 ore con libero accesso a cibo e acqua. Quindi, ripeti l'assuefazione. Se non vi è alcuna differenza significativa nel tempo di prelievo del primo cibo tra due prove consecutive all'interno dello stesso gruppo di animali, considerare che l'assuefazione è completa. Questo periodo richiede in genere 3-5 prove.
6. Dopo ogni assuefazione, pulire accuratamente l'arena con alcol al 75% e acqua.

4. Compito di predazione (Figura 2D)

1. Inizia l'attività di predazione subito dopo l'assuefazione.
2. Fissare il mouse per 12 ore per ridurre il peso corporeo dell'animale al 90-95% del normale, con libero accesso all'acqua durante questo periodo.
3. Innanzitutto, esegui un programma di ripristino per spostare l'esca robotica al centro dell'arena, quindi isola il topo affamato ai margini dell'arena con un deflettore.
4. Impostare il percorso di salvataggio della lima e la velocità di spostamento dell'esca robotica (0-60 cm/s, velocità diverse possono essere impostate in base alle esigenze sperimentali) nel programma principale. Quindi fare clic su Esegui e osservare nella finestra pop-up del video se il mouse e l'esca robotica vengono rilevati in modo stabile.
5. Rimuovere il deflettore e avviare il timer per osservare il comportamento predatorio del mouse per 60 s.
   1. Se il topo cattura con successo l'esca robotica entro 60 s, chiudi il programma principale e consenti al topo di mangiare tutti i pellet di cibo prima di essere rimesso nella gabbia.
   2. Se il topo non cattura l'esca robotica entro 60 s, rilascia il topo direttamente nella gabbia senza alcuna ricompensa o punizione.
6. Condurre un secondo ciclo di attività di predazione 4 ore dopo, ripetendo i passaggi 4.3-4.5.
7. Concedi al topo un periodo di recupero di 24 ore con libero accesso a cibo e acqua. Quindi, ripeti l'attività di predazione. Se più dell'80% dei topi spende meno di 15 secondi in due prove consecutive, i topi sono considerati abili predatori.
8. Dopo ogni attività di predazione, pulisci accuratamente l'arena con alcol al 75% e acqua.

Risultati

Per sfuggire a un predatore, la preda impiega spesso strategie di fuga flessibili e variabili, come cambiare la velocità di fuga o fuggire in direzioni imprevedibili 21,22,23. In questo studio, il modello di movimento dell'esca robotica è controllato in modo flessibile in velocità e direzione in modo da poter modificare la direzione di fuga e la velocità dell'esca robotica per simulare il compito di predazione in condizioni dive...

Discussione

In questo protocollo, per ottenere un controllo in tempo reale con una bassa latenza del sistema, utilizziamo OpnenCV, una libreria di visione artificiale leggera ed efficiente, e un modello di colore per identificare le posizioni dei mouse e dell'esca del robot. Ciò richiede che l'illuminazione nell'arena sia relativamente stabile e che le ombre nell'arena siano evitate il più possibile per evitare di interferire con il rilevamento dei topi neri. Per ottenere un rilevamento dei contorni...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cilindro acrilico	SENTAI	PMMA	Diametro 800 mm Altezza 300 mm Spessore 8 mm
Tavolo antivibrante	VEOO	Custom made	Lunghezza 1500 mm Larghezza 1500 mm Altezza 750 mm
Telecamera	JIERUIWEITONG	HF868SS	Dimensione pixel 3 &; m &acuto; 3 µ m 480P: 120 fps
Telaio di supporto della fotocamera	RUITU	Su misura	Larghezza massima 3300 mm Altezza massima 2600 mm
Circuito stampato	WXRKDZ	Su misura	Lunghezza 60 mm Larghezza 40 mm Distanza tra i fori 2,54 mm
Computer	DELL	Precision 5820 Tower	Inter(R) Xeon(R) W-2155 CPU NVIDIA GeForce RTX 2080Ti
DuPont Line	TELESKY	Pellet alimentare su misura	da 30 cm
	Bio-serve	F07595	20 mg
Telaio di supporto della piattaforma	HENGDONG	OB3030	Lunghezza 1600 mm Altezza 900 mm Larghezza 800 mm
Alimentazione regolata	ZHAOXIN	PS-3005D	Tensione di uscita: 0-30 V Corrente di uscita: 0-3 A
Blocco magnetico rotondo	YPE	YPE-230213-5	Diametro 40 mm Spessore 10 mm
Driver per servomotori	FEREME	FCS860P	0,1 kw-5,5 kw SVPWM 220 VAC+10% ~-15% RS-485
Guida di scorrimento	JUXIANG	JX45	Lunghezza 1000 mm Larghezza 1000 mm
Lastra acrilica quadrata	SENTAI	PMMA	Lunghezza 800 mm Larghezza 800 mm Spessore 10 mm
Quadrato Blocco magnetico	RUITONG	N35	Lunghezza 100 mm Larghezza 50 mm Spessore 20 mm
Stm32	ZHENGDIANYUANZI	F103	STM32F103ZET6 72 MHz clock
Transistor	Semtech	C118536	2N2222A, NPN