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Articolo metodologico

In vivo Applicazione dell'etichettatura di prossimità basata su TurboID in Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/68193

⸱

13 giugno 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

In questo articolo

Sommario

In questo studio, abbiamo stabilito un protocollo dettagliato per la marcatura di prossimità (PL) basata su TurboID nell'ovaio di D. melanogaster , coprendo passaggi dall'integrazione di biotina e la dissezione ovarica alla convalida dell'espressione transgenica e all'arricchimento di peptidi biotinilati per la spettrometria di massa.

Abstract

La marcatura di prossimità (PL) è un metodo potente per mappare le reti di interazione proteina-proteina. I progressi nella marcatura degli enzimi, in particolare TurboID, ne hanno ampliato l'uso in tutti i sistemi biologici. TurboID è particolarmente vantaggioso per le applicazioni in vivo grazie alla sua robustezza, atossicità e facilità d'uso. Questo enzima biotinila promiscuamente le biomolecole vicine, comprese le proteine e gli acidi nucleici, entro un intervallo di circa 10 nm in presenza di biotina. Abbiamo applicato questo metodo per studiare l'interattoma delle zucchine (Zuc), un fattore chiave nella biogenesi dell'RNA che interagisce con i piwi (piRNA) sulla membrana mitocondriale esterna (OMM) nelle cellule germinali dell'ovaio di Drosophila melanogaster . Esprimendo Zuc-TurboID nelle cellule germinali e integrando con biotina, abbiamo indotto la biotinilazione delle proteine prossimali di Zuc. L'analisi della spettrometria di massa a seguito dell'arricchimento di peptidi biotinilati ha identificato proteine in prossimità di Zuc, inclusi interattori ben noti nella biogenesi dei piRNA. È interessante notare che abbiamo scoperto nuovi interattori di Zuc coinvolti nel ripiegamento delle proteine, nell'organizzazione della membrana e nel traffico delle vescicole.

Introduzione

I metodi convenzionali di mappatura dell'interazione proteina-proteina (PPI), come la spettrometria di massa per purificazione di affinità (AP-MS) e i sistemi ibridi di lievito 2 (Y2H), spesso non riescono a catturare proteine a bassa abbondanza, espresse transitoriamente o legate alla membrana. Questa limitazione deriva dalla loro incapacità di replicare le condizioni fisiologiche native di una cellula vivente 1,2,3. Per superare queste sfide, la PL è emersa come una potente tecnica per la mappatura del proteoma ad alta risoluzione a livello di sub-organelli in vivo. Il PL sfrutta la fusione di un enzima promiscuo con la proteina esca, consentendo all'enzima di catalizzare la formazione di molecole reattive a vita breve1. Queste molecole reattive, come la biotina, marcano in modo covalente le proteine entro pochi nanometri dalla proteinadi fusione 4. Successivamente, le proteine biotinilate vengono isolate e analizzate mediante spettrometria di massa per facilitare l'identificazione delle proteine su larga scala 5,6.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati vari enzimi promiscui per far progredire le tecniche di PL. Due enzimi ampiamente utilizzati sono la biotina ligasi mutata R118G derivata da Escherichia coli (BioID) e l'enzima 2 ascorbato perossidasi derivato dal pisello (APEX2). BioID converte la biotina e l'ATP in biotinil-5'-adenilato (bioAMP)1. Questa molecola reattiva si lega covalentemente ai residui di lisina delle proteine vicine entro ± raggio di 10 nm. Un vantaggio chiave del PL basato su BioID è l'uso della biotina. Si tratta di una biomolecola presente in natura e non tossica negli organismi viventi, che consente una marcatura sicura in vivo 6. Tuttavia, BioID presenta dei limiti, tra cui la cinetica di marcatura lenta (18-24 ore) e il requisito di un'alta temperatura (37 °C) per un'attività catalitica ottimale4. Questi tratti possono ostacolarne l'applicazione nello studio dei processi biologici dinamici. Nel frattempo, APEX2 catalizza la formazione di radicali biotina-fenossile in presenza di biotina-fenolo e perossido di idrogeno (H2O2)7. Questi radicali reagiscono principalmente con la catena laterale di amminoacidi ricchi di elettroni come la tirosina e possono anche legare cisteina, istidina e triptofano8. La capacità di marcatura rapida dell'enzima perossidasi (< 1 min) è adatta per catturare PPI dinamici e transitori9. Inoltre, ha un campo di rilevamento più ampio (fino a 20 nm) rispetto alla biotina ligasi. Tuttavia, il PL a base di APEX2 ha i suoi svantaggi, tra cui la necessità di un agente ossidante tossico, H2O2, e la bassa permeabilità della biotina-fenolo, che limitano l'applicabilità in vivo10.

Nel 2018, Branon et al. hanno sviluppato una nuova biotina ligasi chiamata TurboID, una versione mutante di 35 kD di BirA (la biotina ligasi presente in E. coli)4. Questo enzima incorpora una mutazione in posizione R118 (R118S) insieme ad altre 15 mutazioni relative a BirA. Presenta un'attività catalitica due volte superiore rispetto al BioID. La biotinilazione indotta da TurboID in 10 minuti produce dati proteomici con dimensioni e specificità paragonabili a 18 ore di marcatura da parte di BioID. Inoltre, dimostra un'eccellente attività di marcatura a 30 °C4. Pertanto, TurboID è più adatto per l'applicazione in organismi come Drosophila o Caenorhabditis elegans, che vengono comunemente allevati rispettivamente a 25 °C e 20 °C.

In questo studio, miriamo a utilizzare PL basato su TurboID per lo studio dell'interattoma nell'ovaio di Drosophila. I protocolli qui descritti sono impiegati per mappare l'interattoma di Zuc nelle cellule germinali. Lo Zuc è un'endonucleasi localizzata sulla membrana mitocondriale esterna (OMM), che media la biogenesi dei piRNA, piccoli RNA non codificanti fondamentali per il mantenimento dell'integrità del genoma 11,12,13. Confrontando le proteine biotinilate identificate dall'analisi Zuc-TurboID con quelle di due controlli aggiuntivi, NES-TurboID e Tom20-TurboID, abbiamo definito candidati distinti che interagiscono con Zuc.

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Protocollo

1. PL nel moscerino adulto

  1. Preparazione del cibo a base di biotina
    1. Preparare la soluzione 1 M di NaOH diluendo 10 M di NaOH in acqua tripla distillata (TDW). Conservarlo a temperatura ambiente (RT). Preparare 1 soluzione madre di biotina M sciogliendo 0,0049 g di polvere di biotina in 20 ml di TDW. Aggiungere 150-200 μl di 1 M NaOH per aumentare la solubilità della biotina. Vortice per omogeneizzare la soluzione. Conservare la soluzione madre di biotina a 4 °C.
    2. Estrarre il cibo per mosche dalla fiala e cuocerlo nel microonde per 2 minuti fino a quando non si sarà sciolto.
      NOTA: Il cibo standard per mosche contiene il 5% di farina di mais, il 3% di lievito, il 10% di saccarosio, l'1% di agar, lo 0,3% di acido propionico e lo 0,3% di metil4-idrossibenzoato13.
    3. Aggiungere il brodo di biotina al cibo fuso con una concentrazione finale di 100 μM, quindi mescolare a vortice. Erogare immediatamente 4,5 ml di alimento integrato con biotina in ogni flaconcino vuoto utilizzando una pipetta sierologica. Lasciare raffreddare il cibo per 30 minuti, posizionare una cuffia di cotone sulla fiala, quindi conservare il cibo a base di biotina a 4 °C.
      NOTA: La biotina deve essere aggiunta prima che il cibo si raffreddi e si indurisca.
  2. Alimentazione con biotina
    1. Incrocia i moscerini transgenici che sovraesprimono la proteina di fusione TurboID con mosche GAL4 tessuto-specifici o cellule 14,15,16. Come controllo negativo, incrociare mosche wild-type con mosche driver GAL4 per garantire l'assenza di induzione della biotinilazione.
    2. Circa 10 giorni dopo l'incrocio, i progeni inizieranno a schiudersi. Sciogliere il lievito secco in polvere nel TDW e mescolare fino a ottenere una pasta liscia. Applicare un cucchiaio da laboratorio di pasta di lievito sulla parete di una nuova fiala. Picchietta delicatamente la vecchia fiala contenente le mosche appena nate per raccogliere le mosche sul fondo. Capovolgere la vecchia fiala sulla nuova fiala contenente pasta di lievito, assicurandosi che i bordi di entrambe le fiale siano allineati per evitare la fuoriuscita di mosche.
    3. Batti insieme quelle fiale per trasferire le mosche dalla vecchia fiala alla parte inferiore della nuova fiala. Una volta che le mosche sono state trasferite, riposizionare saldamente i cappucci di cotone sia sulla nuova che sulla vecchia fiala. Attendi 3 giorni. La pasta di lievito può essere conservata a RT per alcuni giorni.
      NOTA: Il trasferimento al volo deve essere effettuato il più rapidamente possibile perché le mosche saranno stordite solo temporaneamente.
    4. Preparare una soluzione di acido propionico allo 0,5% diluendo 250 μL di acido propionico in 50 mL di TDW. Conservalo su RT.
    5. Il 3° giorno, preparare 100 μM di soluzione di lavoro di biotina diluendo 1 M di stock di biotina in TDW, quindi aggiungere 500 μL di acido propionico allo 0,5%. Mescolare la soluzione di lavoro della biotina con il lievito secco in polvere e mescolare fino a formare una pasta. Aggiungi un cucchiaio da laboratorio di pasta di lievito di biotina alla parete della fiala di biotina. La pasta di lievito di biotina può essere conservata presso RT per alcuni giorni.
    6. Dividi le mosche in due gruppi. Tenere un gruppo nella normale fiala di cibo come controllo e trasferire l'altro gruppo nella fiala di biotina (aggiunta di biotina-pasta di lievito) per iniziare la biotinilazione. Dopo 16 ore di biotinilazione, trasferire le mosche in una nuova fiala di cibo normale.
      NOTA: In precedenza abbiamo eseguito un test di alimentazione con biotina per 4 ore, 8 ore e 16 ore. Il segnale di biotinilazione era più forte dopo 16 ore di alimentazione, quindi abbiamo scelto questo punto temporale per gli esperimenti successivi.
  3. Collezione ovarica di Drosophila
    1. Metti le mosche nel cuscinetto antimosche CO2 , tieni le femmine e scarta i maschi. Dopo che i moscerini sono stati adeguatamente anestetizzati (non si muovono più), pipettare 1 mL di terreno freddo per insetti Grace sul piatto di dissezione.
    2. Prendi una mosca sul piatto di dissezione usando una pinza a punta fine e lasciala immergere nel mezzo. Tenere il torace della mosca con una pinza, fare attenzione a non schiacciare il corpo. Quindi, usa un'altra pinza per rimuovere delicatamente la punta dell'addome posteriore (dove si trova la parte dei genitali).
    3. Usa la pinza per spremere lentamente le ovaie (partendo dalla parte superiore dell'addome fino al fondo).
    4. Una volta fuori, rimuovi le reti muscolari e altri tessuti che circondano le ovaie. Fare attenzione a non danneggiare le ovaie.
    5. Trasferire con cura le ovaie pulite in una provetta da 1,7 ml utilizzando una pinza; Tenere il tubo sul ghiaccio. Ripetere i passaggi 1.3.2 - 1.3.4 per le mosche successive.
    6. Centrifugare la provetta a 3.500 x g per 30 s a 4 °C, quindi utilizzare i puntali per micropipette per rimuovere il terreno rimanente. Fare attenzione a non toccare le ovaie.
    7. Congelare la provetta con azoto liquido, quindi conservare le ovaie a -80 °C. I campioni di ovaie sono stabili per 1 anno.

2. Espressione transgenica e rilevazione di proteine biotinilate mediante saggio Western blot

NOTA: Per il saggio western blot, raccogliere circa cinque coppie di ovaie per campione.

  1. Lisi tissutale
    1. Scongelare il tessuto ovarico congelato. Aggiungere 50 μL di tampone di lisi RIPA (50 mM di Tris-HCl pH 8, 150 mM di NaCl, 0,1% di sodio dodecil solfato (SDS), 0,5% di sodio desossicolato, 1% di Triton X-100), integrato con 1 cocktail di inibitori della proteasi (PI) e 1 mM di fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF). Conservare il tampone di lisi RIPA (senza 1x cocktail PI e 1 mM PMSF) a 4 °C.
      NOTA: Il cocktail PI e il PMSF devono essere aggiunti solo subito prima dell'esperimento.
    2. Distruggi le ovaie usando un omogeneizzatore portatile accoppiato con un pestello di plastica (1 min per tubo). Per garantire una lisi completa è necessario un processo di lisi tissutale su ghiaccio per 10 minuti, seguito da omogeneizzazione.
    3. Centrifugare a 13.500 x g per 10 minuti a 4 °C per separare il lisato proteico dai detriti.
    4. Pipettare il lisato proteico chiaro in una nuova provetta da 1,7 ml (evitare di prendere lo strato lipidico sopra), quindi conservare il lisato a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
  2. Misurazione della concentrazione proteica mediante saggio dell'acido bicinchoninico (BCA)
    1. Preparare il reagente di lavoro (WR) dell'acido bicinconinnico (BCA) mescolando il reagente A e il reagente B in un rapporto 50:1. Miscelare 1 μL di lisato o BSA standard diluito con 200 μL di WR in una piastra a 96 pozzetti (in duplicati), quindi incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti.
      1. Calcola la quantità di WR necessaria utilizzando questa formula:
        (# standard + # campioni) × (# repliche) × (volume WR per campione)
        Per creare una serie di standard proteici, preparare diverse diluizioni di 2 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) nel tampone di lisi RIPA (senza cocktail PI e PMSF) con concentrazioni finali 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 e 2000 μg/mL.
    2. Misura l'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 495 nm. Generare una curva standard dai valori di assorbanza BSA, quindi determinare la concentrazione proteica.
  3. Saggio Western blot
    1. Elettroforesi
      1. Aggiungere 30-50 μg di lisato proteico al tampone di caricamento SDS 2x. Aggiungere TDW (se necessario) per ottenere una concentrazione proteica finale di 2 μg/μL e una concentrazione finale di 1x SDS, quindi far bollire il campione a 95 °C per 10 minuti.
      2. Preparare il tampone di corsa mescolando 25 mL di tampone 20x MOPS con 500 mL di TDW per ottenere una concentrazione di 1x di tampone di corsa. Conservalo su RT.
      3. Sciacquare i pozzetti del gel Bis-Tris con 1 mL di tampone scorrevole (3x), quindi posizionare il gel Bis-Tris nella camera di elettroforesi. Riempire il lato anteriore della camera con il nuovo tampone di scorrimento fino a quando tutti i pozzetti sono sommersi (± 250 mL). Riempire il lato posteriore della camera con il tampone di corsa usato (metà del volume del nuovo tampone di corsa utilizzato è sufficiente).
      4. Caricare il campione sul gel Bis-Tris e utilizzare 4 μL di scala proteica prestained come marcatore. Eseguire l'elettroforesi (200 V, 30 min). Estrarre il gel dalla cassetta e risciacquare con TDW.
    2. Blotting della membrana
      1. Creare un tampone di trasferimento aggiungendo 20 mL di tampone di trasferimento (25x stock) e 50 mL di metanolo in 430 mL di TDW.
      2. Disporre un sandwich composto da tamponi assorbenti, carta da filtro, gel e membrana in nitrocellulosa in un modulo di tamponamento. Prima di impilare un nuovo strato, utilizzare un rullo per rimuovere le bolle.
      3. Installare il modulo blot sulla camera di trasferimento, quindi riempire la camera con 500 mL di tampone di trasferimento. Trasferire proteine per 1 ora a 175 mA.
        NOTA: Il tampone di trasferimento deve essere preparato di fresco prima dell'esperimento.
    3. Inceppamento
      1. Aggiungere 5 mL di stock Tween20 in 45 mL di TDW per ottenere il 10% di soluzione stock Tween20. Sciogliere due compresse di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in 400 mL di TDW. Rimuovere 4 mL di soluzione, quindi aggiungere 4 mL di Tween20 al 10% (concentrazione finale 0,1%) per ottenere 1x soluzione PBST. Conservalo su RT.
      2. Rimuovere la membrana tamponata dalla camera di trasferimento, quindi risciacquare con 1x PBST.
        NOTA: Se la membrana deve essere incubata con anticorpi diversi, tagliarla con una lama pulita in acciaio inossidabile in base alle dimensioni previste delle proteine prima di eseguire la fase di blocco.
      3. Per controllare l'espressione genica, utilizzare il 2% di BSA in 1x PBST per la fase di blocco (1 h, RT). Preparare una soluzione di BSA al 2% aggiungendo 1 g di BSA in 50 mL di 1x PBST. Per la rilevazione di proteine biotinilate, eseguire il blocco utilizzando BSA al 3% in 1x PBST (durante la notte, 4 °C). Sciogliere 1,5 g di polvere di BSA in 50 ml di 1x PBST per ottenere una soluzione di BSA al 3%. Conservare le soluzioni bloccanti a 4 °C.
        NOTA: Il BSA utilizzato è diverso da quello utilizzato nel test BCA. Il test BSA per BCA fa parte del kit BCA.
    4. Incubazione degli anticorpi primari
      1. Diluire 1 μL di α-V5 in 10 mL di BSA al 2% (1: 10.000) e 10 μL di gene housekeeping α-HSP90 in BSA al 2% (1: 1.000). Aggiungere 2,7 μL di coniugato streptavidina-perossidasi di rafano (SA-HRP) in 9 mL di soluzione 1x PBST per ottenere 0,3 μg/mL di soluzione SA-HRP.
      2. Per controllare l'espressione genica, incubare la membrana con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C. Per la rilevazione di proteine biotinilate, incubare la membrana per 1 ora a 4 °C. Conservare l'anticorpo primario a 4 °C. Può essere utilizzato più volte.
      3. Lavare la membrana con 1x PBST per 3x a RT per 15 min ciascuna.
    5. Incubazione secondaria degli anticorpi
      1. Preparare la soluzione di anticorpi secondari aggiungendo 2 μL di IgG anti-coniglio di capra o anti-topo (perossidasi di rafano (HRP) coniugata) in 10 mL di BSA al 2% (1: 5.000).
        NOTA: Per SA-HRP non è necessario un anticorpo secondario. Procedi direttamente alla fase di visualizzazione. Gli anticorpi secondari devono essere appena diluiti prima dell'esperimento.
      2. Incubare la membrana in una soluzione di anticorpi secondari per 40 minuti a RT. Lavare la membrana con 1x PBST per 3x a RT per 15 min ciascuno.
    6. Rilevamento di proteine con metodo di chemiluminescenza avanzata (ECL)
      1. Miscelare 750 μl di luminol e 750 μl di soluzione HRP (rapporto 1:1). Mantenere la membrana umida nel tampone di lavaggio durante la preparazione della miscela.
        NOTA: Questa miscela deve essere preparata al momento prima dell'esperimento. Poiché le sostanze chimiche sono sensibili alla luce, tenerle lontane dalla luce solare o da altre fonti di luce intensa (l'esposizione a breve termine all'illuminazione del laboratorio va bene).
      2. Immergere la membrana nella soluzione per 30 s, quindi posizionarla tra fogli di plastica trasparente. Osservare le bande proteiche tamponate con uno strumento Chemidoc.

3. Validazione dell'espressione e della localizzazione dei transgeni mediante colorazione in immunofluorescenza

NOTA: Per controllare l'espressione genica e la localizzazione, sezionare circa cinque coppie di ovaie per campione da femmine di 2 giorni alimentate con pasta di lievito. Le ovaie giovani contengono prevalentemente gli stadi iniziali delle camere uovo, ideali per la colorazione in immunofluorescenza a causa dell'abbondanza di cellule nutrici (cellule germinali) e delle loro membrane relativamente permeabili17. Gli stadi tardivi delle camere delle uova sono più rigidi e difficili da penetrare a causa della formazione del complesso del guscio d'uovo, che inizia allo stadio9-18. Per il test di biotinilazione delle proteine, sezionare circa cinque coppie di ovaie per campione da femmine di 4 giorni alimentate con biotina, come descritto al punto 1.2.

  1. Preparazione del campione
    1. Tenere in posizione la parte posteriore di un'ovaia sezionata usando una pinza. Usa un'altra pinza per separare delicatamente l'ovaia in singole camere dell'uovo. Lavorare con attenzione per evitare di rompere le camere delle uova. Il protocollo di isolamento della camera delle uova è stato descritto in dettaglio in19. Pipettare con cura le camere delle uova in una provetta da 1,7 mL, quindi lavare con 1 mL di 1x PBS (RT). Tagliare il bordo dei puntali della pipetta prima del pipettaggio per evitare che le camere delle uova rimangano incastrate nei puntali.
      NOTA: Utilizzare solo le camere delle uova nella fase ≤ 9 (quelle trasparenti). Scartare gli ovociti maturi e le camere delle uova in fase avanzata ≥ 10. Il pipettaggio farà galleggiare le camere delle uova nella soluzione. Pertanto, lasciare che le camere delle uova si depositino sul fondo (per 5 minuti) prima di procedere con i passaggi successivi.
  2. Fissazione
    1. Diluire 3,125 mL di formaldeide (FA) al 16% in 6,875 mL di 1x PBS per ottenere una soluzione di FA al 5%. Conservalo su RT.
      NOTA: FA è sensibile alla luce, quindi tienilo lontano dalla luce.
    2. Pipettare 1 mL di Formaldeide (FA) al 5% nella provetta contenente gli ovociti. Posizionare la provetta sul multirotatore, quindi fissare gli ovociti per 30 minuti.
      NOTA: Dalla fissazione fino alla fase di colorazione nucleare, gli esperimenti vengono eseguiti su un multi-rotatore con rotazione delicata.
    3. Preparare Triton X-100 allo 0,5% in 1x PBS (1x PBT) come soluzione di lavaggio aggiungendo 10 mL di 10% di stock Triton X-100 in 190 mL di 1x PBS. Conservalo su RT.
    4. Sciacquare 1 volta le camere delle uova fisse, quindi lavare 3 volte a RT per 10 minuti. Utilizzare 1 ml di 1x PBT sia per il risciacquo che per il lavaggio.
  3. Inceppamento
    1. Preparare il siero fetale bovino al 5% (FBS) aggiungendo 250 μL di brodo FBS in 4,75 mL di 1x PBT.
      NOTA: Questa soluzione deve essere preparata di fresco prima dell'esperimento.
    2. Aggiungere 1 mL di FBS al 5% nella provetta ed eseguire la fase di blocco per 1 ora a RT. Sciacquare gli ovociti 1 volta.
  4. Incubazione degli anticorpi primari
    1. Per controllare l'espressione e la localizzazione del transgene, diluire 2 μL di α-V5 e 2 μL di α-ATP5A o α-Tom20 (come marcatore mitocondriale) in 400 μL di 1x PBT (rapporto 1:200).
      NOTA: Sebbene due anticorpi possano essere utilizzati insieme per colorare un campione, i loro ospiti devono essere diversi. Serve ad evitare la sovrapposizione del legame dei successivi anticorpi secondari.
    2. Incubare le camere delle uova con 400 μl di soluzione di anticorpi primari diluiti (durante la notte, 4 °C).
      NOTA: Analogamente al saggio Western blot, gli anticorpi primari possono essere utilizzati più volte per l'immunocolorazione. Prima di conservare una soluzione di anticorpi, assicurarsi che non contenga camere per le uova.
    3. Sciacquare le camere delle uova 1 volta, quindi lavare 3 volte a RT per 10 minuti.
  5. Incubazione secondaria degli anticorpi
    1. Diluire 2 μL di IgG α-Rb di capra Alexa Fluor 488 e 2 μl di Goat α-M IgG Alexa Fluor 594 in 400 μl di 1x PBT (rapporto 1:200). Incubare le camere delle uova con 400 μL di soluzione di anticorpi secondari diluiti per 2 ore a RT. Per il rilevamento della biotinilazione, aggiungere 2 μL di Alexa Fluor 594 coniugato con streptavidina a 1x PBT (rapporto 1:200) e incubare insieme a un anticorpo secondario.
      NOTA: Da questo passaggio, proteggere il campione dalla luce. Gli anticorpi secondari devono essere appena diluiti prima dell'esperimento. Più anticorpi secondari possono essere utilizzati insieme, ma ogni anticorpo primario deve essere assegnato a diversi fluorofori che hanno avuto origine da ospiti diversi per evitare la sovrapposizione dei segnali. Ad esempio, 488 Goat α-Rb si legherà al coniglio α-V5. Per quanto riguarda il α-ATP5A di topo, il 594 Goat α-M è utilizzato come anticorpo secondario complementare. In caso di rilevamento della biotinilazione, l'uso di altri coloranti con la stessa lunghezza d'onda del coniugato di streptavidina deve essere omesso.
    2. Sciacquare le camere delle uova 1 volta, quindi lavare 3 volte a RT per 10 minuti.
  6. Colorazione nucleare
    1. Diluire 1 μL di DAPI in 1 mL di 1x PBS (rapporto 1:1.000). Incubare le camere delle uova con 1 mL di soluzione DAPI diluita per 5 minuti a RT.
      NOTA: DAPI deve essere appena diluito prima dell'esperimento.
    2. Sciacquare le camere delle uova 1 volta, quindi lavare 3 volte a RT per 10 minuti.
      NOTA: Le camere delle uova possono essere conservate in 1 soluzione PBS a 4 °C per alcune ore prima del montaggio, ma si consiglia di procedere il prima possibile.
  7. Montaggio a slitta
    1. Pulire il vetrino con un fazzoletto privo di lanugine, quindi annotare le informazioni sul campione su di esso. Rimuovere 1x PBS dal tubo, ma lasciarne una piccola quantità per evitare la secchezza.
    2. Tagliare il bordo dei puntali delle micropipette, quindi pipettare con cura le camere delle uova sul vetrino. Utilizzare una pinza per distribuire con cura le camere delle uova sul vetrino ed evitare la formazione di grumi. Osservare i vetrini al microscopio (è sufficiente un ingrandimento 2x) per assicurarsi che le camere delle uova siano distribuite uniformemente.
    3. Rimuovere il PBS rimanente dal vetrino utilizzando una micropipetta. Pipettare 15-30 μL di soluzione antisbiadimento (fotosensibile) sul vetrino e assicurarsi che entri in contatto con tutte le camere delle uova.
    4. Usa una pinza per tenere il bordo del coperchio del vetrino, quindi posizionalo sopra il vetrino (partendo da un bordo all'altro) in modo che copra le camere delle uova. Fallo lentamente per evitare bolle. Tamponare la soluzione in eccesso con un fazzoletto privo di lanugine, quindi sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie. Lasciare asciugare bene lo smalto (± 5 min).
    5. Visualizzare i vetrini con un microscopio confocale. Conservare i vetrini a -20 °C.

4. Arricchimento di peptidi biotinilati per analisi di spettrometria di massa

NOTA: Per il campione di spettrometria di massa sono necessari circa 3 mg di proteine. Pertanto, seziona circa 100 coppie di ovaie per ottenere tale quantità.

  1. Lisi tissutale
    1. Scongelare il tessuto ovarico congelato. Nel frattempo, preparare 1 soluzione salina tamponata con Tris (TBS) sciogliendo 1 compressa TBS in 500 ml di TDW. Conservare in RT. Preparare il 2% di SDS in 1x TBS come tampone di lisi diluendo 4 mL di stock SDS al 10% in 16 mL di 1x TBS. Conservarlo in RT.
    2. Aggiungere 500 μl di SDS al 2% in 1x TBS (integrato con 1x cocktail PI) nella provetta contenente le ovaie. Attendere alcuni minuti fino a quando le cellule non vengono lisate e la soluzione diventa appiccicosa.
    3. Pipettare il lisato in una provetta da 1 mL contenente fibra di acustica focalizzata adattiva (AFA). Tagliare i puntali delle pipette prima dell'uso. Per garantire una sonicazione efficiente, trasferire un massimo di 500 μl di lisato per provetta.
    4. Eseguire la sonicazione con le seguenti condizioni: potenza incidente di picco 75 W, fattore di lavoro 10%, cicli per raffica 200, tempo 180 s, temperatura 6 °C.
      NOTA: Se un campione deve essere sottoposto a sonicazione più volte, impostare alcuni intervalli tra di loro per evitare di generare calore eccessivo.
  2. Precipitazione dell'acetone
    1. Spostare il lisato in una provetta da 5 mL a basso legame, quindi aggiungere acetone freddo nella provetta a 6 volte il volume del campione. Ad esempio, aggiungere 3 ml di acetone a 500 μl di lisato.
      NOTA: L'acetone deve essere pre-raffreddato a -20 °C prima dell'uso.
    2. Tubo a vortice, caricarlo nel multirotatore e incubare per una notte (± 16 ore) a -20 °C.
      NOTA: questo è un punto di arresto, il che significa che l'esperimento può essere momentaneamente messo in pausa dopo questo passaggio.
    3. Proteine precipitate in pellet a 15.000 x g per 15 min a 4 °C. Eliminare il surnatante, quindi centrifugare la provetta a 4 °C.
    4. Aggiungere 2 mL di una soluzione di miscela composta per il 90% da acetone freddo e per il 10% da 1x TBS. Pipettare con movimenti su e giù per miscelare il pellet e la soluzione. Tagliare i puntali della pipetta prima dell'uso.
    5. Agitare la provetta, quindi caricarla nel multirotatore e incubare per 2 ore a -20 °C.
    6. Proteine in pellet a 15.000 x g per 15 min a 4 °C. Eliminare il surnatante, quindi centrifugare il tubo a 4 °C. Aprire il tubo e asciugare il pellet all'aria per 10 minuti.
      NOTA: Non asciugare eccessivamente il pellet perché sarà difficile risolverlo in seguito.
    7. Preparare 500 mM di soluzione madre di bicarbonato di ammonio (ABC) sciogliendo 0,7906 g di ABC in 20 mL di TDW. Preparare una soluzione di lavoro ABC da 50 mM diluendo 3 mL di 500 mM di soluzione madre ABC in 27 mL di TDW.
    8. Preparare la soluzione di urea 8 M aggiungendo 0,4805 g di urea in 1 mL di 50 mM ABC.
      NOTA: La soluzione di urea deve essere preparata al momento prima dell'esperimento.
    9. Pellet proteico risospeso in 500 μL di urea 8 M. Il volume dell'urea 8 M può essere ridotto per aumentare la concentrazione proteica.
    10. Trasferire la proteina risospesa in un millitubo da 1 mL contenente fibra AFA, quindi eseguire la sonicazione con le stesse condizioni descritte al punto 4.1.4.
    11. Eseguire il test BCA per determinare la concentrazione proteica. Questo passaggio è un punto di arresto. Conservare il campione di proteine a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
  3. Digestione della tripsina
    1. Mescolare 3 mg di proteine con TDW (se necessario) in una provetta da 5 mL a basso legame per ottenere un totale di 500 μL di soluzione.
    2. Denaturare le proteine utilizzando il termoblocco a 450 giri/min per 1 ora a 37 °C.
    3. Aggiungere 5 μL di 1 M DTT (disciolto in TDW) nella provetta per ottenere una concentrazione finale di 10 mM DTT, quindi ridurre le proteine utilizzando un termoblocco a 450 giri/min per 1 ora a 37 °C.
    4. Preparare 400 mM di iodoacetammide sciogliendo 0,0111 g di iodoacetammide in 150 μL di ABC. Aggiungere 55 μL di 400 mM di iodoacetamide nella provetta (concentrazione finale 40 mM), quindi alchilare le proteine utilizzando il termoblocco a 450 giri/min per 1 ora a 37 °C.
      NOTA: La iodoacetammide è sensibile alla luce e tutte le soluzioni di iodoacetamide devono essere preparate al momento prima dell'esperimento.
    5. Diluire il campione aggiungendo 50 mM di soluzione ABC fino a quando il volume totale raggiunge i 4 mL. Dopo la diluizione, la concentrazione di urea nella soluzione è di circa 1 M.
    6. Preparare 1 soluzione madre M di CaCl2 sciogliendo 1,1098 g di CaCl2 in 10 mL di TDW. Aggiungere 4 μl di 1 M di CCl2 nella provetta per ottenere una concentrazione finale di 1 mM, quindi pipettare su e giù per omogeneizzare la soluzione.
    7. Preparare una soluzione madre di tripsina da 1 mg/mL aggiungendo 0,001 g di tripsina a 1 mL di ABC. Aggiungere 150 μl di tripsina alla provetta (tripsina: campione = rapporto 1:20). Digerire le proteine utilizzando il termoblocco a 450 giri/min per 16 ore a 37 °C.
      NOTA: La tripsina deve essere appena sciolta prima dell'esperimento. Questo passaggio è un punto di arresto. Conservare i peptidi digeriti a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
  4. Arricchimento di peptidi biotinilati
    NOTA: I tamponi di lavaggio e di eluizione devono essere preparati di fresco prima dell'esperimento.
    1. Preparare 2 M di urea in 1x TBS di soluzione aggiungendo 1,2012 g di urea in 10 mL di 1x TBS.
    2. Utilizzare 150 μl di biglie magnetiche coniugate con streptavidina per campione da 3 mg. Lavare le perle di streptavidina con 1 mL di urea 2 M in 1x TBS. Ripetere questo passaggio 4 volte. Dopo ogni lavaggio, posizionare il tubo su una griglia magnetica per 1 minuto, quindi gettare il tampone di lavaggio.
      NOTA: Si consigliano le perle magnetiche di streptavidina Pierce in quanto riducono al minimo i segnali di fondo simili a PEG nei risultati della spettrometria di massa.
    3. Pipettare 1 mL di peptidi digeriti nella provetta contenente le microsfere, mescolare delicatamente e quindi unire la miscela con il campione rimanente in una provetta da 5 mL a basso legame. Posizionare la provetta su un multi-rotatore e incubare per 1 ora a RT.
    4. Trasferire 1 mL della miscela in una provetta da 1,5 mL e posizionarla sulla griglia magnetica per 1 minuto. Scartare il surnatante. Ripeti questo passaggio fino a quando tutte le perline sono raccolte.
    5. Preparare 2 M di urea in 50 mM di ABC sciogliendo 0,7207 g di urea in 6 mL di 50 mM di ABC. Lavare le perle con 1 mL di urea 2 M in 50 mM 2 volte e con 1 mL di TDW una volta. Dopo ogni lavaggio, posizionare il tubo su una griglia magnetica per 1 minuto, quindi gettare il tampone di lavaggio.
    6. Preparare una soluzione madre di acido formico al 10% sciogliendo 1 mL di acido formico in 9 mL di TDW. Preparare il tampone di eluizione costituito dall'80% di acetonitrile e dallo 0,1% di acido formico in TDW. Ad esempio, miscelare 1,2 mL di acetonitrile, 15 μL di acido formico al 10% e 285 μL di TDW per ottenere 1,5 mL di tampone di eluizione.
      ATTENZIONE: L'acetonitrile e l'acido formico sono dannosi a causa delle loro proprietà volatili, quindi indossa una maschera e fai attenzione quando li maneggi.
    7. Pipettare 100 μl di tampone di eluizione nella provetta, omogeneizzare delicatamente e quindi eluire i peptidi utilizzando un termoblocco a 300 giri/min per 5 minuti a 60 °C. Dopo l'eluizione, posizionare la provetta su un rack magnetico e trasferire l'eluato in una nuova provetta da 1,5 mL. Evitare di prendere perline durante il trasferimento dell'eluato. Ripeti questo passaggio 5 volte.
    8. Posizionare la provetta contenente 500 μl di eluato su un rack magnetico per 5 minuti, quindi trasferirla in una nuova provetta da 1,5 mL per garantire la completa rimozione delle perline. I campioni eluiti possono quindi essere essiccati e utilizzati per l'analisi della spettrometria di massa.
    9. Per ulteriori informazioni sull'analisi LC-MS/MS di campioni di peptidi arricchiti e sull'elaborazione dei dati MS, consultare Nguyen et al.20.

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Risultati

Gli output di esempio sono illustrati nella Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 sono stati precedentemente pubblicati da Nguyen et al.20. La Figura 1 illustra la procedura sperimentale di PL a base di TurboID nell'ovaio di Drosophila. Innanzitutto, è stato generato un costrutto che combina Zuc e TurboID (Z...

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Discussione

Qui, forniamo una procedura completa per la marcatura di prossimità (PL) basata su TurboID nell'ovaio di Drosophila , sviluppata attraverso un'ampia risoluzione dei problemi per superare varie sfide. Una questione chiave riguardava i costrutti genetici, poiché diversi layout di fusione influenzavano in modo significativo l'espressione proteica e l'efficienza della biotinilazione. Ad esempio, NES-V5-TurboID ha mostrato un'espressione e una biotinilazione più deboli rispetto ad al...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio per le loro discussioni e il loro aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (RS-2024-00345327 a M.L.; RS-2023-00219563 a M.L.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Antibodies
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo forte, HRPInvitrogen31430
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra (H+L) altamente adsorbito di grado analitico, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra (H+L) sensibile alla luce, HRPInvitrogen31460Grado analitico,
anticorpo HSP90 sensibile alla luce (coniglio)Tecnologia di segnalazione cellulare4874Anticorpo policlonale
Pierce Proteina streptavidina, HRPThermo Fisher Scientific21126Grado analitico
Streptavidina, Alexa Fluor 594 coniugatoInvitrogenS11227Fotosensibile, grado
analiticoAnticorpo V5-tag (topo)Anticorpo monoclonaleInvitrogenR960-25
Anticorpo V5-tag (coniglio) (D3H8Q)Tecnologia di segnalazione cellulare13202Anticorpo monoclonale
Fly LinesCompanyNumero catalogoComments/Description
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Fly stock
pUASp Zucchini V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Fly stock
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Fly stock
con [*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Fly stock
Equipments and ConsummablesCompanyCatalog NumberComments/Description
Bilancia analiticaMettler ToledoME2040,1 mg di risoluzione
Amersham Protran 0,45 NC nitrocellulosa Western Blotting membrane (300 mm e tempi; 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1,7 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge TubeCorningMCT-175-CCo-polimero
MARCA  Vetro di copertura (22 mm x 22 mm)vetro borosilicatoSigma-Aldrich
BR470055 (10 &; micro; L)Vertex4110N00
Puntali per pipette sfusi in propilene (1000 &; micro; L)Vertex4330N00
Puntali per pipette sfusi in propilene (200 &; micro; L)Vertex4230N00propilene
(96 pozzetti)SPL300096Polistirene, tipo a fondo piatto
Centrifuga (con rotore da 1,5-2 mL)Eppendorf5424 RCentrifuga refrigerata ad angolo fisso
(con rotore da 5 mL)Eppendorf5425 RCucchiaio chimico refrigerato ad angolo fisso
-- Sistema
imaging ChemiDocBiorad12003153Western blot sistema di imaging
CO2 fly pad-Scheda anestetica
CO2 serbatoio e regolatore-Attenzione al gas ad alta pressione e alle vertigini
Incubatrice compattaJSRJSGI-10TAttenzione all'alta temperatura
Microscopio a scansione laser confocaleZeissLSM 710Attenzione al raggio laser intenso
Tubo conico (15 mL)SPL50015Polipropilene /Polietilene ad alta densità 
Provetta conica (50 mL)SPL50050Polipropilene /Polietilene ad alta densità 
Bilancia digitale---
Timer digitale---
Piatto di dissezione--
Silicone Dumont #5SF PinzeFine Science Tools11252-00Punte super sottili, attenzione agli oggetti appuntiti
Magnete DynaMag-2Invitrogen12321DPer provette per microcentrifuga da 1,5-2 ml
Fisherbrand  Vetrini per microscopio Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Attenzione agli oggetti appuntiti
Bottiglie di cibo per mosche (con tappo di carta)Hansol TechFFB-21010-Fiale
per alimenti per mosche (con tappo di cotone)Hansol TechFFV-11010-Ultrasuonatore
focalizzatoCovarisM220Attenzione alle onde ultrasoniche
Coltello per gelInvitrogenEI9010Acciaio inossidabile con manico in plastica
Grado 3MM Carta assorbente Chr (46 cm e tempi; 57 cm)Cytiva3030-917Carta Whatmann
Omogeneizzatore portatile e pestello in plasticaKimble749540-0000Motore senza fili
Blocco termicoFine PCRALB6400Attenzione alle alte temperature
Tessuto privo di lanugineYuhan-Kimberly41112-
Azoto liquido--Attenzione al congelamento e all'ustione
Spettrofotometro per micropiastreAgilent TechnologiesOtticabasata su monocromatore
Epoca Microonde--Attenzione per l'alta temperatura
milliTUBE 1 mL fibra AFACovarisPN 520135Vetro
Mini serbatoio gelThermo Fisher ScientificA25977Attenzione ai
gel proteici NuPAGE Bis-tris mini ad alta temperatura, 4– 12%, 1,0 1,5 mm, 10 pozzettiInvitrogenNP0323BOXContiene poliacrilammide, attenzione alla tossicità
NuPAGE Bis-tris mini gel proteici, 4– 12%, 1,0 1,5 mm, 15 pozzettiInvitrogenNP0321BOXContiene poliacrilammide, attenzione alla tossicità
Pennello per vernice (Ø 1,8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MMicropipetta monocanale con espulsore metallico
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MMicropipetta monocanale con espulsore metallico
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MMicropipetta monocanale con espulsore metallico
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MMicropipetta monocanale con espulsore metallico
AlimentazioneScienza principaleMP-310Attenzione all'elettricità ad alta tensione
Rotatore programmabileBiosanRS-24-Protein
LoBind  tubiEppendorf30108302-Lama
di rasoioDorco304020Acciaio inossidabile, attenzione agli oggetti appuntiti
Rullo---Pipetta
sierologica (10 mL)SPL91010Polistirene
Pipetta sierologica (25 mL)SPL91025Polistirene
Pipetta sierologica (5 mL)SPL91005in polistirene
(50 mL)SPL91050Provette
microcentrifuga a bassa ritenzione con tappo a scatto in polistirene (1,5 mL)Thermo Scientific3451PKTampone in spugna in polipropilene
InvitrogenEI9052-Stereomicroscopio
ZeissStemi 508-Stereomicroscopio
 Leica
ThermoMixer  CEppendorf5382000015Con blocchi da 1,5 e 5 ml
PinzettaAven Tools18526Plastica, punte piatte
Miscelatore a vorticeScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Modulo di bloccoInvitrogenEI9051Attenzione alle alte temperature
XCell  SureLock mini-cellInvitrogenEI0001Attenzione alle alte temperature
Sostanze chimicheAziendaNumero di catalogoCommenti/Descrizione
AcetoneSigma-Aldrich650501Grado analitico
AcetonitrileSupelco1.00029.1000Grado LC-MS, attenzione alla tossicità per inalazione e
fiale standard di albumina infiammabile (contenenti albumina sierica bovina (BSA) a 2 mg/mL in soluzione salina allo 0,9% e azoturo di sodio allo 0,05%)Thermo Scientific23209Parte dei kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce (Thermo Scientific, 23225)
Albumina, siero bovinoBioshopALB001Bicarbonato di ammonio di grado analitico
Sigma-Aldrich09830Biotina di grado analitico
 Sigma-AldrichB4639Grado per colture cellulari e tissutali
Cloruro di calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Substrato
ECL occidentaleBiorad1705060Grado analitico
DAPISigma-AldrichMBD0015Sensibile alla luce, grado analitico
Ditiotreitolo (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861Grado analitico
Siero fetale bovinoCorning35-015-CVGrado di coltura cellulare
Acido formicoSigma-AldrichF0507Grado di reagente, attenzione alla tossicità per inalazione Mezzo per
insetti di GraceGibco11595030Grado di coltura cellulare
Lievito secco istantaneoNo BrandN1019-
IodoacetamideSigma-AldrichI1149Sensibile alla luce, grado analitico
MetanoloCarlo Erba41484Grado analitico
Smalto per unghie--Tampone
campioni Novex Tris-glicina SDS di tipo trasparente (2X)InvitrogenLC2676Grado analitico
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)InvitrogenNP0001Grado analitico
PageRuler Scala proteica prestainedThermo Fisher Scientific26616Grado analitico
Fenilmetansulfonilfluoruro Thermo Fisher Scientific36978Grado analitico
Soluzione salina tampone fosfatoSigma-AldrichP4417Grado analitico
Pierce 16% Formaldeide (p/v)Thermo Fisher Scientific28908
il dosaggio delle proteine BCA Piercealla luce Thermo Scientific23225Grado
analiticoReagente Pierce BCA A (contenente carbonato di sodio, bicarbonato di sodio, acido bicinchoninico e tartrato di sodio in idrossido di sodio 0,1 M)Thermo Scientific23228Parte dei kit di analisi delle proteine Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Reagente Pierce BCA B (contenente il 4% di solfato rameico)Thermo Scientific1859078Parte dei kit di analisi delle proteine Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Acido propionicoSigma-AldrichSet da cocktail di
inibitori della proteasi402907Calbiochem539134 Grado di coltura cellulare e tissutale
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936
Cloruro di sodio (NaCl)BioneerC-9025Grado analitico
Desossicolato di sodioSigma-AldrichD6750Grado analitico
Sodio dodecil solfatoSigma-Aldrich71736Grado molecolare
Idrossido di sodio (NaOH)BiosesangSR2018-100-00Grado analitico
Acqua tripla distillata-Soluzione salina ultrapura (tipo 1)
Tris-tamponataSigma-Aldrich94158Grado analitico
Tampone di trasferimento Tris-glicinaKoma BiotechK0341001Grado analitico
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006Grado analitico
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Grado molecolare
TripsinaThermo Fisher Scientific20233Grado per coltura cellulare
Tween 20Sigma-AldrichP9416Urea molecolare
Sigma-AldrichU5378Molecolare & grado per coltura cellulare
Puntali per pipette sfusi in Piastra per colture cellulari di di in acciaio inossidabile Pipetta sierologica per alle per colture cellulari Clarity per Kit per di grado analitico e sensibile di grado ACS III sensibile alla luce

Riferimenti

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