Isolamento e coltura di colangiociti primari da topi con malattia epatica policistica utilizzando un metodo di digestione in due fasi

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo di digestione ottimizzato in due fasi per isolare i colangiociti primari ad alta purezza e alta vitalità da topi wild-type e topi con malattia epatica policistica.

Abstract

In questo protocollo, abbiamo ottimizzato un metodo di digestione in due fasi per isolare i colangiociti primari ad alta purezza e alta vitalità da topi wild-type e topi con malattia epatica policistica (PLD). Dopo aver anestetizzato i topi, i fegati sono stati perfusi attraverso la vena cava inferiore con 50 ml di soluzione A, seguiti da 30 ml di soluzione B a 37 °C per digerire enzimaticamente il tessuto epatico. La dissociazione meccanica, l'agitazione e la microdissezione sono state eseguite per rimuovere le cellule parenchimali aderenti, lasciando intatto un albero biliare. L'albero biliare è stato poi finemente tritato e digerito agitando per 60 minuti a 37 °C. La sospensione a cellula singola risultante è stata raccolta utilizzando un filtro cellulare da 70 μm. I colangiociti sono stati purificati mediante isolamento immunomagnetico. La sospensione cellulare è stata incubata con un anticorpo anti-EpCAM in rotazione per 45 minuti a 4 °C, seguita dall'aggiunta di perline di proteina G e da un'ulteriore rotazione per altri 45 minuti a 4 °C. Dopo tre lavaggi con PBS, i colangiociti sono stati raccolti utilizzando un separatore magnetico. I colangiociti primari purificati sono stati risospesi in terreno di coltura per colangiociti e seminati su piastre di coltura cellulare rivestite con 1 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo I. La purezza dei colangiociti è stata confermata mediante immunocolorazione per il marcatore specifico dei colangiociti, la citocheratina-19 (CK19). Sebbene questo studio si sia concentrato sull'isolamento dei colangiociti primari da topi wild-type e PLD, siamo fiduciosi che il protocollo possa essere applicato anche ad altri modelli murini di malattia. Questo dettagliato metodo di digestione in due fasi facilita gli studi in vitro sulle colangiopatie e lo sviluppo di terapie mirate.

Introduzione

I colangiociti, le cellule epiteliali che rivestono l'albero biliare intraepatico, formano un monostrato e costituiscono circa il 3-5% della popolazione cellulare totale del fegato¹. Queste cellule si interconnettono all'interno del fegato per creare una complessa rete duttale tridimensionale². In condizioni normali, i colangiociti svolgono funzioni vitali, tra cui secrezione, assorbimento, riparazione delle lesioni e fungono da barriera immunitaria, svolgendo così un ruolo critico nella fisiologia e nella patologia epatica. Tuttavia, la disfunzione dei colangiociti può portare a varie malattie, tra cui PLD, colangite sclerosante primitiva, colangiocarcinoma e danno epatico colestatico ^3,4,5.

Tra le malattie correlate alla colangiopatia, la PLD si distingue come una malattia ereditaria caratterizzata dalla formazione di numerose cisti piene di liquido originate dai colangiociti. Il progressivo ingrossamento di queste cisti riduce significativamente la qualità della vita dei pazienti⁶. Le attuali opzioni terapeutiche per la PLD rimangono insufficienti, offrendo un'efficacia limitata e spesso associate ad alti tassi di recidiva e complicanze⁷. Ciò evidenzia l'urgente necessità di sviluppare strategie terapeutiche sicure ed efficaci per affrontare le richieste cliniche insoddisfatte nella gestione della PLD.

La ricerca sui meccanismi delle colangiopatie, compresa la PLD, è stata notevolmente ostacolata dalla mancanza di linee cellulari adeguate. Per affrontare questa limitazione, l'uso di modelli murini di malattia e l'isolamento di colangiociti primari da questi modelli per esperimenti in vitro si sono dimostrati preziosi per scoprire i meccanismi molecolari alla base delle colangiopatie e identificare potenziali strategie terapeutiche.

Nel nostro recente studio⁸, abbiamo stabilito con successo un modello murino PLD utilizzando topi knockout condizionali (KO) Pkd1. Le cisti epatiche sono state osservate già 1 mese dopo la delezione di Pkd1 e sono aumentate progressivamente di dimensioni nel tempo. Mentre i protocolli per isolare i colangiociti dai ratti e dagli esseri umani sono ben documentati ^9,10, l'isolamento dei colangiociti primari dai topi rimane particolarmente impegnativo a causa delle loro piccole dimensioni e dell'intricata architettura della vena porta e del sistema biliare. I metodi esistenti devono affrontare limitazioni significative, tra cui bassa purezza cellulare, scarsa vitalità, procedure complesse e costi elevati^11,12.

Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per isolare i colangiociti primari ad alta purezza dai topi utilizzando un metodo di digestione in due fasi. Questo approccio ottimizzato mira a supportare gli studi in vitro , facilitando lo studio dei meccanismi molecolari alla base delle colangiopatie e promuovendo lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali e di cura dei topi sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Tianjin (Doc. No: TMUa-MEC 2022016).

1. Preparazione delle attrezzature e delle soluzioni

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, pinze e manici di bisturi) in autoclave almeno 1 giorno prima dell'isolamento cellulare.
2. Almeno 1 giorno prima dell'isolamento cellulare, preparare il terreno di coltura dei colangiociti utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 1. Sterilizzare il terreno di coltura dei colangiociti filtrandolo attraverso un filtro da 0,22 μm.
3. Almeno 1 giorno prima dell'isolamento cellulare, preparare la Soluzione A e la Soluzione B utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 2 per la perfusione epatica di topo. Sterilizzare la soluzione A e la soluzione B in autoclave o filtrando attraverso un filtro da 0,22 μm e regolare il loro pH a 7,35 utilizzando NaOH sterile in agitazione delicata.
   NOTA: Il terreno di coltura dei colangiociti, la soluzione A e la soluzione B possono essere conservati a 4°C per almeno un mese.
4. Prima di iniziare l'esperimento, aggiungere la polvere di collagenasi II alla soluzione B e mescolare delicatamente per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mg/mL. Preriscaldare sia la soluzione A che la soluzione B in un bagno d'acqua a 37 °C prima dell'uso.
5. Immediatamente prima di iniziare l'esperimento, preparare piatti di 6 cm riempiti con PBS sterile e metterli sul ghiaccio per mantenerli freddi durante la procedura.

2. Perfusione della digestione del tessuto epatico

1. Anestetizzare il topo con un sovradosaggio di inalazione di isoflurano. Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina e fissarlo con del nastro adesivo per facilitare la procedura.
2. Aprire la cavità addominale del topo dopo aver sterilizzato l'addome con etanolo al 75% e poi, legare un nodo scorsoio attorno alla vena cava inferiore usando un ago pressato. Sciacquare un catetere endovenoso da 24 G con la soluzione A utilizzando una siringa da 20 ml.
3. Inserire il catetere endovenoso nella vena cava inferiore sotto il nodo scorsoio, fissare il nodo scorsoio e fissare il catetere in posizione con del nastro adesivo.
4. Perfondere il fegato con 50 mL di soluzione A attraverso la vena cava inferiore utilizzando una siringa da 20 mL e incidere la vena porta epatica per drenare la soluzione di perfusione. Mantenere la velocità di perfusione a 10 ml/min.
5. Continuare la perfusione con 30 mL di Soluzione B contenente collagenasi II a una velocità di flusso di 3,5 mL/min utilizzando una pompa peristaltica.
   NOTA: Questo passaggio è destinato alla digestione del tessuto epatico.
6. Rimuovere il tessuto epatico perfuso con successo e metterlo in un piatto di 6 cm riempito con PBS sterile freddo.

3. Isolamento dei colangiociti

NOTA: Poiché il numero di colangiociti nei topi normali è relativamente basso, si consiglia di utilizzare un gruppo di 2-6 topi per la procedura. Tuttavia, per i modelli murini di malattia con proliferazione anomala dei colangiociti, come la PLD, i colangiociti di un singolo topo sono sufficienti. Se non diversamente specificato, i campioni e i reagenti devono essere sempre conservati su ghiaccio e tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di sicurezza biologica.

1. Dissociare e scuotere meccanicamente il tessuto epatico utilizzando una pinza curva. Successivamente, eseguire la microdissezione al microscopio da dissezione per rimuovere le cellule parenchimali aderenti, lasciando intatto un albero biliare. Rimuovere il tessuto della cistifellea prima di procedere al passaggio successivo.
   Lavare il fazzoletto 2 volte con PBS.
2. Tritare finemente l'albero biliare utilizzando una lama chirurgica e digerirlo in 3 ml di soluzione digestiva (Tabella 3) per topo agitando (90 giri/min) a 37 °C per 60 minuti. Al segno dei 30 minuti, pipettare delicatamente la miscela utilizzando un puntale per pipetta per mescolare accuratamente.
   NOTA: La soluzione digestiva deve essere preparata al momento prima dell'uso.
3. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 5 ml o 10 ml per premere delicatamente la sospensione cellulare attraverso il colino. Lavare il colino con PBS.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare le celle 3 volte con mezzo RPMI.
5. Centrifugare nuovamente a 500 x g per 5 min a 4 °C.
6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 900 μL di terreno RPMI contenente 40 U/mL di DNasi I. Aggiungere 2 μg di anticorpo anti-EpCAM e incubare la sospensione su un rotatore (20 giri/min) a 4 °C per 45 min.
7. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C.
8. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI contenente 40 U/mL di DNasi I. Prelavare le perle di proteina G con 1 mL di terreno RPMI. Aggiungere 20 μL di perle di proteina G alla sospensione cellulare e incubare con rotazione (20 giri/min) a 4 °C per altri 45 minuti.
   NOTA: L'anticorpo anti-EpCAM può anche essere preincubato con perle di proteina G per creare un complesso anticorpo a perlina prima di introdurre la sospensione cellulare.
9. Lavare le celle 3 volte con PBS utilizzando un separatore magnetico.
10. Eseguire la conta cellulare e la valutazione della vitalità cellulare utilizzando la colorazione Trypan Blue (0,04%, 3 min) su un emocitometro.
    NOTA: Non è necessario rimuovere le perle dai colangiociti, si staccheranno naturalmente una volta iniziata la coltura e non interferiranno con la coltura cellulare.

4. Coltura dei colangiociti

NOTA: Preparare piatti freschi per colture cellulari rivestite di collagene con coda di ratto di tipo I prima della coltura dei colangiociti. Preraffreddare tutti i reagenti con ghiaccio.

1. Seguendo le istruzioni del produttore, mescolare ddH₂O sterile, 10x PBS, 1 N NaOH e collagene di coda di ratto di tipo I per ottenere una concentrazione finale di 1 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo I in 1x PBS. Rivestire uniformemente le piastre di coltura cellulare con la miscela e posizionare le piastre in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 30 minuti per consentire al collagene di solidificarsi.
2. Lavare le piastre per colture cellulari rivestite di collagene con coda di ratto di tipo I con PBS preriscaldato.
3. Risospendere i colangiociti in un terreno di coltura preriscaldato per colangiociti. Seminare la sospensione cellulare su piastre di coltura cellulare rivestite di collagene con coda di ratto di tipo I da 1 mg/mL e incubare a 37 °C con CO₂ al 5%. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni.

5. Passaging e crioconservazione dei colangiociti

1. Lavare i colangiociti due volte con PBS, quindi incubare le cellule in tripsina allo 0,25% a 37 °C per 5-10 minuti.
2. Aggiungere un volume uguale di terreno di coltura per colangiociti per neutralizzare la tripsina, quindi centrifugare a 500 x g per 5 minuti.
3. Preparare piastre per colture cellulari rivestite di collagene con coda di ratto di tipo I come descritto al passaggio 4.1.
4. Seguire i passaggi 4.2 e 4.3.
5. Se è necessaria la crioconservazione, risospendere i colangiociti in un terreno di conservazione (9:1 FBS: DMSO) e conservarli in un congelatore a -80 °C o in azoto liquido. Scongelare le celle secondo necessità per un uso futuro.

6. Validazione dei colangiociti

NOTA: La purezza dei colangiociti è stata valutata mediante colorazione per il marcatore dei colangiociti CK19.

1. Lavare i colangiociti 2 volte con PBS, quindi fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 15 minuti.
2. Lavare i colangiociti con PBS, quindi permeabilizzare le cellule con Triton X-100 all'1% per 8 minuti.
3. Lavare i colangiociti con PBS, quindi bloccare le cellule in BSA al 5% per 1 ora.
4. Lavare i colangiociti con PBS, quindi incubare le cellule con l'anticorpo primario contro CK19 (diluizione 1:12 con BSA al 2%) per una notte a 4 °C.
5. Lavare i colangiociti 2 volte con PBS, quindi incubare le cellule con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 anti-ratto d'asino (diluizione 1:1.000 con PBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare i colangiociti con PBS, colorare con 4',6-diamidino-2-fenilindolo per 15 minuti e osservare al microscopio.

Risultati

Il diagramma del flusso di lavoro per il processo di digestione in due fasi utilizzato per isolare i colangiociti è mostrato nella Figura 1. L'intera procedura dura ~5 ore. In primo luogo, il fegato viene perfuso con la soluzione A attraverso la vena cava inferiore per rimuovere il sangue, come indicato dal fegato che diventa pallido. Il fegato viene quindi perfuso con la soluzione B contenente collagenasi II per avviare la digestione dei tessuti. Questa fase...

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo dettagliato per isolare i colangiociti primari ad alta purezza dai topi utilizzando un processo di digestione in due fasi, consentendo lo studio dei meccanismi molecolari alla base delle colangiopatie. Diversi passaggi critici sono essenziali per garantire il successo dell'isolamento dei colangiociti.

Il primo passo critico è garantire un'efficace perfusione e digestione utilizzando la Soluzione A e la Soluzione B. Il succe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 μ m filter	PALL	4612
0,25% Tripsina	Gibco	25200-056
Siringa da 10 mL	KONSMED	10 mL 1,2*30TWLB
Siringa da 20 mL	KONSMED	20 mL 1,2*30TWLB
Catetere endovenoso da 24 G	WEGO	24GX19  mm/Y-G
3,3',5-triiodo-L-tironina	Sigma	T5516	1,7 mg/mL stock
4% paraformaldeide	Solarbio	P1110
siringa da 5 mL	KONSMED	5 mL 0,7*30TWLB
Piastre da 6 cm	Thermo Scientific	150462
70 &; filtro cellulare	Filtro Corning	352350
anticorpo anti-CK19	DSHB	TROMA-III
anticorpo anti-EpCAM	DSHB	G8.8
BSA	Solarbio	A8020
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	2 M stock
Concentrato lipidico chimicamente definito (100x)	Gibco	11905-031
Collagenasi II	Worthington	LS004176
Collagenasi XI	Sigma	C7657	3,2 mg/mL stock
Desametasone	Sigma	D1756	10 mg/mL stock
Microscopio da dissezione	Leica	EZ4
DMEM/F12 (1:1)	VivaCell biosciences	C3130-0500
DMSO	Sigma	D2650
DNase I	Sigma	D4513	10 U/μ L stock
Asino anti-ratto Alexa Fluor 488 anticorpo secondario	Invitrogen	A21208
EGTA	Solarbio	E8050	50 mM (PH = 8) stock
Fattore di crescita epidermico (1 mg/mL)	Sigma	SRP3196
Ethanolamine	Sigma	E9508
Siero fetale bovino	VivaCell biosciences	C04001-500
Forskolin	Sigma	F3917	20 mM stock
Gentamicina/amfotericina soluzione (500x)	Gibco	R01510
Emocitometro	QIUJING	XB. K.25.
HEPES	Sigma	H4034
Ialuronidasi	Sigma	H3506	10 mg/mL stock
Insulina-transferrina-selenio (100x)	Gibco	41400045
Isoflurano	RWD	R510-22-10
KCl	Sangon Biotech	A100395
L-Glutammina (200 mM)	Sigma	G7513
Separatore magnetico	Promega	Z5342
MEM aminoacidi non essenziali (100x)	Gibco	11140050
MEM soluzione vitaminica (100x)	Gibco	11120052
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1,5 M stock
Na Piruvato  (100 mM)	Gibco	11360070
Na2HPO4	Sangon Biotech	A600487
NaCl	Sangon Biotech	A610476
NaOH	Sangon Biotech	A620617	1 N stock
PBS	VivaCell biosciences	C3580-0500
PBS	Solarbio	P1010
Penicillina-Streptomicina (100x)	Gibco	15140-122
Pompa peristaltica	BaodingRongbai	YZ1515PPS
Protein G beads	Invitrogen	10004D
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
RPMI	VivaCell biosciences	C3010-0500
Inibitore della tripsina di soia	Sigma	T6522	10 mg/mL stock
Ago pressato	Jinhuan Medical	HM601
Triton X-100	Solarbio	T8200
Trypan blue	Sigma	T6146	10 mg/mL stock
Tipo I coda di ratto	collagene BD	354236