Articolo metodologico

Saggio immunochimico convalidato per la determinazione completa del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano rilasciato e legato alle cellule

DOI:

10.3791/68204

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9 maggio 2025

 ,  ,  , 
1SDS Optic S.A.

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un test ELISA sandwich convalidato utilizzando nuovi anticorpi monoclonali anti-HER2. Questo test consente una quantificazione precisa della proteina HER2 legata alle cellule e rilasciata da cellule in coltura in vitro e altri campioni, inclusi sangue e tessuti.

Abstract

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Il recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) è un marcatore tumorale ben consolidato. È diventato un bersaglio diagnostico e terapeutico di grande successo, specialmente nel cancro al seno e in altri tipi di cancro che esprimono HER2. In clinica, i metodi diagnostici immunoistochimici gold standard che impiegano gli anticorpi specifici anti-HER2 vengono utilizzati per misurare il livello di espressione del recettore legato alla membrana. Il dominio extracellulare solubile (ECD) di HER2 che viene rilasciato dalle cellule sovraesprimenti circola nel sangue e può riflettere l'espressione tissutale del recettore. Sono necessari dosaggi accurati e convalidati per correlare la concentrazione della proteina HER2 circolante con le manifestazioni cliniche della malattia.

Il nostro team ha sviluppato e convalidato il nuovo saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich (ELISA) per la quantificazione del dominio ECD di HER2 legato alla membrana e rilasciato dalle cellule. Il test utilizza due anticorpi monoclonali unici specifici per HER2 sviluppati in precedenza. L'intervallo di quantificazione include la concentrazione di HER2 da 1,56 a 100 ng/mL, che è prevista per le cellule tumorali coltivate in vitro e mostra una sensibilità a livello di 0,5 ng/mL. La soddisfacente precisione e accuratezza intra e inter-test del metodo lo rendono applicabile per la quantificazione di HER2 in vari tipi di campioni biologici, tra cui terreno di coltura cellulare, siero e tessuto tumorale solido. Qui, ci concentriamo sulla determinazione completa del recettore associato e secreto dalle cellule tumorali coltivate in vitro . L'articolo presenta un protocollo passo-passo per la quantificazione della proteina HER2 che può essere impiegato per testare una varietà di linee cellulari, sangue e tessuti.

Introduzione

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Il successo delle terapie moderne è spesso correlato alla medicina di precisione che si basa sull'identificazione accurata dei pazienti sensibili alla terapia1. Tra queste terapie ci sono i farmaci anti-HER2 che prendono di mira il recettore sovraespresso su una varietà di tumori, tra cui seno, endometrio, stomaco, polmone e altri. Sono disponibili diversi agenti mirati a HER2 con benefici confermati in pazienti con tumori HER2-positivi, incluso HER2-basso di tipo2. La conferma dello stato di HER2-positivo è fondamentale per l'identificazione dei potenziali pazienti che rispondono; tutta....

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Protocollo

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1. Coltura di cellule tumorali umane

  1. Colture di linee MDA-MB-231, SK-BR-3 e SK-OV-3 nel terreno Modified Eagle's di Dulbecco contenenti 4,5 g/L di ᴅ-glucosio (DMEM-HG), integrati con 2 mM di ʟ-glutammina e FBS inattivato termicamente al 10% (v/v). Incubare le colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.
  2. Quando la coltura raggiunge la confluenza di ~80%, staccare le cellule mediante tripsinizzazione e raccoglierle in provette coniche separate da 15 mL.
  3. Contare le cellule con un contatore automatico di cellule e seminare le cellule per l'esperimento in piastre a 12 pozzetti a una densità di 3 × 10

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Risultati

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Convalida ELISA a sandwich
Il test di nuova concezione richiede una procedura di convalida. I parametri di convalida importanti includono la linearità, la precisione e i limiti di rilevamento, ovvero il limite inferiore di rilevamento (LLOD) e il limite superiore di rilevamento. Nell'articolo precedente, abbiamo eseguito un'accurata convalida del metodo. La linearità dell'ELISA è stata testata utilizzando i campioni simulati per concentrazioni basse (2, 5, 10 ng/mL), medio-alte (30 ng/mL) e significat.......

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Discussione

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Tra i componenti critici nella costruzione di un ELISA a sandwich, ci sono gli anticorpi di cattura che vengono immobilizzati sulla piastra e contribuiscono alla specificità e alla sensibilità del saggio. Nel saggio presentato, abbiamo impiegato come anticorpo di cattura la nuova proteina monoclonale (HER2/70.27.58) generata e caratterizzata internamente. L'anticorpo aveva una sequenza unica della CDR (regione che determina la complementarità) e, in base all'affinità, presentava una sens.......

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Dichiarazioni

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D.L., A.A., A.M., M.S. dichiarano il sostegno finanziario di SDS Optic S.A.; A.A., A.M., M.S. dichiarano la proprietà azionaria di SDS Optic S.A.

Ringraziamenti

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Lo studio è stato sostenuto da un fondo del Centro Nazionale per la Ricerca e lo Sviluppo STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 e dall'UE, Horizon 2020 SME Instrument grant No. 783818.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di etichettatura della biotina-NH2AbnovaKA0003
Blotting Grade, latte in polvere, a basso contenuto di grassiRothT145.1
Vetrini per conteggio cellulare TC10/TC20 Contatore, PiastreBio-Rad145-0011
Biologix07-6012
Raschietti cellulariBiologix70-1250
CentrifugaOhaus30130868
Classe II Cabina di Sicurezza Biologica - Telstar Bio II Advance 6TelstarN/A
Piastre trasparenti a fondo piatto a 96 pozzettiThermo Fisher442404
Incubatori CO2 - Touch 190SLeecN/A
Dimetilsolfossido Sigma AldrichD2650
DMEM - alto glucosioSigmaAldrich D0822
Lettore di piastre ELISABioTek800TSUVI
FBS Standard, siero fetale bovinoPAN BiotechP30-19375
Essiccatore da laboratorio a circolazione forzataBINDER9090-0018
HRP-AvidinThermo Fisher43-4423
Proteina umana Her2 / ErbB2, etichetta Fc, grado premiumAcroBIOSYSTEMSHER2-H5253
Immunowash Microplate WasherBio-Rad170-7009
Soluzione di L-glutamminaSigma AldrichG7513
mAb a-HER2 (clone 70.21.73.67)SDS OpticBIO-ABH-2
mAb a-HER2 (clone 70.27.58)SDS OpticBIO-ABH-1
MDA-MB-231 Linea cellulareATCCHTB-26
NaHCO3POCH810530115
NaOHPOCHBA0981118
Inibitore della proteasi CocktailSigma AldrichP8340
RIPA BufferSigma AldrichR0278
ROTI Fair PBSRoth1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] Linea cellulareATCCHTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Linea cellulareATCCHTB-77
Soluzione di arresto 1xAbcamab210900
TC20 Contatore di celle automatizzatoBio-rad1450102
Substrato TMB 1xAbcamab210902
Tween-20Sigma AldrichP9416
VortexOhaus30392117
Agitatore di movimento ondulatorioOhaus30391968
per colture cellulari a doppia camera

Riferimenti

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  1. Subbiah, V., Kurzrock, R. Debunking the delusion that precision oncology is an illusion. Oncologist. 22 (8), 881-882 (2017).
  2. Swain, S. M., Shastry, M., Hamilton, E. Targeting HER2positive breast cancer: advances and future directions. Nat Rev Drug Discov. 22

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HER2 QuantificationSandwich ELISAImmunochemical AssayExtracellular Domain HER2Cell Bound HER2Released HER2Monoclonal AntibodiesCancer BiomarkerCell Lysate AnalysisCalibration Curve

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