Saggio immunochimico convalidato per la determinazione completa del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano rilasciato e legato alle cellule

Il successo delle terapie moderne è spesso correlato alla medicina di precisione che si basa sull'identificazione accurata dei pazienti sensibili alla terapia¹. Tra queste terapie ci sono i farmaci anti-HER2 che prendono di mira il recettore sovraespresso su una varietà di tumori, tra cui seno, endometrio, stomaco, polmone e altri. Sono disponibili diversi agenti mirati a HER2 con benefici confermati in pazienti con tumori HER2-positivi, incluso HER2-basso di tipo². La conferma dello stato di HER2-positivo è fondamentale per l'identificazione dei potenziali pazienti che rispondono; tuttavia, rimane una sfida, soprattutto nel gruppo HER2-basso.

I metodi gold standard in ambito clinico, utilizzati di routine per i test HER2, includono l'espressione proteica immunoistochimica (IHC) e l'amplificazione del gene HER2 mediante approcci di ibridazione in situ fluorescente (FISH). Inoltre, il test Oncotype DX viene utilizzato per l'espressione dell'mRNA di HER2. La biopsia tissutale necessaria per questi metodi rende incerta la determinazione dell'idoneità del paziente a un trattamento appropriato e della sua potenziale risposta alle terapie. Nonostante le linee guida aggiornate del 2018 dall'American Society of Clinical Oncology (ASCO) e dal College of American Pathologists (CAP) per ridurre la variabilità tra le unità di test, la concordanza di HER2 rimane un argomento di miglioramento³.

HER2 è un proto-oncogene membro della famiglia dei recettori del fattore di crescita epidermico (EGFR) la cui sovraespressione e attivazione negli stati patologici provoca un esito aggressivo o contribuisce a una prognosi infausta⁴. HER2 è una proteina modulare di 185 kDa ancorata nella membrana cellulare che contiene una tirosin-chinasi citoplasmatica e un dominio extracellulare (ECD). L'ECD HER2 può essere eliminato dalle cellule per essere rilasciato nella matrice extracellulare⁵ come proteina libera da cellule, circolando ulteriormente nel sangue. L'aumento dell'espressione di HER2 potrebbe essere riflesso dal livello più elevato dell'ECD circolante, presentando un prezioso marcatore predittivo e prognostico ^6,7, un marcatore surrogato della risposta al trattamento⁸ o come metodo complementare all'IHC per identificare i pazienti eleggibili al trattamento anti-HER2⁹. Tuttavia, la sfida rimane quella di stabilire la correlazione tra l'espressione tumorale di HER2 e il livello sistemico del recettore nel sangue che potrebbe avere un significato clinico.

L'ECD HER2 rilasciato può essere quantificato utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)¹⁰. L'ELISA a sandwich è un approccio che impiega due anticorpi specifici che legano epitopi diversi sullo stesso antigene bersaglio. Consente la misurazione accurata delle proteine solubilizzate nel materiale biologico a base di sangue e liquidi facilmente accessibile (la cosiddetta biopsia liquida). Nonostante la presenza di test approvati dalla Food and Drug Administration (FDA), c'è controversia sull'utilità della diagnostica HER2 ECD⁵ e sul valore di cut-off per un aumento del livello di HER2 nel sangue. Sono necessarie ulteriori ricerche con i metodi convalidati e le soglie uniformemente accettate per confermare l'applicabilità dei saggi¹¹.

I componenti critici di qualsiasi ELISA sono la cattura (immobilizzata sulla piastra e la definizione della specificità e della sensibilità del test) e la rilevazione degli anticorpi (aggiunti dopo l'applicazione dei campioni) (Figura 1). In questo rapporto, presentiamo il protocollo ELISA basato sui nuovi anticorpi monoclonali (mAb) anti-HER2 ECD recentemente sviluppati che sono stati generati, purificati su una colonna di affinità e accuratamente caratterizzati, e presentano sequenze uniche¹². L'ELISA sviluppato che impiega questi anticorpi personalizzati mostra la sua utilità per la quantificazione accurata della proteina HER2 associata alla membrana cellulare e rilasciata in un terreno di coltura per una valutazione completa dello stato del recettore. Il test può essere utilizzato nei test preclinici e per supportare la ricerca in corso. Le prestazioni del test sono state ulteriormente testate su campioni biologici di diversa origine, tra cui omogeneizzati di siero e tessuti¹², per mostrare il potenziale nello sviluppo di ricerca, diagnostica e nuovi trattamenti anti-HER2 in futuro.

1. Coltura di cellule tumorali umane

1. Colture di linee MDA-MB-231, SK-BR-3 e SK-OV-3 nel terreno Modified Eagle's di Dulbecco contenenti 4,5 g/L di ᴅ-glucosio (DMEM-HG), integrati con 2 mM di ʟ-glutammina e FBS inattivato termicamente al 10% (v/v). Incubare le colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂.
2. Quando la coltura raggiunge la confluenza di ~80%, staccare le cellule mediante tripsinizzazione e raccoglierle in provette coniche separate da 15 mL.
3. Contare le cellule con un contatore automatico di cellule e seminare le cellule per l'esperimento in piastre a 12 pozzetti a una densità di 3 × 10⁵ cellule/per pozzetto in 1 mL di terreno di crescita. Incubare le colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂.
   NOTA: Seminare un pozzetto per ogni punto temporale dell'esperimento. Sia il terreno di post-coltura che i lisati cellulari saranno utilizzati in ulteriori analisi.

2. Raccolta e preparazione dei campioni

1. Dalla coltura delle 24 ore, raccogliere il terreno di coltura da un pozzetto di ciascuna linea cellulare in una provetta da 1,5 mL.
2. Centrifugare i campioni raccolti a 10 000 × g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservarlo a -20 °C per determinare ulteriormente il livello di ECD HER2 secreto.
3. Lavare le cellule rimanenti sulla piastra con 1 mL di PBS freddo, aspirare delicatamente ed eliminare il PBS.
4. Aggiungere 200 μL di tampone RIPA (integrato con l'1% di inibitore della proteasi) in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti. Raschiare le cellule con il raschietto cellulare e mescolare pipettando più volte per omogeneizzare il lisato.
5. Raccogliere le cellule lisate in una nuova provetta e aspirare lentamente in una siringa da 2 ml con un ago (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Ripetere la fase di aspirazione 5-10 volte per disintegrare ulteriormente le cellule.
6. Centrifugare i campioni raccolti a 10 000 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservarlo a -20 °C per un'ulteriore determinazione della frazione legata alle cellule della proteina HER2.
7. Ripetere la raccolta del terreno di coltura e dei materiali cellulari, seguendo le fasi di preparazione per i restanti punti temporali - 48 ore e 72 ore di coltura.

3. Esecuzione di un ELISA a sandwich per la determinazione di HER2

1. Preparare i buffer.
   1. Tampone di rivestimento: Preparare la soluzione 0,1 M di NaHCO₃ sciogliendo 0,42 g di NaHCO₃ in 50 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente. Regolare il pH a 9,6 con 3 M NaOH.
   2. Tampone bloccante: Preparare il latte scremato al 5% (NFDM) in PBS aggiungendo 0,5 g di latte in polvere assorbente a 10 ml di PBS e mescolare accuratamente.
   3. Tampone di lavaggio: Preparare soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 (PBST) aggiungendo 0,5 mL di Tween-20 allo 0,05% a 1000 mL di PBS e mescolare (evitare un'eccessiva formazione di schiuma).
2. Biotinilato l'anticorpo rilevante.
   1. Biotinilato 50-200 μg di rilevamento dell'anticorpo anti-HER2 (clone 70.21.73.67) utilizzando un kit di marcatura della biotina commerciale secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: L'affidabilità e la ripetibilità del processo di biotinilazione si basano sulla misurazione della concentrazione proteica finale dell'anticorpo risultante e sul confronto tra lotti del prodotto.
3. Rivestire il piatto.
   1. Diluire l'anticorpo catturante anti-HER2 (clone 70.27.58) alla concentrazione di 1 μg/mL nel tampone di rivestimento. Per rivestire una piastra, utilizzare 6,5 mL della soluzione di anticorpi catturanti.
   2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μl della soluzione di anticorpi catturanti (preparata al punto 3.3.1) a ciascun pozzetto su una piastra ELISA a 96 pozzetti.
      NOTA: Evitare i pozzetti più esterni della piastra (ad es. A1, H12) per ridurre la variabilità causata dall'effetto bordo. I pozzetti più esterni devono essere riempiti con acqua distillata per garantire condizioni di reazione stabili.
   3. Coprire la piastra con una pellicola sigillante.
   4. Incubare la piastra per una notte (O/N) a 4 °C.
   5. Dopo l'incubazione O/N, posizionare la piastra a temperatura ambiente (RT) su un agitatore orizzontale per micropiastre (20-30 giri/min con un angolo di inclinazione di 4°-6°) per 1 ora.
   6. Utilizzando una lavatrice per micropiastre, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare la piastra tre volte con un tampone di lavaggio (3 x 300 μl di PBST per pozzetto).
4. Bloccare la piastra .
   1. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μL di tampone bloccante (5% NFDM in PBS) a ciascun pozzetto rivestito per bloccare i siti di legame non specifici.
   2. Coprire la piastra con una pellicola sigillante.
   3. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C in una camera di umidità.
   4. Utilizzando una lavatrice per micropiastre, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare la piastra tre volte con un tampone di lavaggio (3 x 300 μl di PBST per pozzetto).
5. Preparare una curva di calibrazione e un controllo positivo (Figura 2).
   1. Preparare la soluzione standard di lavoro dell'antigene HER2 aggiungendo 2 μL di soluzione madre da 1 mg/mL a 1998 μL di PBS per ottenere una concentrazione di HER2 di 0,001 mg/mL (1000 ng/mL).
   2. Diluire la soluzione standard di lavoro (WSS) aggiungendo 200 μl della soluzione a 1800 μl di PBS per ottenere la soluzione standard 1 (STD 1).
   3. Preparare i successivi sei standard (STD 2-STD 7) mediante diluizioni seriali di STD 1 in PBS (Figura 2).
      1. STD 2: aggiungere 500 μl di STD 1 a 500 μl di PBS e mescolare accuratamente per preparare 50 ng/mL.
      2. STD 3: Aggiungere 500 μL di STD 2 a 500 μL di PBS e mescolare accuratamente per preparare 25 ng/mL.
      3. STD 4: Aggiungere 500 μl di STD 3 a 500 μl di PBS e mescolare accuratamente per preparare 12,5 ng/mL.
      4. STD 5: aggiungere 500 μl di STD 4 a 500 μl di PBS e mescolare accuratamente per preparare 6,25 ng/mL.
      5. STD 6: aggiungere 500 μl di STD 5 a 500 μl di PBS e mescolare accuratamente per preparare 3,125 ng/mL.
      6. STD 7: Aggiungere 500 μl di STD 6 a 500 μl di PBS e mescolare accuratamente per preparare 1,5625 ng/mL.
      7. STD 8: Aggiungere 500 μL di PBS per preparare 0 ng/mL.
   4. Controllo positivo: diluire STD 1 aggiungendo 100 μL della soluzione STD 1 a 900 μL di PBS per ottenere una soluzione di HER2 a una concentrazione proteica di 10 ng/mL.
6. Preparare i campioni per gli esperimenti di spike e recupero.
   1. Preparare i campioni di matrice (PBS, lisati cellulari e terreno di coltura) addizionati con la concentrazione nota della proteina HER2. Diluire i lisati cellulari 1:2000 aggiungendo 2,5 μL di lisato cellulare appropriato a 5 mL di PBS per ottenere una matrice di campione con un livello di HER2 inferiore al LOD del metodo.
   2. Utilizzare WSS (1000 ng/mL) e STD1 (100 ng/mL) per aumentare i campioni della matrice.
   3. Per ogni matrice, preparare 6 campioni con concentrazioni di 0, 2, 5, 10, 30 e 50 ng/mL.
   4. Per preparare 0 ng/mL, aggiungere 400 μL di PBS/terreno di coltura/lisato cellulare.
   5. Per preparare 2 ng/mL, aggiungere 8 μL di STD1 a 392 μL di PBS/terreno di coltura/lisato cellulare e mescolare accuratamente.
   6. Per preparare 5 ng/mL, aggiungere 20 μL di STD1 a 380 μL di PBS/terreno di coltura/lisato cellulare e mescolare accuratamente.
   7. Per preparare 10 ng/mL, aggiungere 4 μL di WSS a 396 μL di PBS/terreno di coltura/lisato cellulare e mescolare accuratamente.
   8. Per preparare 30 ng/mL, aggiungere 12 μL di WSS a 388 μL di PBS/terreno di coltura/lisato cellulare e mescolare accuratamente.
   9. Per preparare 50 ng/mL, aggiungere 20 μL di WSS a 380 μL di PBS/terreno di coltura/lisato cellulare e mescolare accuratamente.
7. Aggiungere il campione, lo spazio vuoto e lo standard.
   1. Utilizzando una pipetta a canale singolo, aggiungere 100 μl di standard, bianco (PBS) e campioni testati (lisati cellulari e terreno di coltura) ai pozzetti appropriati.
      NOTA: Si consiglia di eseguire ogni campione in triplice copia.
   2. Coprire la piastra con una pellicola sigillante.
   3. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C in una camera di umidità.
   4. Utilizzando una lavatrice per micropiastre, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare la piastra tre volte con un tampone di lavaggio (3 x 300 μl di PBST per pozzetto).
8. Rileva il legame degli anticorpi.
   1. Diluire l'anticorpo rivelatore biotinilato (clone 70.21.73.67) in PBS a una concentrazione di lavoro di 1 μg/mL. Per una piastra, utilizzare 6,5 mL di soluzione di lavoro per l'anticorpo rilevante.
   2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μl della soluzione di lavoro dell'anticorpo di rilevamento a ciascun pozzetto.
   3. Coprire la piastra con una pellicola sigillante.
   4. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C in una camera di umidità.
   5. Utilizzando una lavatrice per micropiastre, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare la piastra tre volte con un tampone di lavaggio (3 x 300 μl di PBST per pozzetto).
9. Aggiungere il coniugato Avidin-HRP.
   1. Diluire il coniugato Avidin-HRP disponibile in commercio 1:40.000 aggiungendo 1 μL di coniugato enzimatico a 40 mL di PBST.
   2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μl di coniugato diluito a ciascun pozzetto.
   3. Coprire la piastra con una pellicola sigillante.
   4. Incubare la piastra per 1 ora a 37 °C in una camera di umidità.
   5. Utilizzando una lavatrice per micropiastre, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare la piastra tre volte con un tampone di lavaggio (3 x 300 μl di PBST per pozzetto).
10. Reazione colorimetrica
    1. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μL di substrato di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) a ciascun pozzetto.
    2. Coprire la piastra con una pellicola sigillante.
    3. Incubare la piastra per 1-5 minuti a 37 °C al riparo dalla luce e monitorare lo sviluppo del colore.
    4. Quando il colore raggiunge il livello previsto, aggiungere 100 μL di soluzione di arresto per terminare la reazione.
       NOTA: Il livello atteso corrisponde a un colore blu intenso nei pozzetti contenenti campioni con un'alta concentrazione dell'analita.
11. Acquisisci e analizza i dati.
    1. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
    2. Utilizzando una curva di calibrazione a 4 parametri, calcolare la concentrazione del campione in base all'equazione della curva.

Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro ELISA a sandwich anti-HER2 sviluppato. Panoramica delle fasi chiave della procedura ELISA a sandwich. Questi includono le fasi critiche (evidenziate da una cornice rossa) come il rivestimento della piastra con l'anticorpo anti-HER2 70.27.58, l'aggiunta di campioni (standard di curva, bianco, campioni sperimentali dei lisati cellulari o del terreno di coltura) e il legame dell'anticorpo anti-HER2 70.21.73.67. Il test si conclude con il rilevamento del segnale e l'analisi dei dati, in cui il segnale colorimetrico viene quantificato utilizzando un lettore di micropiastre per determinare la concentrazione dell'antigene target. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Schema che presenta la preparazione delle soluzioni standard della curva di calibrazione. Le diluizioni seriali della proteina ricombinante HER2 sono preparate per generare una curva di calibrazione in un intervallo di concentrazione di 1,56-100 ng/mL (fiale STD 1-STD 7). Inoltre, è incluso il campione di controllo negativo senza la proteina HER2 (STD 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Convalida ELISA a sandwich
Il test di nuova concezione richiede una procedura di convalida. I parametri di convalida importanti includono la linearità, la precisione e i limiti di rilevamento, ovvero il limite inferiore di rilevamento (LLOD) e il limite superiore di rilevamento. Nell'articolo precedente, abbiamo eseguito un'accurata convalida del metodo. La linearità dell'ELISA è stata testata utilizzando i campioni simulati per concentrazioni basse (2, 5, 10 ng/mL), medio-alte (30 ng/mL) e significativamente aumentate (50 ng/mL) dell'antigene diluito in PBS e altre matrici importanti per la quantificazione di HER2, come il siero. La Figura 3 mostra la tipica curva di calibrazione. Come è stato determinato, l'intervallo di lavoro del test ELISA a sandwich sviluppato era di 1,56-100,0 ng/mL di proteina HER212.

Figura 3: Curva standard rappresentativa e dati di calibrazione per ELISA a sandwich. Viene presentata la cinetica di legame di HER2 nell'intervallo di concentrazione della curva standard di 1,56-100 ng/mL. I risultati sono espressi come assorbanza a 450 nm dopo la sottrazione di fondo. La figura include una tabella che riassume i parametri dell'adattamento logistico a quattro parametri, tra cui l'equazione di polimerizzazione, il valore R2 e i punti di calibrazione chiave utilizzati per derivare la curva standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il coefficiente di variazione per la precisione intra-test ha restituito valori inferiori al 10%, mentre per l'inter-test era inferiore al 25%, calcolato per almeno 12 test. È stato confermato che il LLOD è pari a 0,5 ng/mL, indipendentemente dalla matrice testata (PBS, siero, terreno di coltura)12.

Successivamente, l'accuratezza del metodo, così come l'effetto matrice, sono stati valutati in esperimenti di spike e recupero. Sono state testate diverse matrici, tra cui PBS (come riferimento), terreno di coltura e lisati cellulari addizionati con la quantità nota di proteina HER2. A causa dell'elevato contenuto di analiti nei lisati cellulari, sono stati pre-diluiti prima dell'spikeing per acquisire una matrice di campione con un livello di HER2 inferiore al LOD del metodo. I risultati sono stati in linea con l'intervallo di recupero accettato dell'80%-120% nella maggior parte dei casi, con deviazioni considerevoli per i campioni a bassa concentrazione e il lisato cellulare SK-OV-3 (Tabella 1).

Tabella 1: Il saggio di spike e recupero per diverse matrici biologiche. Il livello di Spike rappresenta la concentrazione ricombinante di HER2 nelle matrici derivate da cellule MDA-MB-231 e SK-OV-3 e il terreno di coltura corrispondente. Il recupero viene calcolato in base alla media sperimentale e al livello di HER2 in un diluente a curva standard (PBS). La diluizione di una particolare matrice è fornita tra parentesi.

Determinazione di HER2 in lisati cellulari e terreni di coltura cellulare
L'ELISA sviluppato è stato impiegato per la quantificazione della proteina HER2 nelle cellule. Il terreno delle cellule MDA-MB-231, SK-BR-3 e SK-OV-3 in coltura e i lisati cellulari corrispondenti sono stati testati in tre diversi momenti durante l'esperimento di coltura, ovvero 24, 48 e 72 ore dopo la semina. Le diluizioni fino a 1:500 sono state effettuate per campioni di lisato cellulare per ottenere risultati che si adattassero all'intervallo di lavoro del saggio. I risultati ottenuti sono riassunti nella Figura 4. È stato notato un aumento dipendente dal tempo del livello di HER2 per ogni serie di esperimenti di diverse linee cellulari. I livelli di concentrazione più elevati sono stati ottenuti per tutti i campioni raccolti a 72 ore, dimostrando che l'ECD HER2 viene espulso dalla membrana cellulare e si accumula nel terreno di coltura alla concentrazione da 12,6 ng/mL fino a 145,7 ng/mL. È interessante notare che il terreno di coltura cellulare conteneva concentrazioni 1 000 volte inferiori dell'antigene testato (forma solubile) rispetto alla proteina legata alla membrana presente nei lisati a cellule intere, con conseguente concentrazione più bassa di 3,7 μg/mL (MDA-MB-231) fino a 17,2 μg/mL (SK-BR-3) nei campioni raccolti a 24 ore, mentre a 72 ore ha mostrato da 14,0 μg/mL fino alla concentrazione massima di 22,9 μg/mL per le stesse rispettive linee cellulari. Negli esperimenti, abbiamo utilizzato tipi cellulari noti per l'elevata sovraespressione della proteina HER2 (SK-OV-3, SK-BR-3) e cellule con bassa espressione fisiologica di questo marcatore (MDA-MB-231). Come previsto, l'ELISA a sandwich ha confermato una concentrazione di HER2 circa 10 volte e 50 volte superiore nel terreno di coltura delle cellule SK-OV-3 e SK-BR-3, rispettivamente, rispetto alle cellule MDA-MB-231 quando analizzate al timepoint di 24 ore. Allo stesso modo, abbiamo notato circa 3 volte e 5 volte più di HER2 nei lisati cellulari SK-OV-3 e SK-BR-3, rispettivamente, rispetto alle cellule MDA-MB-231. Anche i risultati ottenuti per le cellule coltivate per 48 ore e 72 ore hanno mostrato lo stesso modello. I coefficienti di variazione calcolati per i campioni testati sono in buon accordo con i dati di convalida (mostrati sopra le barre nella Figura 4).

Figura 4: Valutazione del livello di HER2 nelle cellule tumorali umane utilizzando il test ELISA a sandwich. Le misurazioni sono state eseguite su terreno di coltura (A) e lisati cellulari (B) raccolti a 24 ore, 48 ore e 72 ore. Le concentrazioni di HER2 (ng/mL) sono calcolate come media di 3 repliche. Il coefficiente di variazione (CV%) tra le repliche è presentato sopra ogni barra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

D.L., A.A., A.M., M.S. dichiarano il sostegno finanziario di SDS Optic S.A.; A.A., A.M., M.S. dichiarano la proprietà azionaria di SDS Optic S.A.