Articolo metodologico

Generazione di colture monoclonali da linea cellulare JW18 di Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia

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DOI:

10.3791/68207

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27 giugno 2025

 , 
1Institute of Environmental Sciences, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Doctoral School of Exact and Natural Sciences, Jagiellonian University, 3Department of Evolution, Ecology and Behaviour, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool

In questo articolo

Sommario

Le linee cellulari sono utili negli studi su organismi intracellulari che non possono essere coltivati al di fuori delle loro cellule ospiti. Sebbene le linee infettate da Wolbachia abbiano permesso molte scoperte, l'eterogeneità all'interno di queste linee può portare a risultati sperimentali variabili. Presentiamo un protocollo per la generazione di cloni di singole cellule e colture continue da cellule JW18 infettate da Wolbachia.

Abstract

Le linee cellulari sono modelli ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Sono particolarmente utili negli studi sui batteri intracellulari che non possono essere propagati in modo efficiente al di fuori degli organismi ospiti. Wolbachia, un simbionte intracellulare di molti invertebrati, induce forti effetti riproduttivi e antivirali nei suoi insetti ospiti. Le cellule di insetto infettate da Wolbachia sono state ampiamente utilizzate per studiare i fenotipi di Wolbachia. Tuttavia, queste linee cellulari sono spesso costituite da popolazioni miste di cellule con fenotipi e risposte potenzialmente variabili ai trattamenti sperimentali. In particolare, è stato riportato che le linee cellulari con Wolbachia mostrano tassi di crescita variabili e una prevalenza variabile dell'infezione da Wolbachia da un passaggio all'altro. Per rimediare a questo, abbiamo generato linee cellulari monoclonali dalla linea cellulare JW18 derivata da Drosophila melanogaster infettata da Wolbachia. Queste linee clonali sono state stabilite in tempi diversi e mostrano diversi stati di infezione da Wolbachia. Questa variabilità suggerisce che qualsiasi trattamento applicato a una popolazione di genitori JW18 potrebbe portare alla selezione di sottopopolazioni invece di influenzare la fisiologia dell'intera cultura. Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di cloni di singole cellule e colture clonali continue da cellule di insetti infettate da Wolbachia, consentendo esperimenti più controllati e riproducibili.

Introduzione

Le cellule di Drosophila melanogaster sono ampiamente utilizzate negli studi genetici, nella ricerca sulle malattie e come piattaforma per lo screening di farmaci ad alto rendimento1. Sono anche utili nello studio di uno dei microbi intracellulari più diffusi sul pianeta: Wolbachia. Wolbachia è un batterio intracellulare obbligato gram-negativo che si trova nel 40-70% delle specie di insetti 2,3,4, dove si diffonde per via materna e induce manipolazioni riproduttive 5,6,7,8. Wolbachia può anche fornire agli ospiti infetti una protezione antivirale 9,10,11,12,13,14,15 che, insieme alle manipolazioni riproduttive, viene sfruttata per controllare la trasmissione dell'arbovirus dalle zanzare all'uomo 16,17. In vari sistemi, Wolbachia ha dimostrato di controllare l'apoptosi18, fornire nutrienti essenziali19 e alterare l'espressione genica e proteica 20,21,22,23,24,25.

Le linee cellulari sono emerse come modello per studiare Wolbachia a causa della loro semplice biologia, convenienza e capacità di propagarsi in grandi quantità. Le linee cellulari si sono dimostrate utili nel pre-adattare Wolbachia alla simbiosi con nuovi ospiti26 e nel consentire a Wolbachia di accumulare mutazioni27,28. Sono stati utilizzati per lo screening dei composti anti-Wolbachia, che possono essere utili nel trattamento delle malattie filariali29 e per studiare l'interazione traduzione Wolbachia-ospite 30. Sebbene le linee cellulari siano indispensabili negli studi sulle simbiosi di Wolbachia 29,30,31, i meccanismi alla base della maggior parte dei fenotipi di Wolbachia rimangono sconosciuti. Ciò suggerisce che il sistema modello di coltura cellulare può ancora essere migliorato.

Le linee cellulari di insetti infettate da Wolbachia derivano da embrioni e larve di insetti. Aa23, derivato da embrioni di Aedes albopictus, è stata la prima linea stabile infetta da Wolbachia 32, successivamente utilizzata per molti studi sulla simbiosi di Wolbachia 33,34,35. La linea cellulare JW18 è stata una delle prime linee naturalmente infettate da Wolbachia generate da D. melanogaster29,36. Questa linea, derivata da 1 h a 15 h di embrioni dimoscerini infetti da Mel, è servita anche come fonte di Wolbachia per altre linee cellulari di Drosophila: 1182-4H e S2R+37. Poiché gli embrioni hanno un'alta percentuale di cellule pluripotenti, adattandosi a crescere nella plastica, possono acquisire nuove caratteristiche, a volte diverse per le singole linee cellulari. Questo può spiegare l'eterogeneità delle morfologie cellulari e le frequenze di infezione da Wolbachia osservate in queste cellule in qualsiasi momento e nel corso delle generazioni29.

La diversità cellulare all'interno della coltura di JW18 solleva preoccupazioni, poiché gli studi sulle linee cellulari di zanzara, come Aag2, hanno dimostrato che le linee cellulari monoclonali e parentali possono rispondere in modo diverso ai trattamenti a causa delle variazioni nelle caratteristiche cellulari38. Di conseguenza, la somministrazione di trattamenti a una popolazione di cellule miste potrebbe produrre risultati fuorvianti. Per studiare la risposta di una popolazione cellulare omogenea a un trattamento (non la selezione per i singoli tipi di cellule), abbiamo generato colture monoclonali dalla linea cellulare JW18 parentale. Non sono stati fatti precedenti tentativi di generare colture monoclonali da queste cellule. Il protocollo prevede l'isolamento di singole cellule dalla linea cellulare JW18 dei genitori, seguito dal loro mantenimento e trasferimento in fiasche per stabilire colture clonali continue. Abbiamo controllato lo stato di infezione da Wolbachia delle singole linee, dimostrando che differiscono in questa caratteristica chiave. Le colture cellulari omogenee sono fondamentali per garantire l'accuratezza e la riproducibilità degli esperimenti futuri.

Protocollo

NOTA: Tutti i lavori con cellule vive e i loro terreni devono essere eseguiti in una cabina di sicurezza biologica per evitare contaminazioni.

1. Preparazione dei terreni

  1. Preparare un terreno di coltura fresco integrando il terreno di coltura Shield e Sang Insect con il 10% di siero fetale bovino (FBS).
  2. Media esauriti e condizionati
    1. Coltiva le cellule JW18 in un pallone da 25 cm2 contenente terreno fresco Shield e Sang Insect integrato con il 10% di FBS a 25 °C. Incubare fino a quando le cellule raggiungono la confluenza (~1 settimana).
    2. Filtrare il terreno di coltura cellulare esaurito di 1 settimana utilizzato per far crescere le cellule, per rimuovere Wolbachia, detriti cellulari e altri contaminanti: utilizzare un filtro sterile da 5 μm e quindi un filtro sterile da 0,2 μm montato su una siringa da 50 ml.
    3. Preparare il terreno condizionato integrando il terreno fresco con il 20% del terreno esaurito. Preparare una quantità sufficiente di terreno condizionato per una piastra a 96 pozzetti (~30 mL); utilizzando una pipetta sierologica, miscelare 6 mL del terreno esausto filtrato con 24 mL di terreno fresco Shield e Sang Insect integrato con il 10% di FBS.

2. Preparazione della piastra a 96 pozzetti

  1. Preparazione della sospensione cellulare JW18
    1. Raschiare le cellule da un pallone confluente di 1 settimana usando un raschietto cellulare e risospenderle usando una pipetta sierologica.
    2. Contare le cellule utilizzando una camera Neubauer e diluirle con terreno condizionato per ottenere una concentrazione finale di 2 x 103 cellule/mL.
  2. Aggiunta di terreno condizionato alla piastra
    1. Trasferire il terreno condizionato preparato in un serbatoio di reagenti.
    2. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μl di terreno condizionato a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti, ad eccezione del pozzetto A1.
  3. Diluizione seriale della sospensione cellulare
    1. Aggiungere 200 μl della sospensione cellulare al pozzetto A1.
    2. Utilizzando una pipetta monocanale, trasferire 100 μl dal pozzetto A1 al pozzetto B1 e mescolare delicatamente (evitare bolle) come nella Figura 1A.
    3. Ripetere la diluizione seriale lungo la colonna 1, scartando gli ultimi 100 μl dall'ultimo pozzetto.
  4. Diluizione su tutta la piastra
    1. Aggiungere 100 μl di terreno condizionato a ciascun pozzetto della prima colonna, per un volume totale di 200 μl. Mescolare delicatamente.
    2. Utilizzando la pipetta multicanale, trasferire 100 μl dalla prima colonna alla seconda. Mescolare delicatamente.
    3. Ripetere questo processo per tutte le colonne (1-12) della piastra (Figura 1A).
    4. Dopo la risospensione, scartare 100 μl dall'ultima colonna. A questo punto, ogni pozzetto contiene 100 μL di sospensione cellulare.
    5. Aggiungere altri 100 μl di terreno di coltura a tutti i pozzetti, portando il volume finale in ciascun pozzetto a 200 μl.

3. Identificazione di singole celle

  1. Coprire la piastra, sigillarla con Parafilm ed etichettarla in modo appropriato.
  2. Osservare la piastra al microscopio, controllando attentamente ogni pozzetto per verificare la presenza di singole cellule (Figura 1B). Assicurati di scansionare accuratamente i pozzetti e i bordi per confermare la presenza di una sola cella.
    NOTA: questo è uno dei passaggi più critici del protocollo.
  3. Registrare il numero di singole celle su una mappa a 96 pozzetti (su carta).
    NOTA: È più probabile che singole celle si trovino nei pozzetti verso destra e verso il fondo della piastra.
  4. Una volta identificate e marcate le singole cellule, conservare la piastra in un incubatore a 25 °C. Monitorare le celle ogni 2 giorni.

4. Manutenzione e trasferimento delle celle

  1. Monitoraggio cellulare
    NOTA: Le cellule JW18 impiegano in genere 3 giorni per iniziare a dividersi da una singola cellula e le popolazioni clonali possono crescere a ritmi diversi (Figura 2).
    1. Monitorare i pozzetti ogni 2-3 giorni per verificare la presenza di contaminazioni batteriche e per assicurarsi che il terreno non si sia asciugato. Se i pozzetti sembrano asciugarsi, rabboccarli con terreno fresco secondo necessità.
  2. Espansione cellulare
    1. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza nella piastra a 96 pozzetti, trasferirle in una piastra a 24 pozzetti (Figura 1D).
    2. Successivamente, trasferire le celle in una piastra a 6 pozzetti e infine in un pallone (Figura 1E, F).
      NOTA: Questa espansione graduale aumenta la probabilità di stabilire una linea cellulare clonale continua.
  3. Congelamento cellulare
    1. Una volta stabilita una coltura clonale, congelare una parte delle cellule per un uso futuro.
      1. Raschiare le cellule dal pallone utilizzando un raschietto per cellule e trasferirle in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 °C.
      2. Preparare un mezzo di congelamento 2x (Shield e Sang Insect Medium integrati con il 20% di FBS e il 10% di DMSO).
      3. Dopo la centrifugazione, scartare parte del surnatante, lasciando metà del volume finale desiderato. Aggiungere un volume uguale del mezzo di congelamento 2x al surnatante rimanente e risospendere delicatamente il pellet utilizzando una pipetta.
      4. Aliquotare 1 mL di sospensione in ogni 1,5 mL di crioviale e mettere i flaconcini sul ghiaccio. Conservare i flaconcini a -80 °C per una notte, quindi trasferirli in un serbatoio di azoto liquido il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.

5. PCR per confermare lo stato di Wolbachia

  1. Estrarre il DNA dai campioni di coltura monoclonale utilizzando il metodo fenolo-cloroformio39.
    1. Porre 1 mL di cellule confluenti raschiate e risospese in terreno in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare le cellule a 290 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante (terreno di coltura cellulare) e posizionare la provetta sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 250 μl di soluzione A, che consiste in 0,1 M Tris HCl (pH 9,0), 0,1 M EDTA e 1% SDS. Risospendere le cellule e incubare a 70 °C per 30 minuti in un blocco riscaldante.
    3. Dopo l'incubazione, aggiungere 35 μl di acetato di potassio 8 M, agitare delicatamente la provetta (evitare vortici) e incubare su ghiaccio per altri 30 minuti.
    4. Centrifugare a 13.000 giri/min per 15 minuti a 4 °C, trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere un volume uguale di fenolo-cloroformio. Agitare bene e centrifugare di nuovo, ripetendo questo passaggio una volta.
    5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, quindi aggiungere 150 μl di isopropanolo, agitare e centrifugare a 10.000 giri/min per 5 minuti. Rimuovere con cura il surnatante, lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 13.000 giri/min.
    6. Dopo aver essiccato il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente, risospenderlo in 100 μL di tampone TE. Quantificare il DNA e conservarlo a -20 °C.
  2. Eseguire una PCR convenzionale con il DNA estratto dai campioni di coltura monoclonale per rilevare Wolbachia utilizzando la master mix DreamTaq Green PCR. Utilizzare i primer wsp 81F e wsp 691R40 per Wolbachia e Drosophila, i primer rpl32 41 per il controllo di qualità del DNA.
    1. Aggiungere 7,5 μl di master mix, 0,5 μl di ciascun primer a 10 μM, 1 μl di DNA diluito 1:50 e 5,5 μl di acqua di grado molecolare per ottenere 15 μl della miscela di reazione.
    2. Utilizzare il seguente programma PCR: 94 °C per 4 min, 30 cicli x (94 °C per 40 sec, 55 °C per 40 sec, 72 °C per 30 sec), 72 °C per 10 min. Dopo la PCR, conservare i campioni a 4 °C.
  3. Eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio in un gel di agarosio al 2% in tampone TAE a 90 V con i prodotti PCR ottenuti per visualizzare le bande. Aggiungi una scala del DNA accanto per identificare le bande per wsp (632 bp) e rpl32 (194 bp).

6. Colorazione FISH per visualizzare l'infezione da Wolbachia in linee cellulari

  1. Eseguire l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) come descritto nel protocollo FISH Stellaris per le cellule aderenti per colorare Wolbachia con il set di sonde FISH 16s rRNA marcate Quasar 670. Colorare gli acidi nucleici con Hoechst 33342.
    NOTA: Questo set di sonde è stato progettato sulla base della sequenza dirDNA w Mel 16S e corrisponde al set di sonde pubblicato in Schneider et al.42 (vedi Tabella supplementare S1).
    1. Preparare i reagenti (tampone di fissazione, tampone di ibridazione, tampone di lavaggio A e B, set di sonde personalizzate ricostituite) seguendo le istruzioni del produttore43.
    2. Coltivate le cellule aderenti su un vetro di copertura rotondo da 18 mm sterilizzato al 70% con etanolo in una piastra di coltura a 24 pozzetti. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza desiderata, aspirare il terreno di coltura e lavare con 1 mL di 1x PBS. Aggiungere 1 mL di tampone di fissazione e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare le cellule due volte con 1 mL di 1x PBS.
    3. Permeabilizzare immergendo il vetrino coprioggetto con cellule in 1 mL di etanolo al 70% e incubare per una notte a 4 °C; Conservare i campioni in etanolo a questa temperatura per un massimo di 1 settimana prima dell'ibridazione. Aspirare l'etanolo e aggiungere 1 mL di Wash Buffer A; Incubare a temperatura ambiente per 2-5 minuti.
    4. Preparare una camera umidificata mettendo un tovagliolo di carta saturo d'acqua e uno strato di Parafilm in un piatto di coltura da 150 mm. Pipettare 100 μL di tampone di ibridazione contenente 1 μL di sonda da 12,5 μM sul Parafilm. Capovolgere delicatamente il vetro di copertura, posizionando le cellule con il lato rivolto verso il basso sulla goccia del tampone di ibridazione. Coprire e sigillare la camera con Parafilm, quindi incubare al buio a 37 °C per almeno 4 ore (fino a 16 ore se necessario).
    5. Dopo l'ibridazione, trasferire con cautela le celle di vetro di copertura in un pozzetto fresco contenente 1 mL di tampone di lavaggio A e incubare a 37 °C per 30 minuti. Aspirare il tampone e aggiungere 0,5 μl di 20 mM di stock Hoechst a 700 μl di tampone di lavaggio A; incubare a 37 °C per 30 minuti al buio.
    6. Rimuovere la soluzione Hoechst e aggiungere 1 mL di Wash Buffer B; Incubare a temperatura ambiente per 2-5 minuti. Infine, posizionare una piccola goccia (10 μL) di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio e montare le celle di vetro di copertura con il lato rivolto verso il basso sulla goccia. Eliminare delicatamente il mezzo di montaggio in eccesso e sigillare il perimetro del vetro di copertura con smalto trasparente.
    7. Conservare i vetrini a 4 °C e procedere all'imaging il prima possibile.
    8. Elaborare le immagini utilizzando ImageJ44. Dividi i canali e modifica la tavolozza dei colori secondo necessità.

Risultati

Abbiamo visualizzato il processo di creazione di colture monoclonali con la microscopia ottica dal giorno della preparazione della sospensione e della placcatura a singola cellula (giorno 0) fino alla creazione di linee cellulari continue (giorno 45 o 77, Figura 2). I primi segni di divisione cellulare sono stati osservati il giorno 3 (4 giorni dopo la piastratura, poiché la piastratura è stata eseguita il giorno 0) quando c'erano già quattro cellule per pozzetto (Figura 2). Il giorno 14, i cloni sono cresciuti come un monostrato (JW18-B9, C7 ed E5) o una sfera (JW18-G4), che è stata interrotta durante il passaggio. Il giorno 28, le differenze nella crescita tra le linee cellulari erano più evidenti. La coltura JW18-C7 era confluente il giorno 45, mentre le restanti colture clonali si sono stabilite solo al giorno 77. Abbiamo anche visualizzato le quattro diverse colture 30 passaggi dopo l'insediamento per catturare le differenze nelle morfologie cellulari (Figura 3).

Per determinare lo stato di infezione da Wolbachia delle colture monoclonali, abbiamo condotto PCR (Figura 4) e FISH (Figura 5). Abbiamo osservato che tutti i cloni tranne uno (JW18-C7) hanno prodotto una banda per il gene wsp , indicativo di un'infezione da Wolbachia . La FISH ha confermato i risultati della PCR: i cloni JW18-B9, JW18-E5 e JW18-G4 hanno mantenuto l'infezione da Wolbachia , mentre il clone JW18-C7 non aveva Wolbachia. Complessivamente, da una popolazione di cellule miste di JW18, siamo stati in grado di stabilire quattro colture clonali, tre delle quali hanno mantenuto l'infezione originale di Wolbachia . I dati grezzi sono accessibili all'indirizzo Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.

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Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di colture monoclonali. (A) Diluizioni primarie e secondarie nella piastra a 96 pozzetti. (B) Singole celle dopo la diluizione seriale. (C-E) Progressione nella moltiplicazione delle cellule e trasferimento da piastra a 96 pozzetti a piastra a 24 e 6 pozzetti, rispettivamente. (F) Colture continue in matracci per colture cellulari da 25 cm2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Progressione delle linee clonali JW18 da coltura a cellula singola a coltura multicellulare. Immagini in campo chiaro di linee clonali dal giorno 0 (giorno della piastratura) al giorno 77, quando tutte le linee sono state stabilite con successo in un pallone di coltura cellulare da 25 cm2 . Barre della scala = 25 μm (giorno 0), 50 μm (giorno 3), 150 μm (giorno 14), 300 μm (giorni 28, 45, 77). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Morfologia delle singole linee clonali JW18. Immagini in campo chiaro di linee clonali che mostrano morfologie cellulari al passaggio 30 dopo l'insediamento. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Stato di Wolbachia delle colture clonali esaminate mediante PCR. PCR per Wolbachia nella linea cellulare parentale JW18 e nelle linee clonali JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 e JW18-G4 al passaggio 11 dopo l'istituzione. La banda di Wolbachiawsp conferma la presenza di Wolbachia, mentre la banda di Drosophilarpl32 è una PCR per il controllo di qualità del DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Stato di Wolbachia delle colture clonali esaminate da FISH. Linea cellulare parentale JW18 e cloni JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 visualizzati mediante colorazione FISH al passaggio 13 dopo l'insediamento. Wolbachia è colorato con la sonda 16s rRNA Stellaris FISH marcata con Quasar 670 impostata in magenta e gli acidi nucleici sono colorati con Hoechst 33342 in ciano. Barre di scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare S1: Sonde oligonucleotidiche progettate contro l'rDNA di Wolbachia wMel 16S e loro confronto con le sonde pubblicate da Schneider et al.42. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Qui descriviamo un metodo standardizzato per generare cloni unicellulari dalla linea cellulare JW18 D.melanogaster, che può essere applicato ad altre linee cellulari di Drosophila e insetti. Il protocollo prevede la diluizione seriale di una sospensione cellulare preparata su una piastra a 96 pozzetti per isolare le singole cellule. Queste cellule vengono quindi incubate in condizioni ottimali per stabilire colture continue. Il protocollo include anche l'aggiunta del 20% di terreni condizionati per promuovere la sopravvivenza cellulare e la divisione di singole cellule45,46.

Un passaggio critico del protocollo consiste nella verifica della presenza di una singola cellula in ciascun pozzetto dopo la diluizione seriale. Questo passaggio richiede un'attenzione meticolosa, in quanto è essenziale per la buona riuscita dell'intero protocollo. Per facilitare la futura conferma dell'origine della singola cellula, si consiglia di acquisire immagini dei pozzetti selezionati da varie angolazioni.

Un altro passaggio chiave prevede il trasferimento di cellule tra i piatti di coltura. Per garantire il successo dell'instaurazione di una coltura continua, le cellule devono essere trasferite solo dopo aver raggiunto la confluenza. Se la crescita cellulare ristagna per più di due settimane, il raffreddamento del terreno può favorire un'ulteriore crescita. Il trasferimento prematuro di cellule prima della confluenza può provocare la morte cellulare.

Sebbene questo protocollo richieda più tempo e manodopera rispetto ad altri metodi comunemente usati, come la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)38,46, offre diversi vantaggi. Questi includono l'economicità, il rischio minimo di danni alle cellule, l'assenza di marcatori fluorescenti, apparecchiature costose e tempi di ottimizzazione. Nel complesso, questo protocollo è adatto per generare popolazioni omogenee di cellule di insetti da linee cellulari continue.

Proprietà delle colture monoclonali

I nostri risultati mostrano che le colture monoclonali differiscono in termini di velocità di insediamento e stato di infezione da Wolbachia (Figura 2, Figura 4 e Figura 5). Il clone JW18-C7 privo di Wolbachia è stato il più veloce a raggiungere la confluenza nel nostro protocollo di isolamento a singola cellula. Wolbachia potrebbe essere sempre stato assente da questo lignaggio cellulare, o potrebbe essere andato perso a causa dell'incapacità di tenere il passo con il tasso di divisione della cellula ospite. Potrebbe anche essere andato perso a causa della bassa densità cellulare iniziale nel nostro protocollo di clonazione. Tuttavia, poiché ciò non è accaduto per le altre linee cellulari clonali, lo riteniamo improbabile. L'infezione sperimentale di JW18-C7 con Wolbachia (insieme ad altri cloni trattati con tetraciclina) potrebbe rispondere se questa linea è permissiva nei confronti del simbionte.

L'eterogeneità cellulare non è unica per la linea cellulare JW18 ed è stata riportata in precedenza per altre linee cellulari infettate da Wolbachia 32,47,48,49,50,51,52. Un precedente tentativo di miglioramento ha comportato il trasferimento di Wolbachia da uova di D. simulans o cellule Aa23 a una linea cellulare C7-10 di A. albopictus 53. Il C7-10 è stato clonato molti anni prima dei trasferimenti di Wolbachia 54,55 e i trasferimenti non costituiscono l'infezione naturale che intendiamo studiare.

La differenza nello stato di infezione di Wolbachia e nel momento di insediamento della coltura monoclonale (indicativa delle differenze nel tasso di divisione cellulare) per i singoli cloni JW18 può avere profonde implicazioni per studi precedenti che collegano il titolo di Wolbachia e il tasso di crescita delle cellule degli insetti in risposta a trattamenti specifici. Il numero alterato di cellule, la densità dei simbionti o i cambiamenti nell'espressione genica dopo il trattamento potrebbero derivare dalla selezione di tipi di cellule con proprietà specifiche piuttosto che da cambiamenti nello stato di tutte le cellule in una popolazione mista. La somministrazione di trattamenti a una popolazione cellulare mista con la variabilità delle caratteristiche chiave può quindi produrre risultati distorti e non riproducibili.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo William Sullivan (University of California, Santa Cruz, USA), Laura Serbus (Florida International University, USA) e Luis Teixeira (Universidade Católica Portuguesa, Lisbona, Portogallo) per la linea cellulare JW18 e per gli utili suggerimenti su come lavorare con essa. Siamo grati a Nidhi Krishna Shrivastava (Università Jagellonica, Cracovia, Polonia) per gli utili suggerimenti sul protocollo. Ringraziamo Yuliya Chykunova (Università Jagellonica, Cracovia, Polonia) per la correzione delle bozze del manoscritto.

La Figura 1 è stata creata con BioRender (Chrostek, E. (2024) https://BioRender.com/o69b306).

Questo lavoro è supportato da ERC Starting Grant (Grant Agreement ID: 101040311) assegnato a EC e da una borsa di dottorato della Doctoral School of Exact and Natural Sciences (Jagiellonian University) assegnata a NF. Le opinioni e le opinioni espresse sono, tuttavia, solo quelle degli autori e non riflettono necessariamente quelle dell'Unione Europea o dell'Agenzia Esecutiva del Consiglio Europeo della Ricerca. Né l'Unione europea né l'autorità che concede l'aiuto possono essere ritenuti responsabili per tali questioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m siringa fliter   TPP99722Sterile
10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)ThermoFisher Scientifico70011044Sterile
Vetro di copertura rotondo da 12 o 18 mm Qualsiasi marca
Provette Falcon da 15 mLGenoplasto601052Sterile
Piastra a 24 pozzettiCytoOneCC7682-7524Coltura tissutale trattata
5 µ m filtro per siringheWhatman10462000Sterile
Piastra a 6 pozzettiCytoOneCC7682-7506Coltura tissutale trattata
piastra a 96 pozzettiCytoOneCC7682-7596Coltura tissutale trattata
AgarosioThermoFisher ScientificoJ66501.30
Pallone per colture cellulari, 25 cm2Greiner Bio-one391-3103Sterile
Raschiatori cellulari Greiner Bio-one391-3010Sterile
Smalto trasparente Qualsiasi marca
Fiale CryoPureSarstedt72.379Sterile
DMSO, grado per colture cellulariMerckD2650-100MLSterile
DreamTaq PCR Master MixThermoFisher ScientificoK1081
EDTAMerckCodice 324503-100GMSterile
Alimentazione per elettroforesiMerckPS 251-2
Eppendorf  Concentratore PlusMerckEP5305000509Al suo posto è possibile utilizzare concentratori sottovuoto di qualsiasi marca.
EtanoloMerck1009861000
Sistema di imaging EVOS M5000ThermoFisher ScientificoAMF5000Il microscopio invertito di qualsiasi marca può essere utilizzato per monitorare la progressione del clone. Per visualizzare i pesci è necessario un microscopio a fluorescenza.
Siero fetale bovinoMerckF9665Inattivato a caldo
Formaldeide ThermoFisher ScientificoCodice 047377.9L
Formamide MerckF7503-100ML
Serbatoi per elettroforesi su gelMannaia scientificaMSMIDI
Termocamera per gelBioRad12009077Sistema di imaging GelDoc Go Gel
GeneRuler 100 bp Scala del DNAThermoFisher ScientificoSM0243
Blocco riscaldanteThermoFisher Scientifico88870005
Cabina di sicurezza biologica Herasafe 2025 Classe IIThermoFisher Scientifico51033314Le cappe di sicurezza biologica di qualsiasi marca possono essere utilizzate purché mantengano un ambiente sterile all'interno.
Hoechst 33342 Soluzione (20 mM) 5 mLThermoFisher Scientifico62249Conservare al buio.
Acido cloridricoMerck258148-2.5L
Integra Biosciences Corp  PIPETBOY acu 2 Aiuto per pipetteFisher ScientificoNC0085686È possibile utilizzare un pipettatore sierologico di qualsiasi marca.
IsopropanoloMerckI9516-1L
Congelatore da laboratorio  Liebherr LGUex 1500 MediLineQualsiasi congelatore in grado di mantenere una temperatura costante è adatto.
Serbatoio di azoto liquidoThermoFisher ScientificoCY50985
Vetrini per microscopioMerckCLS294875X25-72EA
Acqua di grado molecolare
Pipetta multicanaleEppendorf3125000036
NanogocciaPeqlabND-1000
Emocitometro NeubauerMerckBR717810-1EA
Parafilm  M Pellicola sigillanteMerckHS234526B-1EA
Incubatrice raffreddata a PeltierMemmertIPP55plusQualche incubatrice in grado di mantenere costante 25? C è adatto. Non è richiesto alcun controllo CO2 per la linea cellulare JW18 o i suoi cloni.
Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1)ThermoFisher Scientifico327115000
Set di pipetteEppendorfEP2231300008
Acetato di potassioMerckP1190-500GSterile
Quasar Sonda 16s rRNA FISH con 670 tag  mettereTecnologie di bioricercaSu misura, le sequenze delle sonde possono essere trovate nella Tabella 1.
Microcentrifuga refrigerataRete di laboratorioC2500-R
rpl32 innesco in avanti 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'Genomica EurofinsRealizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo
rpl32 innesco inverso 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'Genomica EurofinsRealizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo
SDSThermoFisher ScientificoAM9823Sterile
Pipette sierologicheCorning357771
Scudi e Sang M3 Insect MediumMerckS8398Sterile
Tampone di ibridazione Stellaris RNA FISH   Tecnologie di bioricercaSMF-HB1-10Sterile
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A     Tecnologie di bioricercaSMF-WA1-60Sterile
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B     Tecnologie di bioricercaSMF-WB1-20Sterile
Serbatoi di reagenti sterili ThermoFisher Scientifico8094Sterile
tampone TAEMerck10617410001x 
Tampone TE Merck93283Sterile
TermociclatoreSyngen BiotechBlocco termico 96Al suo posto è possibile utilizzare un termociclatore di qualsiasi marca.
Base trisMerck10708976001Sterile
Congelatore a bassissima temperaturaSocietà PHC in MDF-DU502VH-PEQualsiasi congelatore da laboratorio in grado di mantenere -80 ? C può essere usato.
Vectashield Montaggio Medio     Laboratori VectorH-1000-10
innesco wsp avanti 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'Genomica EurofinsRealizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo
innesco wsp inverso 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'Genomica EurofinsRealizzato su misura sulla base del riferimento citato nell'articolo

Riferimenti

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