Qui, introduciamo un protocollo per l'utilizzo di substrati di lievito visualizzati sulla superficie per saggi di modifica enzimatica. La piattaforma è stata dimostrata utilizzando l'analisi dell'attività di defosforilazione della tirosina fosfatasi SHP-2 contro uno dei suoi substrati come saggio di modifica enzimatica rappresentativa.
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Articolo metodologico
Modifica enzimatica e citometria a flusso: valutazione delle proteine visualizzate sulla superficie del lievito
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La visualizzazione della superficie del lievito è una strategia di collegamento genotipo-fenotipo che consente lo screening ad alto rendimento della funzione proteica. Tradizionalmente, il display della superficie del lievito è stato applicato all'evoluzione di nuove proteine leganti, con la citometria a flusso utilizzata per valutare e ordinare in base ai livelli di forza di legame. Recentemente, c'è stato un crescente interesse nell'applicazione del display di superficie del lievito per lo screening di modifiche enzimatiche di varianti di substrato, con modifiche additive (ad esempio, fosforilazione) o sottrattive (ad esempio, proteolisi) che forniscono un fenotipo leggibile mediante citometria a flusso. Tali modifiche vengono regolarmente applicate utilizzando la co-localizzazione intracellulare, ma la capacità di ottenere modificazioni enzimatiche extracellulari dei substrati visualizzati potrebbe aprire molte più reazioni allo studio. Qui, descriviamo le tecniche per la progettazione e l'applicazione di saggi di screening per la modifica enzimatica extracellulare ai substrati candidati visualizzati sulla superficie del lievito e la successiva valutazione mediante analisi di citometria a flusso. Forniamo questi protocolli nel contesto delle fosfatasi defosforilanti dei lieviti sottoposti a substrati contenenti residui di tirosina fosforilata e commentiamo come questo quadro applicato possa essere adattato allo sviluppo di saggi di screening per altre coppie enzima-substrato.
Introduzione
La comprensione delle interazioni tra gli enzimi e i loro bersagli è diventata un'area di ricerca sempre più interessante a causa della sua necessità nella caratterizzazione biologica delle vie che controllano l'omeostasi cellulare e lo sviluppo della malattia 1,2. Gli enzimi sono responsabili della catalisi di molte delle reazioni che mantengono la vita biologica, controllando percorsi necessari come il metabolismo cellulare 3,4, la segnalazione5 e persino processi fondamentali come la riparazi....
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Protocollo
1. Crescita cellulare di plasmidi di lievito e induzione dell'espressione proteica
- Seguendo la ricetta descritta nella Tabella 1, preparare i terreni necessari per la crescita di lieviti non contenenti plasmidi (YPD), la crescita di cellule di lievito contenenti plasmidi (SD-CAA) e l'induzione dell'espressione proteica (SRG-CAA), nonché le piastre SD-CAA.
- Trasformare il DNA plasmidico del lievito contenente la coppia chinasi-substrato in cellule di lievito EBY-100 attraverso il metodo30,31 basato sui cationi di litio, comunemente adottato per l'uso nei ki....
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Risultati
L'analisi della citometria a flusso da una replica individuale del nostro sistema modello incubato per 2 ore senza (Figura 1A) e con (Figura 1B) 1.000 nM SHP-2 rivela una differenza di fosforilazione mediana del 63,6%, che è definita come il rapporto tra la mediana dell'asse Y (fosforilazione) di tutti gli eventi visualizzati sulla superficie meno il segnale di fosforilazione basale definito come la mediana dell'asse Y degli eventi non visualizzati tra il campio.......
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Discussione
Il protocollo presentato consente l'analisi delle interazioni enzimatiche utilizzando la visualizzazione extracellulare delle proteine sulla superficie del lievito. L'incorporazione del sequestro del reticolo endoplasmatico nel plasmide surface-display utilizzato introduce la capacità di analizzare extracellulari interazioni specifiche tra enzimi e substrati modificati post-traduzionali a causa delle interazioni intracellulari che possono essere progettate per verificarsi
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo lavoro da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un premio NSF CAREER a L.A.S. (CBET - 2339172) e da fondi di avvio dalla University of South Florida.
Nella Figura 2A, l'icona microtube-open-translucent di Servier https://smart.servier.com/ è sotto licenza CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. Le modifiche includono l'aggiunta di tampone e una cellula di lievito (a sinistra) e l'aggiunta di anticorpi (al centro a destra).
La provetta, l'incubatore e il citometro a flusso nella Figura 2A sono stati forniti tramite www.bioicons.com ad....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bottiglie da 1 l | Corning | 06-414-1D | |
| 1,7/2,0 mL Microprovette | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 & micro; L Punte per pipette SureOne | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| 1000 µ L Punte per pipette SureOne | Fisher Scientific | 02-707-408 | |
| Provette a fondo tondo in polistirene da 12 mL | Greiner | 07-000-212 | |
| Cuvette in plastica da 3 mL | MARCA | 759076D | |
| 300 &; L Punte per pipette SureOne | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipette sierologiche da 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Caseina acida (acidi Casaimino) | Fisher Scientific | BP-1424-500 | |
| Mettler Toledo | 30243397 | ||
| Piastra di Petri batteriologica | Cabine di biosicurezza Corning | Falcon 351008 | |
| Biospettrometro Labconco | Logic Classe II, tipo A2 302310102 | ||
| Eppendorf | Kinetic 6136000010 | ||
| Albumina sierica bovina | Fisher Bioreagenti | BP1600-100 | |
| Acido citrico | Fisher Scientific | A940-500 | |
| Citometria a flusso CytoFLEX Analizzatore | Beckam Coulter | Cytoflex C09745 | CytExpert software |
| Destrosio | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Ditiotreitolo | Fisher bioreagenti | BP172-5 | |
| Asino anti-capra FITC | Invitrogen | A16000 | |
| EDTA | Alfa Aesar | H56165.30 | |
| Ez-Link PEG4-NHS-Biotina | Thermo Scientific | A39259 | |
| Kit di trasformazione del lievito Frozen EZ II | Zymo Research | T2001 | |
| Galattosio | Fisher Scientific | BP656-500 | |
| Frigorifero per uso generico | Marvel Scientific | MS24RAS4RW | |
| Anticorpo anti-myc tag di capra | Centrifuga a mictrotubo Bethyl | A190-104A | |
| Eppendorf | 5425 R 5406000313 | ||
| Mini incubatrice refrigerata a bassa temperatura | Fisher Scientific | 15-015-2632 | |
| Anticorpo anti-fosfotirosina di topo 4G10 | BioXcell | BE0194 | |
| Parafilm M | Bemis | M PM999 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Fisher bioreagenti | BP399-500 | |
| Pipette Controller | Eppendorf | easypet 3 4430000018 | |
| Raffinosio | Thermo Scientific | J21060-36 | |
| Proteina attiva SHP-2 umana ricombinante | R& D Systems | 1894-SH | |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5910 R | |
| Saccharomyces cerevisiae lievito ceppo di visualizzazione della superficie EBY 100 | ATCC | MYA-4941 | |
| Incubatore per agitatore | Eppendorf | M1335-0002 New Brunswick Innova 42 | |
| Set di pipette a canale singolo | Eppendorf | 05-403-151 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Citrato di sodio diidrato | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Fosfato di sodio eptaidrato bibasico | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Fosfato di sodio monobasico monoidrato | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Streptavidina Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S32357 | |
| Bilancia a caricamento dall'alto | Mettler Toledo | ||
| Tris cloridrato | EMD Millipore | 648317-100GM | |
| Rotatore per revolver a tubo | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| Carta per pesare | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| Lievito a base di azoto | BD Difco | 291940 | |
| Zeba Spin Colonne di desalinizzazione | Termo Scientifico | 89883 |
Riferimenti
- Lea, M. A., Weber, G. Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids. J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).
- Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. Genetics of e....
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Ristampe e permessi
