Modifica enzimatica e citometria a flusso: valutazione delle proteine visualizzate sulla superficie del lievito

Sommario

Qui, introduciamo un protocollo per l'utilizzo di substrati di lievito visualizzati sulla superficie per saggi di modifica enzimatica. La piattaforma è stata dimostrata utilizzando l'analisi dell'attività di defosforilazione della tirosina fosfatasi SHP-2 contro uno dei suoi substrati come saggio di modifica enzimatica rappresentativa.

Abstract

La visualizzazione della superficie del lievito è una strategia di collegamento genotipo-fenotipo che consente lo screening ad alto rendimento della funzione proteica. Tradizionalmente, il display della superficie del lievito è stato applicato all'evoluzione di nuove proteine leganti, con la citometria a flusso utilizzata per valutare e ordinare in base ai livelli di forza di legame. Recentemente, c'è stato un crescente interesse nell'applicazione del display di superficie del lievito per lo screening di modifiche enzimatiche di varianti di substrato, con modifiche additive (ad esempio, fosforilazione) o sottrattive (ad esempio, proteolisi) che forniscono un fenotipo leggibile mediante citometria a flusso. Tali modifiche vengono regolarmente applicate utilizzando la co-localizzazione intracellulare, ma la capacità di ottenere modificazioni enzimatiche extracellulari dei substrati visualizzati potrebbe aprire molte più reazioni allo studio. Qui, descriviamo le tecniche per la progettazione e l'applicazione di saggi di screening per la modifica enzimatica extracellulare ai substrati candidati visualizzati sulla superficie del lievito e la successiva valutazione mediante analisi di citometria a flusso. Forniamo questi protocolli nel contesto delle fosfatasi defosforilanti dei lieviti sottoposti a substrati contenenti residui di tirosina fosforilata e commentiamo come questo quadro applicato possa essere adattato allo sviluppo di saggi di screening per altre coppie enzima-substrato.

Introduzione

La comprensione delle interazioni tra gli enzimi e i loro bersagli è diventata un'area di ricerca sempre più interessante a causa della sua necessità nella caratterizzazione biologica delle vie che controllano l'omeostasi cellulare e lo sviluppo della malattia ^1,2. Gli enzimi sono responsabili della catalisi di molte delle reazioni che mantengono la vita biologica, controllando percorsi necessari come il metabolismo cellulare ^3,4, la segnalazione⁵ e persino processi fondamentali come la riparazione del genoma ^6,7. A causa del loro ruolo in questi processi, le loro interazioni svolgono anche un ruolo nello sviluppo di molte malattie, poiché le deviazioni nella loro attività possono causare una grave disregolazione dell'attività cellulare, causando apoptosi o proliferazione di cellule tumorali dannose². Lo studio dell'attività enzimatica ha avuto importanti applicazioni nello sviluppo di nuove terapie ^8,9, che richiedono saggi personalizzati per ogni specifica interazione enzima-substrato¹⁰. Saggi enzimatici multipli sono stati stabiliti come protocolli standard per la valutazione e la caratterizzazione di queste interazioni. I saggi sviluppati per analizzare le interazioni enzimatiche sono classificati in saggi di rilevamento che monitorano il legame per l'attivazione/inibizione¹¹ o saggi che monitorano la modifica del substrato da parte degli enzimi¹².

Uno dei ruoli principali degli enzimi è la regolazione del comportamento cellulare. La trasduzione del segnale, la risposta intracellulare di una cellula a un innesco extracellulare¹³, è responsabile della sopravvivenza e della funzionalità cellulare. La proliferazione cellulare, la differenziazione e molti altri processi funzionali coinvolgono tutti vie di segnalazione con interazioni enzimatiche che le governano^14,15. Gli enzimi catalizzano le modificazioni post-traduzionali, che spesso modulano le massicce reti di segnalazione responsabili della corretta trasmissione dei messaggi extracellulari¹⁶. La fosforilazione delle proteine è la più comune modificazione post-traduzionale, ubiquitaria nella segnalazione cellulare e in molte altre vie cellulari. Di conseguenza, le protein chinasi sono emerse come una percentuale significativa di potenziali bersagli terapeutici a causa del loro ruolo regolatore critico¹⁷. Le fosfatasi sono le molecole modulatorie naturali per i complessi di segnalazione cellulare a base di fosfato^18,19, avendo la capacità di rimuovere i residui di fosfato dalle loro proteine bersaglio²⁰. Nell'ultimo decennio, le fosfatasi sono diventate un importante bersaglio terapeutico per il trattamento del cancro²¹ e delle malattie infiammatorie²² sulla base del loro coinvolgimento nella regolazione delle vie di segnalazione a valle in diversi tipi di cellule. Insieme, le protein chinasi e le fosfatasi forniscono un'ampia gamma di interazioni, che possono essere studiate attraverso lo sviluppo di specifici protocolli di analisi enzimatica.

Il display della superficie del lievito è stato utilizzato come strumento per la caratterizzazione e la valutazione dell'attività enzimatica^23,24. Fornisce una piattaforma ad alto rendimento per lo screening dei processi di modificazione post-traduzionale se combinata con strategie di sequestro del reticolo endoplasmatico^25,26. Ciò consente alle coppie chinasi-substrato di essere co-localizzate e trattenute nel reticolo endoplasmatico attraverso il legame con i recettori KDEL²⁷, dove la fosforilazione del substrato può avvenire a velocità maggiori a causa della vicinanza tra le chinasi e i loro bersagli. Il legame con il recettore KDEL è mediato da una sequenza di ritenzione del reticolo endoplasmatico FEHDEL C-terminale che ha dimostrato di avere una capacità di ritenzione più forte rispetto ad altre sequenze HDEL^25,28. Il substrato fosforilato viene quindi ancorato alla superficie del lievito per la sua successiva valutazione attraverso la citometria a flusso²⁹. Attualmente, non esistono protocolli generalizzabili stabiliti per la modifica enzimatica dei substrati visualizzati sulla superficie del lievito. Ampliamo le capacità di visualizzazione della superficie del lievito sfruttando le varianti del substrato fosforilato espresse extracellulare e modificandole attraverso la defosforilazione da parte della loro fosfatasi nota. L'analisi di citometria a flusso fornisce quindi una piattaforma per la valutazione fenotipica dei suddetti substrati attraverso la misurazione delle alterazioni della fosforilazione mediana come conseguenza dell'incubazione con la fosfatasi nota. Ciò fornisce un metodo adattabile per la modifica post-traduzionale delle proteine visualizzate sulla superficie, fornendo anche un metodo per l'analisi delle modifiche enzimatiche delle interazioni quando si utilizza la piattaforma di visualizzazione della superficie del lievito.

Presentiamo tecniche per lo sviluppo e l'applicazione di un saggio di modificazione enzimatica che descrive l'introduzione di un'interazione chinasi-substrato nella piattaforma di visualizzazione della superficie del lievito, la co-incubazione del substrato fosforilato espresso con una fosfatasi ricombinante e la successiva analisi dell'attività di defosforilazione attraverso la citometria a flusso. In questo rapporto, ciò si ottiene co-localizzando il dominio citoplasmatico del CD28 con la chinasi linfocitaria (LCK) nel reticolo endoplasmatico del lievito, seguito dalla visualizzazione del CD28 fosforilato sulla superficie del lievito e dalla successiva defosforilazione da parte della fosfatasi-2 contenente il dominio di omologia Src 2 (SHP-2). Un anticorpo anti-fosfotirosina pan (in questo studio, 4G10), che rileva residui di tirosina fosforilata in un'ampia varietà di sequenze peptidiche, viene utilizzato per la quantificazione del livello di fosforilazione in funzione del trattamento con fosfatasi. Il processo dettagliato fornisce un approccio generalizzabile per studiare le interazioni enzima-substrato; Un modo prospettico di studiare enzimi e substrati in modo purificato.

Protocollo

1. Crescita cellulare di plasmidi di lievito e induzione dell'espressione proteica

1. Seguendo la ricetta descritta nella Tabella 1, preparare i terreni necessari per la crescita di lieviti non contenenti plasmidi (YPD), la crescita di cellule di lievito contenenti plasmidi (SD-CAA) e l'induzione dell'espressione proteica (SRG-CAA), nonché le piastre SD-CAA.
2. Trasformare il DNA plasmidico del lievito contenente la coppia chinasi-substrato in cellule di lievito EBY-100 attraverso il metodo^30,31 basato sui cationi di litio, comunemente adottato per l'uso nei kit di trasformazione del lievito di una varietà di produttori.
   NOTA: L'elettroporazione³² o altre tecniche di trasformazione plasmidico di lievito preferite possono essere utilizzate a seconda del costrutto plasmidico da trasformare.
3. Preparare una provetta di coltura da 14 mL con 10 mL di terreno YPD. Inoculare le cellule EBY-100 e farle crescere in un incubatore agitatore a 30 °C, 300 giri/min fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica (OD_{600 nm}) di 0,8-1,0 (8 x 10⁶- 1 x 10⁷ cellule/mL).
   NOTA: Il diametro esterno_{di 600 nm} viene misurato preparando cuvette per campioni da 3 mL contenenti diluizioni 1:10 di colture di lievito nei rispettivi terreni e cuvette bianche da 3 mL contenenti i terreni utilizzati per le diluizioni dei campioni. Il programma OD_600nm sullo spettrofotometro viene utilizzato per misurare prima la cuvetta bianca, quindi ogni cuvetta campione impostando la diluizione corrispondente preparata per ciascun campione. 1 OD_600nm corrisponde a 1 × 10⁷ lievito/mL.
4. Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 1.000 x g per 3 minuti e lavare con la^1a soluzione di lavaggio fornita nel kit di trasformazione del lievito, o TE (10 mM Tris-HCl e 1,0 mM EDTA)³¹.
5. Pellettare nuovamente le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e risospendere in 1 mL del tampone di trasformazione fornito nel kit di trasformazione del lievito o in acqua sterile. Le celle devono essere aliquotate in aliquote da 50 μL e possono essere conservate a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
6. Per la trasformazione plasmidica, viene preparata un'aliquota per plasmide e scongelata con ghiaccio, quindi 0,5-1,5 μg di DNA plasmidico contenente il costrutto di visualizzazione del lievito vengono aggiunti direttamente alle cellule. Vengono aggiunti 0,5 mL della soluzione di trasformazione fornita nel kit di trasformazione del lievito, o 0,5 mL di una soluzione sterile di polietilenglicole al 50% e 0,1 M di LiOAc³¹. Combinare accuratamente la miscela di cellule, DNA plasmidico e soluzione di trasformazione mediante pipettaggio.
7. Incubare staticamente la miscela di trasformazione per 30-60 minuti a 30 °C, la miscela a vortice a intervalli di 15 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.000 × g per 3 min.
8. Preparare una provetta per coltura da 14 mL con 4,5 mL di terreno SD-CAA. Risospendere le cellule contenenti il plasmide desiderato in 500 μL di SD-CAA e inoculare i 4,5 mL preparati.
9. Facendo attenzione a non perforare l'agar, distribuire 50 μL dei 5 mL di coltura inoculata su una piastra SD-CAA e incubare staticamente a 30 °C per 48 ore per determinare l'efficienza di trasformazione.
10. Incubare i 5 mL di coltura cellulare SD-CAA in un incubatore con agitazione a 30 °C, 300 giri/min per almeno 18 ore. Monitorare la densità ottica (OD_600nm) dopo 16 ore e 20 ore. Una volta che il campione ha raggiunto una densità ottica sufficiente non superiore a 6, centrifugare la coltura per 3 minuti a 2.500 × g. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet di lievito.
11. Risospendere il pellet di lievito in SRG-CAA a un OD finale di_{600 nm} inferiore a 1 (<1 × 10⁷ lievito/mL).
12. Incubare la coltura di lievito in un'incubatrice con agitazione a 30 °C, 300 giri/min per almeno 8 ore ma non più di 24 ore.
    NOTA: L'induzione dell'espressione proteica nelle cellule di lievito può essere variata da 20 a 37 °C. 30 °C è adatto per la sintesi di coppie chinasi/substrato^29,33, ma può essere regolato se ritenuto necessario per le proteine specifiche in studio.
13. Misura OD_600nm per determinare la densità cellulare.
    NOTA: A questo punto il protocollo può essere interrotto conservando le colture di lievito a 4 °C.

2. Biotinilazione dell'anticorpo anti-fosfotirosina 4G10

1. Risospendere un flaconcino da 2 mg di PEG4-NHS-Biotina a una concentrazione finale di 5 mM aggiungendo 680 μL di PBS sterile.
   NOTA: La risospensione di PEG4-NHS-Biotina deve essere eseguita di fresco immediatamente prima che venga eseguita la reazione di biotinilazione. NHS si idrolizza in soluzione acquosa. L'uso di PBS e fiale sterili è importante per la preparazione di reagenti per la conservazione a lungo termine e per l'uso in saggi basati su cellule per mitigare eventuali effetti potenziali dei contaminanti sulla vitalità dei reagenti o sui saggi sensibili eseguiti.
2. In base alla concentrazione di anticorpi 4G10, aggiungere 100 μg di anticorpo in un flaconcino sterile da 1,7 ml.
3. Aggiungere 1 μl dei 5 mM PEG4-NHS-Biotina preparati dal passaggio 2.1 alla fiala contenente i 100 μg di anticorpo 4G10 per ottenere un rapporto molare tra biotina e anticorpo di 7,5:1. Pipettare delicatamente la miscela per omogeneizzare la reazione.
4. Incubare la reazione a temperatura ambiente con rotazione costante per almeno 2 ore.
5. Seguire il protocollo del produttore per le colonne di desalinizzazione centrifughe da 0,5 mL per sostituire il tampone dal 4G10 biotinilato (B-4G10) al PBS.
   NOTA: Le colonne di desalinizzazione con un cutoff del peso molecolare (MWCO) di 7 kDa sono comunemente utilizzate per la biotinilazione degli anticorpi per consentire la rimozione della biotina non reagita e di altre piccole molecole mantenendo l'anticorpo più grande.
6. Diluire l'anticorpo B-4G10 a una concentrazione finale di 1 μM in PBSA (PBS con 1 g/L di albumina sierica bovina). Aliquotare l'anticorpo B-4G10 in volumi più piccoli per evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento.
   NOTA: Gli anticorpi biotinilati possono essere conservati a 4 °C per l'uso quotidiano fino a 3 mesi senza perdere una significativa efficienza. Conservare il resto delle aliquote non utilizzate a -20 °C per un massimo di 2 anni.

3. Defosforilazione dei substrati espressi sulla superficie cellulare del lievito

1. Preparare la soluzione tampone di lavoro 2x come descritto in precedenza in letteratura³⁴.
   NOTA: Si consiglia 2x per facilitare la misurazione degli ingredienti necessari.
2. Preparare il tampone di lavoro per i campioni in una fiala da 1,7 mL diluendo la soluzione tampone 2x preparata al punto 3.1 1:2 in acqua deionizzata.
   NOTA: Il volume totale di reazione per ciascun campione sarà di 20 μl e ogni campione richiederà tra 10 μl e 18 μl di tampone di lavoro. Preparare una quantità sufficiente di tampone di lavoro per tutti i campioni o i controlli.
3. Seguendo la preparazione del campione raccomandata descritta nella Tabella 2, etichettare i flaconcini da 1,7 ml con il nome del controllo o del campione corrispondente.
4. Sulla base dell'OD_600nm misurato nella fase 1.9, calcolare il volume di coltura necessario per recuperare due milioni (2 × 10⁶) di cellule di lievito dalla coltura di lievito corrispondente per ciascun campione.
5. Aggiungere il volume di coltura di lievito calcolato nel passaggio precedente nella fiala da 1,7 ml per ciascun campione.
6. Centrifugare il flaconcino per 1 minuto a 4.500 × g. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una micropipetta e gettarlo come rifiuto a rischio biologico.
7. Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di PBSA e ripetere il passaggio 3.6.
   NOTA: È importante rimuovere la maggior quantità possibile di surnatante senza disturbare le celle pellettate.
8. Sulla base della sua concentrazione di riserva, calcolare il volume di SHP-2 umano ricombinante necessario per avere una concentrazione finale di 1.000 nM in un volume totale di reazione di 20 μL.
   NOTA: L'SHP-2 ricombinante deve essere aliquotato in piccoli volumi in modo che qualsiasi proteina utilizzata in ciascun test non sia passata attraverso più di due cicli di congelamento-scongelamento. L'eventuale residuo di SHP-2 da un'aliquota dopo che tutti i campioni sono stati preparati per un saggio deve essere scartato.
   Le concentrazioni di stock degli enzimi ricombinanti possono variare a seconda del numero di lotto. L'SHP-2 ricombinante è comunemente formulato a una concentrazione standard di 0,2-0,4 mg/mL. Per una concentrazione stock di 0,324 mg/mL di SHP-2, ciò corrisponde a una concentrazione stock di 4,696 μM (SHP-2 ha un peso molecolare di 69 kDa). 4,26 μL di SHP-2 in una reazione da 20 μL producono una concentrazione finale di reazione di 1.000 nM SHP-2.
9. Aggiungere 7,7 mg di DTT in 10 mL di acqua deionizzata preparata in un conico da 15 mL per creare una soluzione DTT da 5 mM. Se le limitazioni dell'apparecchiatura rendono difficile pesare i milligrammi, aggiungere 0,77 g di DTT a 10 mL di acqua deionizzata, quindi eseguire una diluizione 100x per creare la soluzione DTT da 5 mM utilizzata per il saggio.
   NOTA: La soluzione DTT può essere preparata in soluzioni madre a concentrazione più elevata da diluire a 5 mM se non è possibile misurare quantità su scala millimetrica utilizzando l'attrezzatura disponibile. La soluzione di DTT deve essere preparata fresca prima della risospensione cellulare in tampone di lavoro a causa della sua tendenza all'idrolisi, che la rende instabile per lunghi periodi quando diluita in acqua.
10. Risospendere le cellule pellettate nel tampone di lavoro preparato al punto 3.2 in modo che il volume di reazione finale in ciascun campione o controllo sia di 20 μl.
    NOTA: La quantità di tampone di lavoro aggiunta deve essere calcolata in base alla quantità di DTT (2 μL) e SHP-2 (calcolata al punto 3.8) che sarà presente in ciascun campione.
11. Aggiungere 2 μl della soluzione DTT da 5 mM preparata al punto 3.9 a ciascun campione o controllo per ottenere una concentrazione finale di reazione di 0,5 mM DTT.
12. Aggiungere il volume di SHP-2 calcolato al punto 3.8 a ciascun campione per ottenere un volume finale di 20 μl e mescolare delicatamente con una micropipetta.
13. Avvolgere i coperchi delle fiale dei campioni in parafilm per evitare perdite o contaminazioni incrociate.
14. Incubare i campioni a 37 °C per 2 ore su un rotore a velocità costante.
15. Rimuovere i campioni dal rotore e arrestare la reazione aggiungendo 1 mL di PBSA a ciascun campione.
16. Ripetere il passaggio 3.6.

4. Marcatura cellulare e analisi in citometria a flusso di substrati defosforilati

1. Risospendere i campioni del passaggio 3.16 in una miscela da 20 μl dei reagenti primari corrispondenti, come descritto nella Tabella 2. Incubare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Tutte le concentrazioni di reagenti utilizzate sono state calcolate in eccesso rispetto al numero di proteine espresse sulla superficie delle cellule di lievito. Il calcolo presuppone l'espressione di 10.000 proteine/cellula da tutti i 2 x 10⁶ lieviti in un campione³⁵, quando di routine solo ~50% di essi lo fa. La Tabella 3 mostra l'eccesso di rapporto dei reagenti di marcatura per ciascuno dei reagenti espresso nella Tabella 2, calcolato come segue:
   
2. Centrifugare i campioni a 4.500 × g per 1 minuto e scartare il surnatante come rifiuto a rischio biologico.
3. Lavare le cellule una volta risospendendole in 1 mL di PBSA. Ripetere il passaggio 4.2.
4. Risospendere i campioni in una miscela da 20 μl dei reagenti secondari corrispondenti, come descritto nella tabella 2. Incubare i campioni per 15 minuti in assenza di luce.
5. Ripetere il passaggio 4.2.
6. Ripetere il passaggio 4.3.
7. Risospendere i campioni lavati in 300-500 μL di PBSA e trasferirli in provette di polistirene da 5 mL per analizzarli immediatamente utilizzando un citometro a flusso appropriato.
   NOTA: Se è necessario trasportare campioni, tenerli su ghiaccio umido. Non è consigliato, ma i campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 2 ore come pellet umido.
8. Dopo aver eseguito l'avvio e la preparazione necessari del citometro per un nuovo esperimento, fare clic sul pulsante Nuovo esperimento nel menu File , assegnare un nome all'esperimento e fare clic su Salva per assicurarsi che i dati acquisiti vengano salvati nel percorso del file desiderato.
9. Selezionare l'icona del grafico a punti nella barra degli strumenti superiore per creare due o più grafici a punti per ogni campione da eseguire. Per uno dei dot-plot, selezionare il nome dell'asse X per visualizzare il canale FSC-A e il nome dell'asse Y per visualizzare il canale SSC-A. Questo grafico mostra l'area Side Scatter rispetto all'area Forward Scatter e viene utilizzato per bloccare le cellule di lievito per ulteriori analisi.
10. Su un altro dot-plot, selezionare il nome dell'asse X per visualizzare il canale in cui il reagente secondario che ha come bersaglio l'anticorpo primario anti-epitopo tag è fluorescente. Selezionare il nome dell'asse Y per visualizzare il canale in cui il reagente secondario della streptavidina diventa fluorescente. Questo grafico mostrerà solo gli eventi controllati dal lato rispetto al grafico di dispersione in avanti come cellule di lievito e viene utilizzato per visualizzare la fosforilazione della tirosina sull'asse Y e l'espressione della superficie del substrato sull'asse X.
    NOTA: In questo esempio, il reagente secondario che ha come bersaglio l'anticorpo primario anti-epitopo è fluorescente nel canale FITC (AF-488) e il reagente secondario streptavidina è fluorescente nel canale AF-647. I canali utilizzati possono variare a seconda dei reagenti primari e secondari utilizzati durante l'etichettatura.
11. Posizionare ciascuna provetta del campione nel supporto della provetta del citometro e selezionare Esegui per il citometro per iniziare a caricare il campione e acquisire i dati. Regolare gli eventi da visualizzare, gli eventi da registrare, il tempo di registrazione e la portata del campione, se necessario.
12. Definisci un cancello che circonda le cellule di lievito sane nel grafico SSC-A vs FSC-A creato nel passaggio 4.9. La Figura 1 illustra una rappresentazione descrittiva della strategia di gating da applicare.
    NOTA: Sul grafico SSC-A rispetto a FSC-A, 100.000 eventi da visualizzare e 50.000 eventi da registrare all'interno del cancello di lievito definito sono una buona linea guida per visualizzare e raccogliere dati sufficienti per ulteriori analisi. Strategie di gating più rigorose per selezionare il lievito singoletto possono essere applicate sulla base di un grafico dell'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti, come recentemente riportato³⁶. La strategia di gating mostrata nella Figura 1 corrisponde a un approccio meno rigoroso, che include singoletto e alcuni lieviti doppietti attraverso il gating a dispersione.
13. Registrare la fluorescenza di tutti i campioni di controllo utilizzando un analizzatore di citometria a flusso. I campioni di controllo vengono raccolti regolarmente per primi per aiutare a definire una strategia di gating, come descritto di seguito nel passaggio 4.14.
14. Definire una strategia di gating per il grafico creato nel passaggio 4.10 prima di analizzare i campioni trattati. La Figura 1 illustra una rappresentazione descrittiva della strategia di gating da applicare.
15. Registrare la fluorescenza dei campioni defosforilati utilizzando il citometro a flusso e la strategia di gating definita nei passaggi 4.12 e 4.14.
16. Analizza i dati di citometria a flusso acquisiti utilizzando un software di analisi della citometria a flusso.
17. Valutare la defosforilazione misurando e confrontando la mediana dell'asse Y delle cellule che esprimono proteine sulla loro superficie e la fosforilazione di base fornita dalle cellule non visualizzanti tra campioni e controlli. Calcolare la differenza di fosforilazione mediana percentuale come segue:
    

Risultati

L'analisi della citometria a flusso da una replica individuale del nostro sistema modello incubato per 2 ore senza (Figura 1A) e con (Figura 1B) 1.000 nM SHP-2 rivela una differenza di fosforilazione mediana del 63,6%, che è definita come il rapporto tra la mediana dell'asse Y (fosforilazione) di tutti gli eventi visualizzati sulla superficie meno il segnale di fosforilazione basale definito come la mediana dell'asse Y degli eventi non visualizzati tra il campio...

Discussione

Il protocollo presentato consente l'analisi delle interazioni enzimatiche utilizzando la visualizzazione extracellulare delle proteine sulla superficie del lievito. L'incorporazione del sequestro del reticolo endoplasmatico nel plasmide surface-display utilizzato introduce la capacità di analizzare extracellulari interazioni specifiche tra enzimi e substrati modificati post-traduzionali a causa delle interazioni intracellulari che possono essere progettate per verificarsi

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bottiglie da 1 l	Corning	06-414-1D
1,7/2,0 mL Microprovette	Axygen	MCT-175-C
10 & micro; L Punte per pipette SureOne	Fisher Scientific	02-707-438
1000 µ L Punte per pipette SureOne	Fisher Scientific	02-707-408
Provette a fondo tondo in polistirene da 12 mL	Greiner	07-000-212
Cuvette in plastica da 3 mL	MARCA	759076D
300 &; L Punte per pipette SureOne	Fisher Scientific	02-707-411
Pipette sierologiche da 5 mL	Fisher Scientific	13-678-11D
Caseina acida (acidi Casaimino)	Fisher Scientific	BP-1424-500
	Mettler Toledo	30243397
Piastra di Petri batteriologica	Cabine di biosicurezza Corning	Falcon 351008
	Biospettrometro Labconco	Logic Classe II, tipo A2  302310102
	Eppendorf	Kinetic 6136000010
Albumina sierica bovina	Fisher Bioreagenti	BP1600-100
Acido citrico	Fisher Scientific	A940-500
Citometria a flusso CytoFLEX Analizzatore	Beckam Coulter	Cytoflex C09745	CytExpert software
Destrosio	Fisher Scientific	D16-1
Ditiotreitolo	Fisher bioreagenti	BP172-5
Asino anti-capra FITC	Invitrogen	A16000
EDTA	Alfa Aesar	H56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-Biotina	Thermo Scientific	A39259
Kit di trasformazione del lievito Frozen EZ II	Zymo Research	T2001
Galattosio	Fisher Scientific	BP656-500
Frigorifero per uso generico	Marvel Scientific	MS24RAS4RW
Anticorpo anti-myc tag di capra	Centrifuga a mictrotubo Bethyl	A190-104A
	Eppendorf	5425 R 5406000313
Mini incubatrice refrigerata a bassa temperatura	Fisher Scientific	15-015-2632
Anticorpo anti-fosfotirosina di topo 4G10	BioXcell	BE0194
Parafilm M	Bemis	M PM999
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher bioreagenti	BP399-500
Pipette Controller	Eppendorf	easypet 3 4430000018
Raffinosio	Thermo Scientific	J21060-36
Proteina attiva SHP-2 umana ricombinante	R& D Systems	1894-SH
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5910 R
Saccharomyces cerevisiae lievito ceppo di visualizzazione della superficie EBY 100	ATCC	MYA-4941
Incubatore per agitatore	Eppendorf	M1335-0002 New Brunswick Innova 42
Set di pipette a canale singolo	Eppendorf	05-403-151
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S671-500
Citrato di sodio diidrato	Fisher Scientific	S279-500
Fosfato di sodio eptaidrato bibasico	Fisher Scientific	S373-500
Fosfato di sodio monobasico monoidrato	Fisher Scientific	S468-500
Streptavidina Alexa Fluor 647	Invitrogen	S32357
Bilancia a caricamento dall'alto	Mettler Toledo
Tris cloridrato	EMD Millipore	648317-100GM
Rotatore per revolver a tubo	Fisher Scientific	11-676-341
Carta per pesare	Fisher Scientific	09-898-12B
Lievito a base di azoto	BD Difco	291940
Zeba Spin Colonne di desalinizzazione	Termo Scientifico	89883