Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato del metodo di trasformazione genetica mediato da Agrobacterium tumefaciens per produrre Solanum nigrum transgenico.
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Articolo metodologico
Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens in Solanum nigrum
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il Solanum nigrumè un parente solanaceo orfano della patata e del pomodoro, e il suo frutto fresco è una bacca nutriente e deliziosa. L'intera pianta di S. nigrum può essere utilizzata come medicinale. Tuttavia, lo S. nigrum selvatico nasconde alcuni tratti indesiderati. Fortunatamente, le tecniche di ingegneria genetica, in particolare le tecnologie di editing genetico come CRISPR/Cas9, offrono preziose opportunità per migliorare rapidamente S. nigrum affrontando queste carenze. Nella maggior parte delle piante, il miglioramento delle piante attraverso la tecnologia di editing genetico si ottiene attraverso la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens. In questo articolo, abbiamo dettagliato i protocolli di trasformazione genetica mediati da A. tumefaciens in S. nigrum. I cotiledoni e gli ipocotili delle piantine di S. nigrum sono stati utilizzati come espianti per la trasformazione genetica. Poiché S. nigrum è resistente alla kanamicina, il gene DsRed è stato utilizzato come marcatore visivo per identificare le piante transgeniche. La trasformazione genetica di S. nigrum può essere completata in modo efficiente secondo questi protocolli operativi. Il rilevamento delle piante transgeniche T1 può essere identificato direttamente in base al fatto che emettano fluorescenza rossa, senza la necessità di identificazione PCR.
Introduzione
Solanum nigrum (noto come belladonna, 2n = 6x = 72) è un parente solanaceo della patata e del pomodoro1. Il frutto è una bacca sferica che diventa nera dopo la maturazione. Il frutto fresco è una bacca nutriente e deliziosa. L'intera pianta di S. nigrum può essere usata come medicinale, con gli effetti di disperdere la stasi del sangue, ridurre il gonfiore, eliminare il calore e disintossicare. S. nigrum sintetizza due classi distinte di metaboliti specializzati da un comune precursore del colesterolo: saponine steroidee nelle sue foglie e glicoalcaloidi steroidei (SGA) nelle sue bacche. L'uttroside B, una saponina steroidea derivata da S. nigrum, è stato recentemente approvato dalla Food and Drug Administration statunitense come farmaco orfano per il trattamento del carcinoma epatocellulare2. Il knockout del gene GAME15 in S. nigrum ha portato a piante prive sia di saponine che di alcaloidi steroidei, e ha anche rivelato che le saponine steroidee controllano gravi insetti nocivi agricoli2. I polifenoli in S. nigrum riducono il peso e il grasso corporeo influenzando gli adipociti e il metabolismo dei lipidi3. S. nigrum può arricchire il cadmio ed è usato come pianta modello per studiare l'arricchimento del cadmio 4,5. S. nigrum è una pianta non addomesticata e le sue basi di ricerca sono relativamente deboli. È stimolante che la ricerca su S. nigrum sia aumentata gradualmente negli ultimi anni. Il genoma dell'esaploide S. nigrum è stato recentemente assemblato e S. nigrum potrebbe essersi evoluto dal suo diploide Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7. Pertanto, S. nigrum è una pianta che possiede sia valore medicinale che commestibile. La ricerca su S. nigrum non solo contribuisce a una comprensione più profonda delle sue potenziali applicazioni nel trattamento delle malattie umane, ma fornisce anche preziose informazioni sul miglioramento della produzione agricola. Quindi, stabilire un sistema di trasformazione genetica in S. nigrum è la base per il miglioramento genetico attraverso la tecnologia transgenica e l'editing genetico.
Ci sono diversi rapporti che si concentrano sulla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens di S. nigrum 8,9,10,1 1. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo stabilito un sistema di trasformazione genetica mediato da A. tumefaciens LBA4404 per S. nigrum e trasformato AcMYB110 in S. nigrum, ottenendo nuovi germoplasmi di S. nigrum con un aumento del contenuto di antociani1. Le piante transgeniche e geneticamente modificate di S. nigrum sono state ottenute con la trasformazione genetica mediata da A. tumefaciens EHA10510. Diverse proteine fluorescenti hanno emissioni di fluorescenza verdi, rosse, gialle, arancioni e blu e sono ampiamente utilizzate per indicare le attività della vita cellulare12. Nel processo di trasformazione genetica delle piante, i geni fluorescenti rossi sono spesso utilizzati come geni reporter per distinguere gli eventi geneticamente modificati da quelli non geneticamente modificati13. L'uso del gene DsRed come gene reporter consente una comoda discriminazione degli eventi transgenici, mentre l'uso del fattore di trascrizione R2R3-MYB come gene reporter può essere influenzato dal genotipo delle piante14. Nella progenie transgenica, le piante transgeniche possono anche essere facilmente distinte dalle piante non transgeniche utilizzando strumenti ottici (ad esempio, microscopi a fluorescenza o sistemi di imaging), eliminando la necessità di un'identificazione basata sulla PCR. Integrando il gene reporter della proteina fluorescente con la tecnologia di editing genetico CRISPR, i geni della fertilità nel mais sono stati eliminati con precisione, con conseguente creazione di una linea nucleare sterile e di una linea di mantenitore sterile nucleare controllata15. L'autoimpollinazione e la fruttificazione delle piante mantenitrici produrranno una prole 1:1 di linee mantenitrici e sterili. Sulla base delle diverse caratteristiche luminescenti, la selezione non distruttiva dei semi del mantenitore e della linea sterile può essere ottenuta attraverso il riconoscimento visivo o automatico15. Pertanto, l'impiego del gene della proteina fluorescente come gene reporter semplifica l'identificazione di semi o piante transgeniche senza la necessità di analisi PCR. Ciò rappresenta un vantaggio significativo nel campo della trasformazione genetica. Questo metodo mira a descrivere il protocollo di trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens in S. nigrum, utilizzando il gene fluorescente rosso, DsRed, come gene reporter.
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Protocollo
1. Coltivazione asettica di piantine
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti su un banco super pulito.
- Raccogli i semi selvatici di S. nigrum nella città di Liaocheng, in Cina, e chiamali Snlc1. Prendi 50 semi selvatici di S. nigrum e mettili in una provetta da centrifuga da 2 ml. Dopo aver immerso 1 mL di gibberellina al 5% per 30 minuti, scartare la soluzione di gibberellina.
- Aggiungere 1 ml di etanolo al 75%, agitare per 1 minuto e poi scartare l'etanolo.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di ipoclorito di sodio al 2% e disinfettare la superficie dei semi per 10 minuti. Agitare accuratamente la provetta da centrifuga per sterilizzare la superficie del seme. Dopo 10 minuti, scartare l'ipoclorito di sodio.
- Lavare i semi 5 volte con acqua sterilizzata per rimuovere l'ipoclorito di sodio residuo. Mettere i semi in piastre di Petri del diametro di 90 mm contenenti 1/2 MS di terreno solido. Coltivare le piastre in una camera di crescita delle piante in un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio a 25 °C (Figura 1A).
2. Coltura di A. tumefaciens LBA4404
- Trasformare il vettore binario pRed130516 ospitato con un gene fluorescente rosso, DsRed2, in A. tumefaciens LBA4404 mediante elettroporazione con MicroPulser con parametri: Tensione 1800 V, Capacità 25 μF, Resistenza 200 Ω, Cuvetta 1 mm. Coltura dei batteri su terreno LB solido con 50 mg/L di kanamicina e 50 mg/L di rifampicina a 28 °C per 48 ore.
- Prelevare un clone di LBA4404 contenente pRed1305 e coltivarlo in 1 mL di terreno LB liquido con 50 mg/L di kanamicina e 50 mg/L di rifampicina in una provetta da centrifuga da 15 mL in un concentratore da tavolo a 180 giri/min a 28 °C per 12 ore.
- Aggiungere 50 mL di LB liquido con lo stesso antibiotico a 1 mL di soluzione batterica e quindi coltivare in un concentratore da tavolo a 200 giri/min a 28 °C per 6 ore.
- Interrompere la coltura quando l'OD600 del terreno di coltura batterica è 0,4, quindi centrifugare la soluzione batterica a 2200 x g per 10 minuti a 25 °C.
- Risospendere i batteri centrifugati con una soluzione di infezione (IS: M519 4,43 g/L, saccarosio 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) e regolare la concentrazione della soluzione batterica a OD600= 0,6 con uno spettrofotometro.
3. Espiantare l'infezione da A. tumefaciens
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti su un banco super pulito.
- Far crescere i semi per 7 giorni fino a quando i cotiledoni delle piantine non si sono dispiegati (Figura 1B). Tagliare i due cotiledoni e l'ipocotile con una lunghezza di circa 1 cm dalle piantine con un bisturi sterilizzato e affilato in una capsula di coltura con carta da filtro inumidita con IS batterico e scartare le radici primarie. Fai attenzione quando usi un bisturi.
- Infondere gli espianti nella soluzione di infezione per 30 minuti. Posizionare gli espianti su carta da filtro asciutta per consentire l'assorbimento della soluzione batterica sulla superficie dell'espianto.
- Posizionare gli espianti in terreno solido IS (0,7% Agar; Figura 1C). Porre gli espianti in una camera di crescita delle piante senza luce a 19 °C e coltivare per 3 giorni.
4. Differenziazione degli espianti
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti su un banco super pulito.
- Raccogliere gli espianti dalla camera di crescita delle piante a 19 °C. Lavare gli espianti con acqua sterilizzata 5 volte e posizionare gli espianti su carta da filtro asciutta e sterilizzata.
- Porre gli espianti in terreno di differenziazione dei germogli (SD) (SD: M519 4,43 g/L, saccarosio 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) e coltivare a 25 °C per 4 settimane (Figura 1D, E).
- Tagliare il callo/gemme degli espianti che mostrano fluorescenza rossa sotto la luce di eccitazione verde di una lampada fluorescente portatile utilizzando un bisturi, quindi trasferirli su un nuovo terreno SD e continuare a coltivare per 4 settimane a 25 °C (Figura 1F, G).
5. Radicazione e trapianto
- Tagliare le cime che mostrano fluorescenza rossa con una lampada fluorescente portatile, trasferirle nel terreno radicante (RM: M519 4,43 g/L, saccarosio 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) e coltivarle per 2-4 settimane a 25 °C per favorire la produzione di radici.
- Trapiantare nel terreno le piantine che mostrano fluorescenza rossa con una lunghezza delle radici superiore a 2 cm (Figura 1H-K). Prima del trapianto, rimuovere manualmente l'agar dalle radici per evitare un'eccessiva crescita di batteri nelle radici.
6. Test di piante T0 geneticamente modificate con amplificazione PCR
- Estrarre il DNA genomico di una linea transgenica indipendente utilizzando il metodo CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)17.
- Amplificare il gene DsRed con il set di primer, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') e RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') utilizzando 10 ng di DNA genomico come stampo in un volume di reazione di 15 μL contenente 7,5 μL di 2x PCR Master Mix e 0,3 μL di ciascun primer (10 μmol/L). Il frammento di DNA atteso era di 393 bp. Sottoporre i prodotti della PCR all'elettroforesi su gel di agarosio all'1% per determinare se si tratta di piante transgeniche.
7. Identificazione di piante transgeniche nella generazione T1 con una lampada fluorescente
- Raccogli i frutti delle piante transgeniche T0 di S. nigrum che sono completamente diventate di colore nero-violaceo e poi spremi a mano i semi all'interno del frutto. Essiccare naturalmente i semi all'aria a temperatura ambiente per circa 1 settimana.
- Coltivare i semi essiccati in terreno 1/2 MS secondo i passaggi da 1.1 a 1.4 di questo protocollo e metterli in una camera di crescita delle piante per 1 settimana. Distingui le piantine transgeniche e le piantine non transgeniche con una lampada fluorescente portatile.
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Risultati
Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens per produrre S. nigrum transgenico.
Dopo aver infettato i cotiledoni e gli ipocotili delle piantine di S. nigrum con A. tumefaciens, abbiamo potuto determinare se l'infezione da Agrobacterium ha avuto successo poiché DsRed è stato utilizzato come gene reporter. La fluorescenza rossa è appa...
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Discussione
Finora, i metodi di trasformazione genetica per S. nigrum mediati da A. tumefaciens sono stati messi a punto in diversi laboratori 8,9,10,11. La maggior parte di questi metodi di trasformazione utilizza la kanamicina come sostanza di selezione 8,9,10,11.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di ricerca dell'Università di Liaocheng (318012028) e dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia di Shandong (ZR2020MC034).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2X SanTaq PCR Master Mix (con colorante blu) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B532061 | Il 2X SanTaq PCR Mix include MgCl?, dNTP, Taq DNA polimerasi, tampone PCR, colorante di caricamento e potenziatore PCR. |
| 6-BA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | C14819266 | Citochinine artificiali |
| Agar | Tianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (Limited Partnership) | CAS NO:9002-18-0 | Solidi |
| AS | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | K914BA0002 | Indurre un'espressione efficiente di Agrobacterium |
| Carb | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Antibiotico | |
| Cef | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | I526BA0010 | |
| Antibiotico gibberellina | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | K514BA0009 | Promuove la germinazione dei semi |
| kanamicina | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | I614BA0013 | Antibiotico |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | Coltiva i batteri |
| MicroPulser ( Gene Pulser Xcell) | Bio-Rad, US | 617BR1 06783 | Gene Pulser Xcell |
| MS solido medio | phytotech Co., Ltd., US | HCA0519228A | Murashige & Skoog Basal Medium con vitamine, M519 |
| scatola di plastica | LiaoSu, Cina | T909H | Pianta pianta |
| scatola rifampicina | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | S180305 | Antibiotico |
| saccarosio | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | CAS NO: 57-50-1 | Come fonte di carbonio |
| Tanon-5200Multi macchina | Tanon Co., Ltd., Cina | 5200Multi | Separazione |
| accelerata selvatico Solanum nigrum | raccolto nella città di Liaocheng | ||
| ZT | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | J921BA0014 | Regolatori di crescita per piante |
Riferimenti
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