Articolo metodologico

Flusso di lavoro con un microscopio criogenico a fluorescenza coincidente, a fascio di elettroni e ioni per la fresatura mirata delle cellule

DOI:

10.3791/68238

⸱

17 ottobre 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2SLAC National Accelerator Laboratory, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 4Department of Photon Science and Structural Biology, Stanford University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo flusso di lavoro consente la produzione di lamelle mirate a strutture biologiche marcate in fluorescenza che sono piccole (<1 μm di estensione assiale) e rare (1 copia per cellula) utilizzando una piattaforma di imaging criogenica tri-coincidente. Questa piattaforma integra la microscopia a fluorescenza, la fresatura a fascio ionico focalizzato e la microscopia elettronica a scansione in un'unica posizione focale e consente la microscopia a fluorescenza simultanea durante la fresatura.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fresatura criogenica a fascio ionico focalizzato con microscopia elettronica a scansione (CryoFIB-SEM) è diventata l'approccio dominante per la preparazione di lamelle di cellule spesse meno a 200 nm per la tomografia elettronica criogenica (CryoET). Recentemente, la microscopia a fluorescenza è stata incorporata nei sistemi CryoFIB-SEM per guidare la produzione di lamelle verso bersagli marcati in fluorescenza. Tuttavia, nella maggior parte delle implementazioni, i sistemi di imaging ottico e a fascio ionico hanno piani focali distinti in diverse regioni della camera a vuoto, funzionando efficacemente come due microscopi separati. Questa configurazione richiede la registrazione delle immagini tra le modalità, che spesso manca della precisione necessaria per individuare in modo affidabile strutture piccole e rare in situ. Presentiamo un flusso di lavoro basato su una piattaforma di imaging tri-coincidente personalizzata che consente l'imaging a fluorescenza simultanea e la fresatura a fascio ionico focalizzato. Ciò consente un feedback di fluorescenza in tempo reale che può essere utilizzato per determinare quando terminare la fresatura al fine di preservare le strutture di interesse marcate in fluorescenza nella lamella finale. Utilizzando questo approccio, abbiamo preso di mira il centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC) nei macrofagi vitrificati e abbiamo raggiunto un tasso di successo del >60%, confermato dalla successiva tomografia elettronica criogenica e dalla microscopia ottica ed elettronica correlata.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tomografia elettronica criogenica (CryoET) consente la visualizzazione di campioni biologici in uno stato quasi nativo con risoluzione macromolecolare 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Tuttavia, lo spessore delle celle eucariotiche - spesso diversi micron - supera il cammino libero medio (~300 nm) di 300 kV di elettroni, limitando la profondità di penetrazione degli elettroni non diffusi e quindi limitando lo spessore del campione utilizzabile. Per risolvere questo problema, è possibile utilizzare un fascio ionico focalizzato (FIB) per ablare la maggior parte delle cellule conservate criogenicamente in un processo noto come macinazione CryoFIB, producendo lamelle abbastanza sottili per l'imaging CryoET 12,13,14,15,16.

Nei flussi di lavoro precedentemente riportati, i campioni vengono prima conservati in ghiaccio vetrificato tramite congelamento a tuffo 17,18,19 e quindi caricati in uno strumento a doppio raggio dotato sia di un CryoFIB che di un microscopio elettronico a scansione (SEM). L'imaging SEM può essere utilizzato per identificare le caratteristiche subcellulari di interesse come gli organelli e persino alcune strutture proteiche20,21. Queste informazioni possono essere utilizzate per dirigere il processo di macinazione CryoFIB, in cui il campione viene ablato in modo graduale con l'obiettivo di produrre una lamella di spessore inferiore a 200 nm adatta per CryoET 13,14,22. Tuttavia, questo approccio presenta due sfide chiave che l'attuale protocollo affronta. In primo luogo, è spesso necessario ottenere CryoET di specifiche strutture proteiche, ma il SEM può essere dannoso e la maggior parte delle strutture proteiche non sono distinguibili dal SEM durante l'imaging di materiale biologico non colorato. Come si può guidare con precisione la fresatura verso specifiche regioni subcellulari o regioni contenenti specifiche biomolecole in modo privo di danni? In secondo luogo, anche dopo la produzione di lamelle sottili e la successiva CryoET, può essere difficile identificare biomolecole specifiche nelle ricostruzioni finali a causa della risoluzione insufficiente, del rapporto segnale/rumore e/o del contrasto necessari per l'identificazione univoca. Come si possono determinare le posizioni spaziali di queste biomolecole all'interno delle ricostruzioni crio-ET?

Per affrontare entrambe le sfide, il campo si è rivolto sempre più alla microscopia a fluorescenza. Proteine fluorescenti geneticamente codificate o coloranti esogeni che legano le proteine bersaglio sono abitualmente utilizzati per marcare specifiche biomolecole di interesse 5,23,24. La microscopia criogenica a fluorescenza di cellule vitrificate prelevate dopo la fresatura può essere correlata con i tomogrammi risultanti. Questo approccio, noto come microscopia elettronica e ottica correlativa criogenica (CryoCLEM), è ben consolidato ed è stato ampiamente utilizzato per localizzare proteine specifiche all'interno delle ricostruzioni CryoET 5,12,23,24. I recenti progressi includono l'uso di biosensori fluorescenti e metodi di super-risoluzione per migliorare le informazioni complementari e la precisione spaziale 25,26,27,28,29.

CryoCLEM è un modo per superare la seconda sfida identificata sopra, consentendo di determinare la posizione di proteine specifiche all'interno della lamella. Tuttavia, CryoCLEM non fa nulla per l'utente se la lamella finale non contiene le proteine di interesse. Fortunatamente, la microscopia a fluorescenza può essere utilizzata anche per dirigere la fresatura verso le regioni di interesse marcate. Sebbene la fresatura FIB a guida fluorescente sia uno sviluppo più recente rispetto a CryoCLEM, i flussi di lavoro iniziali emersi circa un decennio fa12, ha trovato un'adozione rapida e diffusa. I primi protocolli si basavano su microscopi ottici esterni per acquisire set di dati di fluorescenza 2D o 3D, che venivano poi registrati su immagini SEM e a fascio ionico dopo aver trasferito il campione nel CryoFIB-SEM. Più recentemente, i microscopi a fluorescenza sono stati integrati direttamente nelle camere a vuoto CryoFIB-SEM. Questa integrazione riduce la contaminazione del ghiaccio durante i trasferimenti e consente di ottenere più facilmente l'imaging della lamella finale. Sono state sviluppate diverse piattaforme per combinare la microscopia a fluorescenza con CryoFIB-SEM per la fresatura guidata dalla fluorescenza. Questi hanno preso di mira con successo organelli e grandi complessi proteici 5,23,24. Tuttavia, con poche eccezioni30, il percorso ottico produce un piano focale separato in una regione fisica diversa della camera a vuoto dal FIB-SEM. Di conseguenza, per dirigere la fresatura diretta è ancora necessaria una registrazione precisa tra la fluorescenza e le immagini ioniche, proprio come è richiesto con l'uso di microscopi ottici stand-alone.

Questo processo di registrazione è soggetto a imprecisioni a causa di tre fattori chiave: discrepanze dell'indice di rifrazione (che causano spostamenti focali apparenti)31,32, movimento del campione durante la fresatura ed errore di localizzazione. Inoltre, la registrazione è tipicamente aiutata da fiduciali fluorescenti di dimensioni micron che sono visibili sia in modalità ionica che ottica e vengono utilizzati come coppie di punti di allineamento per calcolare le trasformazioni tra lo ione e le immagini ottiche. Tuttavia, queste perle possono oscurare o competere con il segnale di fluorescenza del campione e la loro localizzazione e allineamento tra immagini ottiche e ioniche è lenta e richiede molto tempo per l'utente. Insieme, queste limitazioni hanno ostacolato il targeting di routine di caratteristiche piccole e rare. Sebbene sia difficile definire un limite preciso alle strutture che possono essere attualmente conservate nelle lamelle sottili, gli approcci basati sulla registrazione sono generalmente considerati inefficaci per catturare bersagli con dimensioni assiali inferiori a un micron33.

Qui, riportiamo l'uso di un sistema di imaging tri-coincidente che integra FIB, SEM e microscopia a fluorescenza in un'unica posizione focale34,35. Questa configurazione consente una fresatura guidata dalla fluorescenza più semplice e accurata rispetto alle integrazioni non coincidenti, eliminando la necessità di registrare immagini ottiche e ioniche. In condizioni ideali di basso fondo e segnale elevato, è possibile raggiungere una precisione di guida dell'ordine di 10 nm36. Consente inoltre l'acquisizione di dati di microscopia a fluorescenza criogenica multicolore durante l'intero processo di macinazione, compresa la lamella sottile finale, consentendo l'analisi correlativa e la localizzazione di bersagli limitati alla sub-diffrazione35. Per raggiungere questo obiettivo, impieghiamo un toolkit di trasformazione delle immagini personalizzato per allineare con precisione queste immagini a fluorescenza con la microscopia elettronica a trasmissione a basso ingrandimento per determinare dove raccogliere CryoET, semplificando la raccolta dei dati e garantendo l'acquisizione del bersaglio nelle ricostruzioni tomografiche finali.

Per guidare la fresatura, sfruttiamo la capacità del sistema di monitorare in tempo reale le variazioni dell'intensità della fluorescenza. Invece di cercare di allineare le immagini ottiche e ioniche per trovare il nostro bersaglio, l'utente osserva semplicemente il segnale fluorescente dal campione. Man mano che la fresatura procede, la fluorescenza si comporta in un modo molto caratteristico: prima diventa più luminosa quando viene rimossa la pellicola di supporto in carbonio tra l'obiettivo del microscopio e il campione marcato in fluorescenza, poi diminuisce gradualmente man mano che il materiale autofluorescente fuori fuoco viene macinato e, infine, diminuisce bruscamente quando la struttura etichettata stessa viene parzialmente rimossa. Questo segnale in tempo reale determina con precisione la fase del processo di fresatura e il momento in cui interrompere la fresatura, garantendo che il target di interesse venga mantenuto all'interno della lamella finale37. Nel protocollo dettagliato, discuteremo anche un approccio più avanzato che utilizza le oscillazioni della luminosità della fluorescenza dovute agli effetti interferometrici per guidare la fresatura verso oggetti che hanno un'estensione assiale di <300 nm.

Dimostriamo l'utilità della piattaforma prendendo di mira il centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC)38. Il MTOC è un organello critico coinvolto nella divisione e nel differenziamento cellulare. Nelle cellule di mammifero, la microscopia a fluorescenza della tubulina marcata rivela l'MTOC come un singolo punctum fluorescente di circa 1 μm di diametro nelle cellule vive. Questo approccio è stato utilizzato per localizzare con successo il MTOC con alta fedeltà su lamelle sottili di cellule vitrificate. L'organizzazione dettagliata dei microtubuli al MTOC e le loro interazioni con altri organelli sono rivelate nelle successive ricostruzioni tomografiche. Questo flusso di lavoro consente la microscopia a fluorescenza correlativa ad alta precisione e CryoFIB-SEM senza registrazione, riducendo l'input dell'utente e ampliando l'accesso a strutture cellulari che in precedenza erano proibitive da catturare in modo robusto con approcci non coincidenti.

Definizioni e descrizione dello strumento
Il microscopio ottico integrato è descritto in dettaglio in Boltje et al.35, e ulteriori dettagli sull'uso del microscopio integrato possono essere trovati in un protocollo34 pubblicato di recente. L'obiettivo è integrato dal basso e dotato di capacità di posizionamento x, y e z per consentire l'allineamento con il punto coincidente FIB-SEM. Attualmente funziona con un obiettivo 100x, 0,85 NA con un correttore di vetrini. L'imaging ottico viene eseguito attraverso un vetro di copertura, che protegge l'obiettivo dal materiale spruzzato e dall'irradiazione sia dal FIB che dal SEM. L'illuminazione a campo largo è fornita da una serie di LED che coprono più lunghezze d'onda visibili. La rivelazione della fluorescenza viene eseguita utilizzando un rivelatore sCMOS. Ci sono tre posizioni di stadio definite: caricamento: la posizione di stadio in cui viene caricato il campione; rivestimento: la posizione di fase per il rivestimento tramite il sistema di iniezione del gas; 3-Beam: la posizione del tavolino per la quale tutti e tre i microscopi (FIB, SEM e ottici) possono essere co-allineati.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Il sistema tri-coincidente utilizzato qui è un componente di imaging a fluorescenza criogenica personalizzato integrato in un sistema FIB-SEM a doppio raggio disponibile in commercio. Il principio e l'ordine delle operazioni possono essere generalmente adattati alle future implementazioni tri-coincidenti.

1. Impostazione

  1. Raffreddare il sistema a temperatura criogenica. Monitorare la temperatura utilizzando due sensori: uno situato sul tavolino di campionamento e l'altro all'interno della camera. Mantenere lo stadio del campione a circa 20 °C più caldo della camera (ad esempio, stadio a ~-170 °C, camera a ~-190 °C) per ridurre al minimo l'accumulo di ghiaccio sul campione. Il processo di raffreddamento richiede in genere circa 1,5 ore.

2. Caricamento del campione

  1. Utilizzare azoto liquido per raffreddare manualmente la stazione di trasferimento una volta che la temperatura del sistema si avvicina alla temperatura criogenica (circa -167,5 °C). La temperatura del sistema viene visualizzata nell'angolo in alto a sinistra del software di microscopia ottica.
  2. Caricare un Autogrid agganciato nella cassetta del campione progettata per il sistema di microscopia ottica criogenica. La cassetta è composta da un vetrino coprioggetti incollato e da un distanziatore, con l'Autogrid posizionato tra di loro. Chiudere la cassetta serrando la vite ad anello, quindi inserirla nella fessura della stazione di trasferimento34.
  3. Collegare la stazione di trasferimento al sistema e utilizzare la telecamera della camera interna per guidare la cassetta del campione sul tavolino del campione.

3. Sistema di iniezione di gas (GIS) per il rivestimento del campione

  1. Aprire il software di controllo della microscopia ottica e spostare il tavolino del campione dalla posizione di caricamento a quella di rivestimento .
  2. Inserire l'ago GIS utilizzando il software di controllo FIB-SEM facendo clic sull'icona del fiocco di neve. In Controllo GIS, scegli l'opzione inserisci ago GIS.
  3. Lasciare la deposizione GIS per 30 s aprendo il flusso di gas.
    NOTA: Questo varia da 20 s a 1 min in base al tipo di campione. L'obiettivo di questa fase è quello di proteggere sufficientemente il campione durante la successiva procedura di fresatura FIB.
  4. Ritraendo l'ago GIS, riportare lo stadio del campione nella posizione di caricamento predefinita.

4. Allineamento del sistema a tre raggi

NOTA: Questa sezione è adattata da Wang39.

  1. Nel software di microscopia ottica, spostare il tavolino del campione dalla posizione di carico alla posizione predefinita a 3 raggi .
  2. Nel software FIB-SEM, fare clic sulla finestra in alto a sinistra e impostare il SEM su un ingrandimento di 100x.
  3. Nella scheda Allineamento del software di microscopia ottica, fare clic sulla funzione Visualizza per acquisire un atlante SEM della griglia. Questa immagine dell'atlante utilizza parametri precedentemente impostati.
  4. Identificare un'area quadrata con una pellicola di carbonio rotta e fare doppio clic su di essa per spostare lo stadio del campione in quella posizione.
  5. Tornare al software di controllo FIB-SEM e regolare il SEM su un ingrandimento maggiore per mettere a fuoco l'area quadrata selezionata, centrata nel campo visivo.
  6. Ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 secondo necessità fino a quando il SEM non si concentra su un modello distinguibile, come il bordo tagliente di una pellicola di carbonio rotta.
  7. Accendi il microscopio a fluorescenza e regola le coordinate x, y, z in modo che corrispondano alla vista SEM.
  8. Fresare un piccolo modello con il FIB, ad esempio un piccolo rettangolo o un cerchio.
  9. Verificare che il modello sia visibile sia nella vista FIB che in quella al microscopio fluorescente. Se necessario, regolare l'allineamento seguendo i passaggi 4.3-4.7, se necessario.
    NOTA: L'allineamento e la registrazione dei microscopi ottici e ionici sono stati completati.

5. Localizzazione e fresatura del bersaglio

NOTA: Questa sezione è adattata da Wang39.

  1. Passa alla scheda Localizzazione nel software di microscopia ottica e imposta i canali fluorescenti attivando le condizioni di eccitazione e filtraggio appropriate. Assegnare a ciascun fluoroforo un canale separato e includere un canale aggiuntivo per la luce trasmessa (o campo chiaro).
  2. Identifica il target di interesse regolando la potenza del LED e il tempo di esposizione per ciascun canale fluorescente. Come riferimento, quando si esegue l'imaging della SiR-tubulina, utilizzare un'esposizione di 1,2 s con un'impostazione di potenza LED costante di 30 mW.
    NOTA: I parametri possono variare tra i fluorofori. L'intensità ottica deve rimanere al di sotto di ~25-50 W/cm2 al campione. Un'intensità maggiore di questa può comportare un significativo riscaldamento e devitrificazione del campione 37,40.
  3. Una volta soddisfatti dei parametri, acquisire una pila di z fluorescente di pre-fresatura che passa attraverso la direzione assiale. Quindi, contrassegna l'obiettivo come ROI.
  4. Passa al software FIB-SEM per disegnare una lamella al ROI.
  5. Eseguire la fresatura di sgrossatura per rimuovere la massa di materiale a circa 3 μm sopra e sotto il ROI. Nel frattempo, tenere acceso il microscopio a fluorescenza durante la fresatura per monitorare l'eventuale diminuzione del segnale fluorescente.
  6. Assottigliare la ROI a ~2 μm utilizzando la modalità di pulizia della sezione trasversale.
  7. Aprire il toolkit interferometrico basato su Python dal terminale per monitorare il segnale fluorescente durante l'assottigliamento della lamella (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36.
  8. Per la successiva fresatura e lucidatura, seguire uno dei due approcci descritti di seguito nei passaggi 5.9 o 5.10 per la fresatura diretta in base alle dimensioni dei target selezionati.
    1. Estensione assiale del bersaglio > 300 nm
      NOTA: Qui utilizzeremo un approccio semi-distruttivo alla fresatura diretta.
      1. Nella GUI di Python, selezionare il target di interesse nel micrografo a fluorescenza. Il software inizierà automaticamente a tracciare la luminosità in funzione del tempo ad ogni nuovo fotogramma.
      2. Monitora l'intensità della fluorescenza attraverso il toolkit Python. Fresare il campione in modalità sezione trasversale di pulizia dal basso per rimuovere il materiale residuo della pellicola di supporto, se applicabile.
        NOTA: Quando la pellicola di supporto viene rimossa, si deve osservare un aumento della fluorescenza.
      3. Utilizzare rapidi cali di intensità della fluorescenza, che indicano la perdita di materiale fluorescente, come spunto per quando cambiare direzione di fresatura. Ad esempio, se si esegue la fresatura dal basso verso l'alto e si osserva una forte diminuzione della fluorescenza, interrompere la fresatura e passare alla fresatura dall'alto verso il basso.
        NOTA: Se una struttura viene rimossa troppo rapidamente, ridurre la corrente di fresatura nel software FIB-SEM per rallentare la rimozione del target.
    2. Estensione assiale del bersaglio ≤ 300 nm
      NOTA: Qui, utilizzeremo l'effetto interferometrico per la fresatura diretta36.
      1. Nella GUI di Python, selezionare il target di interesse nel micrografo a fluorescenza. Il software inizierà automaticamente a tracciare la luminosità in funzione del tempo ad ogni nuovo fotogramma.
      2. Inizia fresando dall'alto verso il basso attraverso un bersaglio di prova. Monitora il contrasto della frangia appena prima di fresare il bersaglio attraverso l'intensità della fluorescenza. Il target di fluorescenza viene continuamente adattato a una gaussiana 2D, con l'adattamento utilizzato per ottenere un'intensità integrata che viene poi tracciata.
      3. Dopo che il target è stato fresato, adattare le oscillazioni nella traccia di intensità alla seguente funzione del modello utilizzando Python-GUI:
        figure-protocol-1
        Dove A è l'ampiezza dell'oscillazione, λ la lunghezza d'onda dell'eccitazione, k un termine di smorzamento che rappresenta la lunghezza di coerenza della sorgente luminosa, un fattore di fase Φ e d è la distanza dall'oggetto di cattura. Dall'obiettivo del test, tutti i termini possono essere previsti entro limiti ragionevoli in modo tale che la distanza, d, sia l'unica variabile libera utilizzata per dire all'utente dove si trova l'oggetto fluorescente rispetto alla sua fresatura. Vedi Sica et al. per maggiori dettagli36.
        NOTA: Per i target successivi, il toolkit adatterà in tempo reale la traccia di intensità con la stessa funzione del modello e stimerà dove interrompere la fresatura dall'alto verso il basso. Tutti i raccordi vengono eseguiti contemporaneamente alla fresatura. L'obiettivo è quello di arrestare la fresatura quando il bersaglio si trova a una profondità pari alla metà dello spessore della lamella desiderato al di sotto della superficie superiore.
      4. Al termine della fresatura dall'alto verso il basso, finalizzare la lamella fresando dal basso verso l'alto in modalità sezione trasversale di pulizia fino a raggiungere lo spessore desiderato.
  9. Scatta un'immagine a fluorescenza post-fresatura.

6. Microscopia ottica correlativa e raccolta della serie tilt

  1. Dopo aver trasferito il campione a CryoTEM, raccogliere una panoramica dell'atlante della griglia a 182x per consentire una copertura sufficiente di tutte le griglie.
  2. Con un ingrandimento intermedio appropriato compreso tra 6.500x e 11.000x, raccogli una serie di immagini di montaggio della lamella finale con un'inclinazione di 0°.
  3. Leggi le immagini di fluorescenza multicanale post-fresatura e l'immagine di proiezione del passaggio 6.2 in un software di trasformazione proiettiva personalizzato per la registrazione del ROI (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
  4. Scegli un totale di 8-10 coppie di punti di riferimento per calcolare con precisione la trasformazione proiettiva dell'immagine.
    NOTA: Questi punti possono essere caratteristiche evidenti (ad esempio, bordi delle lamelle, contaminazione visibile del ghiaccio o fori della griglia aperta) presenti sia nella microscopia ottica in campo chiaro che nella microscopia elettronica.

7. Collezione della serie tilt ad alto ingrandimento

  1. Utilizzare questa immagine di microscopia elettronica a fluorescenza e trasmissione sovrapposta come riferimento per gli utenti per selezionare un'area di imaging entro il limite delle dimensioni del fotogramma della fotocamera per la raccolta di serie di inclinazione ad alto ingrandimento.
  2. Selezionare l'ingrandimento e i parametri della serie di inclinazione in base alla questione biologica.
    NOTA: Per la dimostrazione, abbiamo raccolto dati da 54° con incrementi di 2° a una dimensione dei pixel di 3,5 Å 41,42,43.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo marcato le cellule macrofagiche differenziate con il marcatore di tubulina SiR-tubulina prima del congelamento. Seguendo il protocollo, abbiamo identificato l'MTOC come un singolo punctum fluorescente di ~ 1 μm di diametro al microscopio a fluorescenza (Figura 1A). Inoltre, abbiamo osservato strutture fluorescenti simili a fibrille che si irradiano dal MTOC verso la periferia cellulare, coerenti con la rete di microtubuli (Figura 1A). Le istantanee di fresatura a gradini a diversi spessori del campione sono mostrate nella Figura 1B. In particolare, quando la lamella ha raggiunto uno spessore di circa 800 nm, il singolo puntto MTOC si è risolto in due macchie adiacenti, ciascuna di circa 700 nm di diametro. Le analisi successive hanno confermato che ogni macchiolina corrispondeva a un singolo centriolo.

L'imaging e la fresatura simultanei ci hanno permesso di monitorare le variazioni dell'intensità della fluorescenza in tempo reale. In particolare, abbiamo osservato un aumento della fluorescenza dopo la rimozione del materiale non fluorescente e del film di supporto assorbente (Figura 1B-D). Man mano che la lamella veniva assottigliata da 2 μm a 800 nm, l'intensità della fluorescenza diminuiva drasticamente, riflettendo la progressiva rimozione delle strutture marcate. Questo declino è continuato quando la lamella è stata ulteriormente assottigliata al di sotto dei 200 nm (Figura 1B-D). L'immagine a fluorescenza correlata e l'atlante della microscopia elettronica dimostrano che il nostro flusso di lavoro consente un targeting preciso per la fresatura (Figura 2A). I tomogrammi ricostruiti e i modelli segmentati rivelano che i centrioli sono composti da triplette di microtubuli, in linea con i precedenti rapporti 42,43,44,45 (Figura 2A,B). Nei casi in cui solo una macchiolina fluorescente è conservata nella lamella finale, osserviamo un singolo centriolo nel tomogramma corrispondente (Figura 2B).

figure-results-1
Figura 1: Flusso di lavoro del CryoFM-FIB-SEM tri-coincidente per la localizzazione precisa del centro di organizzazione dei microtubuli. (A) (a sinistra) Microscopia su cellule vive e (a destra) CryoFM del MTOC. Barra graduata = 10 μm. (B) Istantanee graduali di CryoFM e CryoFIB per una fresatura mirata. La vista FM ravvicinata è indicata da caselle tratteggiate gialle. I centrioli sono contrassegnati da frecce gialle. Barra di scala = 5 μm. (C) Intensità di fluorescenza del MTOC durante la macinazione CryoFIB. (D) Profilo della linea di fluorescenza attraverso l'MTOC preso in diverse fasi durante la macinazione CryoFIB. Abbreviazioni: CryoFM-FIB-SEM = Microscopia criogenica a fluorescenza con fresatura a fascio ionico focalizzato e microscopia elettronica a scansione; MTOC = centro di organizzazione dei microtubuli; ROI = regione di interesse. Questa figura è adattata da Wang39. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Dettagli molecolari dell'MTOC rivelati dal flusso di lavoro tri-coincidente CryoFM-FIB-SEM. (A) FM, EM E MODELLO DI SEGMENTAZIONE CORRELATI DELL'MTOC. (a) Immagine FM post-fresatura. Questa è la stessa immagine dell'ultimo pannello della Figura 1B contrassegnata come 180 nm ma ruotata per corrispondere alla ricostruzione e alla segmentazione CryoET. Barra di scala = 5 μm; (b) Vista ingrandita dell'area tratteggiata in giallo da (a). (c) Proiezione FM e TEM correlata dell'area tratteggiata in ciano indicata al punto (2). Barra di scala = 1 μm. (d) Modello segmentato di ricostruzione tomografica nella regione di interesse (giallo, centriolo; verde, microtubulo). Barra della scala = 100 nm. (B) Immagini FM rappresentative e fette tomografiche di due diverse lamelle che presentano diversi orientamenti centrioli. FM: Barra di scala = 5 μm. Sezione tomografica: Barra della scala = 200 nm. Abbreviazioni: CryoFM-FIB-SEM = Fresatura criogenica a fascio ionico focalizzato con microscopia elettronica a scansione; MTOC = centro di organizzazione dei microtubuli; FM = microscopia a fluorescenza; ET = trasmissione di elettroni; TEM = microscopia elettronica a trasmissione. Questa figura è adattata da Wang39. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I nostri risultati evidenziano l'utilità della piattaforma di imaging tri-coincidente, che consente l'imaging a fluorescenza e la fresatura simultanei. Sfruttando questo feedback, dimostriamo due strategie di fresatura guidate dalla fluorescenza, semi-distruttive e interferometriche, che evitano la necessità di approcci ingombranti e basati sulla registrazione che devono affrontare limitazioni fondamentali di precisione legate alla mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione e al movimento durante la fresatura 12,33,46. Inoltre, poiché la guida precisa si basa sulla microscopia a fluorescenza piuttosto che sul SEM, la radiazione ottica non porta a danni rilevabili fintanto che l'intensità è mantenuta al di sotto della soglia che porta alla devitrificazione37,47. Le capacità qui dimostrate ampliano i campioni biologici accessibili per includere bersagli di interesse rari e piccoli (<300 nm di estensione assiale), semplificando al contempo il flusso di lavoro.

Il passaggio chiave di questo protocollo consiste nel determinare quando interrompere la fresatura in base alle variazioni della luminosità fluorescente di un target di interesse. Attualmente, ciò comporta un rapido intervento manuale per fermare la fresatura nei tempi desiderati. Questo metodo si è dimostrato sufficiente per gli attuali obiettivi che sono stati esplorati, ma future modifiche potrebbero integrare ulteriormente il toolkit Python nel sistema FIB per fermare direttamente la fresatura. Questa modifica può essere necessaria se sono necessarie velocità di fresatura più elevate, in quanto ciò darà meno tempo per l'intervento manuale. In alternativa, se è possibile tollerare velocità di fresatura più lente, in questo modo si avrà più tempo per l'intervento manuale, se necessario.

Dopo la generazione di strutture biologiche di interesse contenenti lamelle, il nostro software di trasformazione delle immagini personalizzato consente la correlazione a livello di CryoTEM, utilizzando panoramiche dell'atlante delle lamelle per guidare la raccolta dei dati CryoET. Nel complesso, il protocollo qui presentato è essenziale per l'imaging di bersagli biologici marcati in fluorescenza, piccoli e rari mediante tomografia elettronica criogenica in campioni cellulari eucariotici spessi. Rispetto ai sistemi Cryo-FIB esistenti non coincidenti, come Aquilos 2 con iFLM, il nostro flusso di lavoro raggiunge un tasso di successo più elevato nel mirare a queste funzionalità.

Questa elevata precisione di puntamento va a scapito dell'efficienza. Poiché la fresatura è manuale anziché automatizzata, la produttività della generazione di lamelle è limitata. In una sessione di fresatura di 8 ore, produciamo tipicamente 6-8 lamelle, di cui circa cinque contenenti un bersaglio di interesse. Tuttavia, riteniamo che questo flusso di lavoro possa essere automatizzato in futuro per migliorare la produttività. L'automazione richiederebbe script personalizzati per monitorare continuamente le aree di fresatura attive nell'immagine FIB e tracciare l'intensità della fluorescenza in tempo reale per garantire la conservazione del target. Le sfide principali rimangono, tra cui quella di stabilire una comunicazione efficace tra tutti gli script personalizzati e il software di controllo sia per il CryoFIB-SEM che per il microscopio a fluorescenza.

Guardando al futuro, c'è molto lavoro da fare per incorporare altre tecniche avanzate di microscopia a fluorescenza discusse in precedenza, tra cui i biosensori fluorescenti, l'imaging a super-risoluzione e la microscopia confocale. Ciononostante, prevediamo che le geometrie tri-coincidenti diventeranno standard negli strumenti futuri e che l'imaging a fluorescenza simultanea durante la fresatura diventerà di routine. Se è così, questo protocollo può servire come una guida preziosa per i ricercatori che mirano a catturare dettagli su scala molecolare delle piccole e rare strutture biologiche, che nonostante le loro dimensioni e abbondanza, sono fondamentali per la biologia cellulare.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i membri di Delmic per il loro aiuto nello sviluppo del flusso di lavoro di imaging. P.D.D. è stato supportato in parte dalla Panofsky Fellowship presso lo SLAC National Accelerator Laboratory nell'ambito del programma di ricerca e sviluppo diretto dal Dipartimento di Energia nell'ambito del contratto DE-AC02-76SF00515 e dal Dipartimento dell'Energia, Ufficio delle Scienze, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, nell'ambito del contratto n. DE-AC02-76SF00515 FWP 100883. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni AI127401 dal National Institutes of Health a G.J.J. J.W. J.W. è stato sostenuto dalla sovvenzione 2021-234593 della Chan Zuckerberg Initiative DAF, un fondo consigliato dalla Silicon Valley Community Foundation.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Crio-FIB Aquilos 2ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m
& gad_source=1&; gad_campaignid=12
764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS
s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid=
Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w
xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9
KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy
2EALw_wcB
Scatola cryo grid compatibile con AutogridScienze della microscopia elettronicahttps://www.emsdiasum.com/autogrid
-compatible-cryo-grid-box?srsltid=
AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk
cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Anelli Autogrid e clip a CNanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM Software SuiteDahlberg Research Group presso Stanford/SLAChttps://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Dragonfly 2022.1Sistemi di Ricerca sugli Oggettihttps://dragonfly.comet.tech/
ENZELDelmic B. V.Il sistema ENZEL è uno strumento personalizzato e attualmente non disponibile commercialmente
IMOD 4.12Università del Coloradohttps://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 dewar di azoto liquidoNanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023MathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Strumento manipolatore del coperchio per perniNanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Kit di strumenti PythonDahlberg Research Group presso Stanford/SLAChttps://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, mesh 200, griglia EM AuScienze della microscopia elettronicahttps://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
EM serialeUniversità del Colorado Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Nave standard Spearlab (transfer dewar)Nanosofthttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
PinzetteScienze della microscopia elettronicahttps://www.emsdiasum.com/style-3sa

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komeili, A., Li, Z., Newman, D. K., Jensen, G. J. Magnetosomes are cell membrane invaginations organized by the actin-like protein MamK. Science. 311 (5758), 242-245 (2006).
  2. Bykov, Y. S., et al. The structure of the COPI coat determined within the cell. eLife. 6, e32493(2017).
  3. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  4. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  5. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 12 (1), 150-167 (2017).
  6. Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ. Annu Rev Biochem. 86 (1), 873-896 (2017).
  7. Grimm, R., et al. Electron tomography of ice-embedded prokaryotic cells. Biophys J. 74 (2), 1031-1042 (1998).
  8. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  9. Tamborrini, D., et al. Structure of the native myosin filament in the relaxed cardiac sarcomere. Nature. 623 (7988), 863-871 (2023).
  10. Kaplan, M., et al. Bdellovibrio predation cycle characterized at nanometre-scale resolution with cryo-electron tomography. Nat Microbiol. 8 (7), 1267-1279 (2023).
  11. Schur, F. K. M., et al. An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation. Science. 353 (6298), 506-508 (2016).
  12. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophys J. 110 (4), 860-869 (2016).
  13. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. cryoEM: Methods and Protocols. , Springer. 49-82 (2020).
  14. Rigort, A., Plitzko, J. M. Cryo-focused-ion-beam applications in structural biology. Arch Biochem Biophys. 581, 122-130 (2015).
  15. Noble, A. J., de Marco, A. Cryo-focused ion beam for in situ structural biology: State of the art, challenges, and perspectives. Curr Opin Struct Biol. 87, 102864(2024).
  16. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  17. Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2006).
  18. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge freezing for electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. 481, 63-82 (2010).
  19. Chang, Y. -W., et al. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography. Nat Methods. 11 (7), 737-739 (2014).
  20. Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237.e3 (2020).
  21. Lin, C., Zhang, L., Zhang, Z., Jiang, Y., Li, X. Locating cellular contents during cryo-FIB milling using cellular secondary-electron imaging. J Struct Biol. 215 (3), 108005(2023).
  22. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nat Protoc. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  23. Carter, S. D., Mamede, J. I., Hope, T. J., Jensen, G. J. Correlated cryogenic fluorescence microscopy and electron cryo-tomography shows that exogenous TRIM5α can form hexagonal lattices or autophagy aggregates in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (47), 29702-29711 (2020).
  24. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705.e12 (2018).
  25. Perez, D., et al. Identification and demonstration of roGFP2 as an environmental sensor for cryogenic correlative light and electron microscopy. J Struct Biol. 214 (3), 107881(2022).
  26. Sartor, A. M., Dahlberg, P. D., Perez, D., Moerner, W. E. Characterization of mApple as a red fluorescent protein for cryogenic single-molecule imaging with turn-off and turn-on active control mechanisms. J Phys Chem B. 127 (12), 2690-2700 (2023).
  27. Sexton, D. L., Burgold, S., Schertel, A., Tocheva, E. I. Super-resolution confocal cryo-CLEM with cryo-FIB milling for in situ imaging of Deinococcus radiodurans. Curr Res Struct Biol. 4, 1-9 (2022).
  28. Dahlberg, P. D., Moerner, W. E. Cryogenic super-resolution fluorescence and electron microscopy correlated at the nanoscale. Annu Rev Phys Chem. 72 (1), 253-278 (2021).
  29. Perez, D., et al. Exploring transient states of PAmKate to enable improved cryogenic single-molecule imaging. J Am Chem Soc. 146 (42), 28707-28716 (2024).
  30. Li, S., et al. ELI trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  31. Loginov, S. V., Boltje, D. B., Hensgens, M. N. F., Hoogenboom, J. P., vander Wee, E. B. Depth-dependent scaling of axial distances in light microscopy. Optica. 11 (4), 553-568 (2024).
  32. Petrov, P. N., Moerner, W. E. Addressing systematic errors in axial distance measurements in single-emitter localization microscopy. Opt Express. 28 (13), 18616-18632 (2020).
  33. Yang, J., et al. Precise 3D localization by integrated fluorescence microscopy (iFLM) for cryo-FIB-milling and in situ cryo-ET. Microsc Microanal. 29 (Suppl. 1), 1055-1057 (2023).
  34. Perton, E., Boltje, D., Jakobi, A., Hoogenboom, J. Workflow for fluorescence-targeted lamella milling from vitrified cells with a coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Bio Protoc. 15 (14), e5390(2025).
  35. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. eLife. 11, e82891(2022).
  36. Sica, A. V., et al. Optical interference for the guidance of cryogenic focused ion beam milling beyond the axial diffraction limit. bioRxiv. , (2024).
  37. Dahlberg, P. D., Perez, D., Hecksel, C. W., Chiu, W., Moerner, W. E. Metallic support films reduce optical heating in cryogenic correlative light and electron tomography. J Struct Biol. 214 (4), 107901(2022).
  38. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
  39. Wang, J. Direct visualization of cellular protein complexes in situ by fluorescence-guided cryo-FIB-SEM and cryo-ET. , California Institute of Technology. (2025).
  40. Last, M. G., Tuijtel, M. W., Voortman, L. M., Sharp, T. H. Selecting optimal support grids for super-resolution cryogenic correlated light and electron microscopy. Sci Rep. 13 (1), 8270(2023).
  41. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  42. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  43. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  44. Meng, E. C., et al. UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis. Protein Sci. 32 (11), e4792(2023).
  45. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  46. Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506(2021).
  47. Li, Y., Kang, D. -D., Dai, J. -Y., Wang, L. -W. The cage effect of electron beam irradiation damage in cryo-electron microscopy. npj Comput Mater. 10 (1), 115(2024).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cryogenic Focused Ion BeamCryoFIB SEMFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTargeted Cell MillingCryogenic Electron TomographyCorrelative Light Electron MicroscopyMicrotubule Organizing CenterLamella PreparationReal Time Fluorescence Feedback

Articoli correlati