Utilizzo di biosensori a celle intere per misurare il mercurio ionico in campioni d'acqua

Sommario

Questo articolo presenta i protocolli per l'utilizzo di due biosensori a cellula intera (Mer-Blue e Mer-RFP) per rilevare il mercurio ionico. Fornendo procedure dettagliate per il loro funzionamento e l'analisi dei risultati, lo studio mira a facilitare una più ampia adozione e l'ulteriore sviluppo di queste tecnologie per il monitoraggio di specifici inquinanti.

Abstract

I biosensori a cellula intera (WCB) sono piattaforme strumentali per la scoperta e la caratterizzazione di elementi regolatori e per il progresso della bioingegneria. Sono anche molto promettenti per il monitoraggio ambientale e alimentare. Sebbene siano stati compiuti sforzi significativi per migliorarne la sensibilità e la portabilità, la standardizzazione del loro trattamento e dell'analisi dei dati rimane relativamente poco sviluppata. Questo articolo presenta una guida completa all'utilizzo di due WCB sviluppati di recente, Mer-Blue e Mer-RFP, che si sono dimostrati in grado di rilevare il mercurio ionico a livelli inferiori ai limiti dell'acqua potabile dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. I protocolli qui descritti comprendono la preparazione della coltura microbica, la calibrazione del sensore, l'acquisizione dei dati e l'analisi. Per il biosensore fluorimetrico Mer-RFP, viene utilizzato un nuovo teorema di allocazione della biosintesi per identificare l'intervallo di tempo per misurazioni dose-risposta affidabili e accurate. Per il biosensore colorimetrico Mer-Blue, una configurazione della fotocamera a basso costo consente misurazioni rigorose in ambienti privi di spettrofotometri e fluorimetri costosi, facilitando il monitoraggio decentralizzato dell'inquinamento. Vengono descritte le procedure utilizzate per l'analisi dei campioni di acqua dolce e vengono discussi i limiti di questi biosensori rispetto ai tipi di campioni. Condividendo queste tecniche di manipolazione e analisi, incoraggiamo gruppi di ricerca più ampi ad adottare e migliorare questi dispositivi biologici per lo sviluppo di soluzioni efficaci di monitoraggio ambientale. In definitiva, questa ricerca mira a facilitare l'adozione diffusa delle tecnologie dei biosensori all'interno della comunità delle scienze ambientali, contribuendo a un monitoraggio più efficace ed efficiente dell'inquinamento da oligoelementi in vari ecosistemi.

Introduzione

Con l'aumento delle preoccupazioni per l'inquinamento ambientale e la sicurezza dell'acqua e dell'approvvigionamento alimentare, i biosensori sono emersi come un'alternativa interessante e conveniente ai tradizionali metodi di chimica analitica. I metalli pesanti sono inquinanti altamente tossici che sono diventati sempre più diffusi a causa delle attività umane 1,2,3,4. Tuttavia, i metodi di rilevamento convenzionali⁵ sono spesso costosi e inaccessibili.

I....

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione di soluzioni ioniche di mercurio

1. Pesare una piccola massa di polvere di HgBr₂ (tipicamente tra 0,1 e 0,2 g) utilizzando guanti protettivi appropriati e una maschera per prevenire l'inalazione e l'esposizione della pelle.
2. Calcolare la quantità di acqua necessaria per ottenere una soluzione di 4 mM sciogliendo la massa misurata di polvere solida in ddH₂O utilizzando la formula:
   

Risultati

Entrambi i biosensori non mostrano alcuna espressione basale rilevabile delle rispettive proteine reporter in condizioni prive di mercurio. Le colture Mer-Blue iniziano tipicamente a mostrare una colorazione visibile ad occhio nudo tra 6-8 ore dopo l'inoculazione a concentrazioni di HgBr₂ di 25 nM e superiori. Se condotti correttamente, gli esperimenti di titolazione che utilizzano Mer-RFP o Mer-Blue producono risposte che si adattano a una funzione di Hill con un coefficiente di Hill vicino a 1, indicando un .......

Discussione

I circuiti dei biosensori utilizzati qui sono identici e differiscono solo per la proteina reporter. Entrambi sono interamente codificati su plasmidi ad alto numero di copie, consentendo il loro dispiegamento in cellule di Escherichia coli di vari ceppi. Sebbene funzionale nelle cellule del ceppo B di E. coli , un segnale colorato più forte da Mer-Blue è stato osservato nei ceppi K-12, in particolare DH5α e nelle cellule di E. coli chimicamente competenti¹⁵.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Legno multiplex di 3 mm di spessore	Molti distributori
Cavo USB da 5 V	Molti distributori
96 pozzetti Polistirene trasparente a fondo piatto Trattato TC Micropiastre	Corning	3599
Agar in polvere	HiMedia	GRM026
Ampicillina	Gold Biotechnology, Inc.	A-301-100
CaCl2	Millipore	208290
Acidi Casamino	Calbiochem	2040OP
D-(+)-glucosio	Central Drug House (P) Ltd.	506250
ESP32-CAM-MB 2640 Modulo fotocamera WiFi Bluetooth USB su porta seriale Download automatico (tipo C)	Molti distributori Provette per
coltura in vetro	Corning	9825
HgBr2, Bromuro di mercurio (II)	Merck	200085
HgCl2, Cloruro di mercurio (II)	Merck	21465
Brodo Luria (Miller)	Sigma-Aldrich	L3522
M9 sali minimi	Sigma-Aldrich	M6030
MgSO4	HiMedia	GRM684
NeoPixel Stick - 8 x 5050 LED RGB con driver integrati	Adafruit	1426
Plasmide: pUC-Mer-Blue	Il nostro	gruppo-Sequenza	completa disponibile in https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Plasmide: pUC-Mer-RFP	Il nostro	gruppo-Sequenza	completa disponibile in https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Filtri per siringhe, idrofili, dimensione dei pori 0,22 micron	Millipore	SLGV004SL	Per la sterilizzazione di campioni ambientali.