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Articolo metodologico

In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli trigeminali intatti

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DOI:

10.3791/68284

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1 agosto 2025

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1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

Abstract

L'imaging del calcio è uno strumento importante per monitorare i meccanismi di segnalazione che afflusso Ca2+ nel citosol o rilasciano Ca2+ dalle riserve intracellulari di Ca2+ . L'uso di topi Pirt-GCaMP3, che hanno il sensore Ca2+ GCaMP3 inserito a valle della regione del promotore di Pirt ed espresso in quasi tutti (>95%) i neuroni sensoriali primari, consente il monitoraggio simultaneo dell'attività di >3.000 neuroni tramite imaging Ca2+ dei neuroni sensoriali primari del ganglio trigemino (TG). Ciò consente ai ricercatori di studiare le risposte della rete neurale a stimoli nocivi e le risposte somatosensoriali e ormonali in vivo, che altrimenti sarebbero molto difficili da rilevare con altri metodi.

In particolare, la capacità di monitorare separatamente l'area TG che innerva il viso e altre aree della testa consente di monitorare i neuroni sensoriali primari attivati dagli stimoli dell'area del viso prima dei successivi strati di elaborazione neuronale. Si può anche osservare il numero di neuroni che generano transienti di Ca2+ e l'ampiezza dei transienti di Ca2+ , che indicano la loro sensibilità a diverse modalità sensoriali. Inoltre, gli investigatori possono misurare il diametro dei neuroni, che è un indicatore del tipo di fibra attivata (meccano-fibre non nocive vs. fibre nocicettive nocicattive, fibre Aβ, Aδ e C). Pertanto, l'imaging del calcio Pirt-GCaMP3 della TG sarebbe un potente strumento per sezionare specifiche modalità sensoriali e tipi di cellule neuronali per studiare il dolore di origine trigeminaria (orofacciale e craniofacciale, dolore dentale e/o dentale, cefalea, emicrania, dolore all'articolazione temporo-mandibolare, nevralgia del trigemino), prurito e tatto e qualsiasi altra somatosensazione, nonché le risposte ormonali.

Introduzione

I neuroni sensoriali primari innervano direttamente i tessuti, compresa la pelle, e trasmettono segnali sensoriali al sistema nervoso centrale (midollo spinale o tronco encefalico). I neuroni gangliari del trigemino (TG) innervano la testa e rispondono agli stimoli sensoriali, tra cui il dolore dai denti, dalla regione periorbitale, dalle regioni orofacciali e craniofacciali, dall'articolazione temporo-mandibolare 1,2 e dalle meningi 3,4,5. I neuroni TG variano in dimensioni, livello di mielinizzazione e profili di espressione genica 6,7,8,9. I neuroni più piccoli sono nocicettivi, mentre i neuroni più grandi generalmente rispondono a stimoli meccanici non dolorosi10,11. La disfunzione dei neuroni gangliari del trigemino può sensibilizzare sia i neuroni stessi che i neuroni sensoriali del sistema nervoso centrale (SNC) 11,12.

In un contesto fisiologico normale in condizioni non patologiche, l'attivazione dei neuroni in vivo è necessaria per il dolore, ma fino agli ultimi due decenni, gli strumenti per lo studio dei gangli sensoriali intatti in vivo sono stati limitati al monitoraggio di relativamente pochi neuroni alla volta13. A causa delle concentrazioni citoplasmatiche normalmente basse, dell'afflusso di calcio durante i potenziali d'azione e dell'uso del calcio come segnale citoplasmatico, la dinamica del calcio è un potente surrogato per monitorare i potenziali d'azione o l'attività cellulare in vivo utilizzando indicatori fluorescenti sensibili al calcio. Il razionale di questo metodo è che la microscopia a fluorescenza può monitorare simultaneamente questi indicatori in centinaia o migliaia di neuroni contemporaneamente nei gangli sensoriali periferici dei topi 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 e Ratti 25,26. Questo è un potente vantaggio rispetto ai metodi in grado di monitorare un numero più limitato di neuroni in vivo.

L'obiettivo di questo metodo è l'osservazione diretta della dinamica citoplasmatica del Ca2+ in vivo nel TG in risposta a stimoli meccanici, termici, chimici e ormonali in modelli di dolore da cefalea 19,23,24. Questo metodo può essere utilizzato come complemento al dolore o ad altri test somatosensoriali nell'area orofacciale. L'imaging trigemino in vivo del Ca2+ è stato utilizzato per caratterizzare la codifica termica e sensoriale19,22, studiare classi di meccanocettori27, scoprire una nuova classe di neuroni meccanosensibili28, monitorare le risposte del trigemino alle normali sollecitazioni meccaniche sulle meningi29, studiare gli effetti degli ormoni sulla sensibilità al dolore24, caratterizzare modelli di dolore orofacciale30e i contributori dello studio al dolore indotto dall'astinenza da alcol23.

I topi Pirt-GCaMP3 consentono il monitoraggio dell'attività neurale in vivo perché hanno il sensore Ca2+ GCaMP3 inserito nella regione del promotore del gene Pirt, che è altamente espresso in tutti (>95%) i neuroni sensoriali primari12,18. Questo articolo dimostra una tecnica per l'esecuzione dell'esposizione chirurgica alla TG in vivo e la raccolta e l'analisi dei dati di microscopia dell'indicatore di calcio per la TG sul lato destro dei topi Pirt-GCaMP3 utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.

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Protocollo

Tutte le procedure qui descritte vengono eseguite secondo i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali. L'intervento chirurgico non è di sopravvivenza. Le sezioni 1 e 2 di questa procedura devono essere eseguite immediatamente dopo l'avvio. La sezione 3 può essere eseguita in un secondo momento.

1. Fissaggio e chirurgia del mouse per l'imaging TG lato destro

NOTA: I topi Pirt-GCaMP3 C57BL/6Jdi 18 anni devono avere una corporatura adulta (di solito 8 settimane o più), indipendentemente dal sesso. È possibile l'imaging TG bilaterale. I tempi qui elencati sono stime di un tecnico esperto. Se il sanguinamento è superiore al normale, potrebbero essere necessari diversi minuti in più per ogni dato tempo.

  1. Preparare una soluzione salina sterile con 40 mg/mL di ketamina e 6 mg/mL di xilazina. Preparare un volume sufficiente per l'intervento chirurgico e l'eutanasia dopo l'imaging (minimo 9 μl per grammo di peso corporeo del topo).
    NOTA: Durante l'imaging in vivo sono stati utilizzati molti tipi di anestesia. Attenzione: la ketamina è dannosa se iniettata, ingerita o a contatto con gli occhi. Maneggiare con cura.
  2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore a microsfere. Lavare gli strumenti con etanolo al 70%.
    NOTA: In alternativa, sterilizzare preventivamente gli strumenti in autoclave.
  3. Iniettare 2,25 μL di ketamina/xilazina per grammo di peso corporeo (90 mg/kg e 13,5 mg/kg di ketamina e xilazina, rispettivamente) i.p. nei topi Pirt-GCaMP3 15-25 minuti prima dell'intervento chirurgico. Non superare i 120 mg/kg di ketamina.
  4. Dopo 15-25 minuti di iniezione di anestetico (passaggio 1.3), pizzicare la zampa posteriore con una pinza per assicurarsi che il topo sia su un piano di anestesia chirurgica.
    NOTA: Il pizzico dovrebbe essere abbastanza intenso da causare vocalizzazione in un topo cosciente, ma non abbastanza intenso da causare lesioni. È importante non lasciare il mouse in questo passaggio più a lungo del necessario per evitare un calo della temperatura corporea. Mantenere la gabbia calda è utile, se possibile.
  5. Posizionare il mouse su un termoforo per garantire che la temperatura corporea sia mantenuta a 37 °C e posizionare la testa del mouse in una maschera stereotassica (Figura 1A, B), con la testa inclinata di circa 15° a sinistra (Figura 1B).
    NOTA: Qui viene descritta una maschera stereotassica che stabilizza la testa e fornisce una via per somministrare l'isoflurano. Se una procedura non utilizza l'isoflurano o non viene utilizzata una maschera stereotassica, è necessario utilizzare un altro metodo di stabilizzazione della testa per impedire il movimento.
  6. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire secchezza e irritazione, poiché l'irritazione induce l'attività del nervo trigemino.
  7. Radere il lato destro della testa del mouse.
    NOTA: Questo passaggio richiede 90 s. L'investigatore può rimuovere brevemente l'animale dal termoforo per la rasatura.
  8. Praticare un'incisione rettangolare di 9 mm x 5 mm tra l'orecchio destro e l'occhio destro (Figura 2A). Fermare l'emorragia con un tampone emostatico o una salvietta da laboratorio.
    NOTA: Questo passaggio dura 2 minuti. L'investigatore può utilizzare una pinza emostatica o un divaricatore per mantenere aperta l'incisione. Si tratta di una procedura che non richiede la sopravvivenza, il che significa che non è necessaria una pulizia aggiuntiva. Tuttavia, lo sperimentatore può tamponare il sito chirurgico con iodio povidone. Viene fornita la dimensione massima consentita dell'incisione. Se il chirurgo è sufficientemente qualificato, è preferibile un'incisione più piccola a un'incisione più grande per ridurre al minimo il danno tissutale. Il TG innerva questo tessuto e potrebbe essere danneggiato.
  9. Tagliare il tessuto (periostio) sulla superficie del cranio appena ventrale all'occhio (Figura 2B).
  10. Utilizzando un trapano dentale e una fresa TNT 31p, praticare un foro di circa 9 mm x 5 mm nel cranio dorsale centrato sul sito dell'incisione (Figura 2C). Applicare la fresa il più delicatamente possibile sulla superficie del cranio.
    NOTA: Questo passaggio richiede circa 2 minuti. Se il chirurgo è sufficientemente qualificato, un foro più piccolo è preferibile a un foro più grande.
  11. Inclinare la testa fino a quando il TG è chiaramente visibile (Figura 2C). In caso di sanguinamento sul TG, aspirare il sangue o rimuovere il sangue con un tampone emostatico o una salvietta da laboratorio. Assicurarsi che il TG sia chiaramente visibile senza rimuovere alcun tessuto corticale (Figura 2C).
    NOTA: Di solito immaginiamo la TG per 3-6 ore o più senza segni di sofferenza nei neuroni, ma un ricercatore può scegliere di posizionare un vetrino coprioggetti o un'altra copertura per evitare che la TG si secchi.
  12. Sposta l'animale e il termoforo sul tavolino del microscopio e posiziona il naso del topo nel cono stereotassico. Collegare le linee ossigeno/isoflurano in modo che il topo riceva un'anestesia continua con isoflurano (Figura 3A).
    NOTA: Questo passaggio dura 3 minuti. L'isoflurano continuo richiede serbatoi di ossigeno, tubi di erogazione del gas e un vaporizzatore per anestesia. È anche possibile mantenere l'anestesia durante tutta la procedura mediante iniezioni periodiche di anestetico.
  13. Posizionare la cornice stereotassica in modo che l'obiettivo del microscopio si trovi 9 mm direttamente sopra l'apertura cranica (Figura 3B).
    NOTA: La distanza esatta dipende dall'obiettivo, dal microscopio e dal mouse.
  14. Inserire il termometro rettale. Collegare il cavo di alimentazione al termometro rettale e al termoforo. Collegare la maschera per anestesia all'isoflurano nella linea dell'ossigeno con l'1% di isoflurano.

2. Imaging TG

NOTA: Utilizzare l'impostazione verde (FITC) 495 nm, emissione 519 nm, lunghezza d'onda di rilevamento 500-580 nm, dispositivo di imaging GaAsP-Pmt1, rivelatore GaAsP-PMT o utilizzare le impostazioni consigliate per il microscopio. Vedere la Tabella 1 per un riepilogo delle impostazioni del software.

  1. Utilizzare un obiettivo M27 5x/0,25, il software del produttore del microscopio e un microscopio a scansione laser confocale verticale. Individuare la superficie TG con il microscopio.
    NOTA: La scelta dell'obiettivo dipende dal microscopio e dalle preferenze dello sperimentatore.
  2. Regolare l'obiettivo e l'ogiva per rendere la superficie TG il più piatta possibile e avere la superficie più ampia possibile sul piano focale.
    NOTA: Un TG più piatto fornisce un'immagine più nitida, fa sì che il software componga filmati più nitidi, immagini più neuroni e semplifica e migliora l'accuratezza dell'analisi rispetto a un TG più inclinato.
  3. Mantenere il topo sotto anestesia applicando l'1-1,5% di isoflurano al flusso di ossigeno attraverso la maschera per anestesia.
    NOTA: L'animale deve essere monitorato attentamente durante tutta la procedura pizzicando la zampa posteriore ogni 20-30 minuti per garantire che l'animale rimanga sotto anestesia. La percentuale di isoflurano necessaria per mantenere l'anestesia dipenderà dal singolo topo. Se l'animale si muove durante un pizzicamento di prova, l'isoflurano deve essere aumentato. Se la respirazione diventa superficiale, l'isoflurano deve essere diminuito. ATTENZIONE: L'isoflurano è dannoso se inalato e può causare vertigini o sonnolenza. Evitare l'inalazione e assicurarsi che l'area di lavoro abbia una ventilazione sufficiente.
  4. Caricamento del protocollo di scansione ad alta velocità del microscopio: dimensioni del voxel 4,160 μm x 4,160 μm x 14 μm, 512 x 512 pixel, 10 sezioni ottiche Z-stack, 1,02 unità ariose (AU)/33 μm, 15% di potenza laser a 488 nm/75 mW, tempo di pixel 1,52 μs, tempo di linea 0,91 ms, tempo di fotogramma 465 ms, velocità di scansione LSM 8, scansione bidirezionale, guadagno del rivelatore GaAsP-PMT 550 V, Guadagno digitale 1.
    NOTA: Le impostazioni ottimali possono variare a seconda dei microscopi e degli animali.
  5. Scansiona il TG in brevi raffiche di 6-8 cicli. Crea proiezioni ortogonali delle scansioni (una scansione crea un fotogramma del filmato) per creare un filmato e controlla la nitidezza e la coerenza dell'immagine tra i fotogrammi. Se necessario, regolate la posizione del fotogramma stereoscopico e lo spessore della sezione ottica e ripetete questo passaggio fino a creare un filmato chiaro e coerente.
    NOTA: Questo passaggio deve essere ripetuto se la testa del mouse si muove o se l'investigatore riposiziona il mouse o regola il piano focale.
  6. Caricare il microscopio Protocollo di scansione ad alta risoluzione: dimensioni voxel 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 pixel, 6 Z-stack a fette ottiche, unità di airy 1,02 (AU)/33 μm, 20% 488 nm di potenza laser/100 mW, tempo di pixel 0,52 μs, tempo di linea 4,95 ms, tempo di fotogramma 20,26 s, velocità di scansione LSM 6, scansione bidirezionale, Guadagno del rivelatore GaAsP-PMT 550 V, guadagno digitale 1.
    NOTA: Le impostazioni ottimali dipendono dal microscopio e dall'animale. Se le cellule sono marcate con td-Tomato, impostare il microscopio per scansionare il canale rosso 592 nm di eccitazione/614 nm di emissione, la lunghezza d'onda di rilevamento 600-700 nm oltre al canale verde.
  7. Crea un'immagine ad alta risoluzione del TG.
    NOTA: questa immagine può essere utile per contare i neuroni, misurare il diametro dei neuroni deboli o fornire un'immagine dettagliata per distinguere se lo stesso neurone ha risposto a due stimoli diversi o se hanno risposto due neuroni diversi.
  8. Caricare il protocollo di scansione ad alta velocità del microscopio (vedere il passaggio 2.4).
  9. Registrare l'attività spontanea per 80 cicli (circa 10 min). Crea un filmato di proiezione ortogonale e verifica che le immagini siano sufficientemente chiare e coerenti per l'analisi.
    NOTA: Questo produce un numero sufficiente di frame per analizzare l'attività spontanea. Il numero può essere diminuito o aumentato a seconda di quanto sia importante l'attività spontanea per un particolare esperimento.
  10. Per applicare la stimolazione, impostare il microscopio per la scansione di 15-20 cicli.
    NOTA: Prestare attenzione quando si applicano stimoli per non muovere la testa del mouse. Spostare il TG di anche micron durante lo stimolo può interrompere l'imaging. La scansione consente ai cicli di stabilire una linea di base, uno stimolo e di osservare i neuroni dopo che lo stimolo è stato rimosso.
  11. Attendere il completamento dei cicli da 1 a 5 per generare una linea di base. Applicare la stimolazione durante le scansioni 6-10. Attendi almeno 5 minuti dopo ogni stimolo per evitare di desensibilizzare i neuroni.
    NOTA: Ogni stimolo richiede una scansione separata di 15-20 cicli. Applicare prima la stimolazione meccanica, seguita dal freddo, dal caldo e dalla stimolazione chimica. Applicare la stimolazione a bassa frequenza (ad esempio, bassa forza meccanica, temperatura vicina alla temperatura ambiente) prima della stimolazione ad alta frequenza (elevata forza meccanica, temperatura lontana dalla temperatura ambiente). Fare attenzione a non muovere il TG quando si applica la stimolazione. Se le scansioni possono essere udite chiaramente, la stimolazione può essere applicata immediatamente dopo la scansione 5. Tuttavia, qualsiasi metodo che fornisca una tempistica costante di stimolazione funzionerà. Vedi la discussione sull'ordine degli stimoli.
  12. Per von Frey nell'area innervata dalla parte V2 del TG, tenere il filamento e applicarlo ripetutamente sulla zona omolaterale sotto l'occhio e sopra la bocca da subito dopo la scansione 5 a subito dopo la scansione 10.
  13. Per von Frey nell'area innervata dalla parte V3 del TG, tenere il filamento e applicare ripetutamente sulla zona omolaterale appena sotto l'orecchio da subito dopo la fine della scansione 5 fino a subito dopo la fine della scansione 10.
  14. Per stimoli freddi e caldi, raffreddare o riscaldare il becher dell'acqua a un valore leggermente inferiore (per il freddo) o superiore (per il caldo) alla temperatura desiderata, quindi avviare la scansione utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Applicare lo stimolo con la pipetta di trasferimento subito dopo la scansione 5 nell'area omolaterale appena sotto l'occhio, sopra la bocca (per V2) o appena sotto l'orecchio (per V3).
    NOTA: Assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 1 °C e la temperatura desiderata per la scansione 5. Per evitare di desensibilizzare i neuroni, non applicare lo stimolo se la temperatura del becher non è corretta. Invece, raffredda o riscalda di nuovo l'acqua e riprova.
  15. Al termine degli esperimenti, iniettare 50 mM di cloruro di potassio per via sottocutanea nelle aree V2 o V3 a partire dal ciclo 6 per attivare e identificare tutti i neuroni responsivi.
  16. Dopo che tutti gli stimoli sono stati somministrati e registrati, sopprimere l'animale mediante sovradosaggio di ketamina/xilazina (200 mg per kg di ketamina, 30 mg per kg di xilazina o 5 μl per g della soluzione preparata al passaggio 1.1), quindi decapitare.

3. Protocollo per l'analisi

  1. Aprire il file di proiezione ortogonale utilizzando l'opzione di trascinamento della selezione . Seleziona il tipo di immagine da Immagine | Tipologia | Colore RGB. Opzionale: utilizzare il plug-in StackReg31 in Plugins | jars | StackReg per correggere gli artefatti di movimento e l'allineamento.
    NOTA: L'investigatore può scegliere il tipo di immagine in base alle preferenze. RGB semplifica la creazione di immagini a colori per la pubblicazione.
  2. Apri il ROI Manager utilizzando Analizza | Strumenti | Responsabile del ROI.
  3. Seleziona i neuroni attivi disegnando una ROI utilizzando lo strumento Ellisse o Rettangolo nella barra degli strumenti, quindi posizionala nel file ROI facendo clic sul pulsante Aggiungi nella finestra ROI Manager o premendo il tasto "t".
    NOTA: salva frequentemente i file ROI. Le ROI possono essere ripristinate trascinando il file ROI in ImageJ e facendo clic sulla casella Mostra tutto nella parte inferiore della finestra di ROI Manager. Il salvataggio di un file di .zip ROI semplifica l'analisi rispetto al salvataggio delle ROI come overlay. Un neurone che fluttua durante il periodo di riferimento dovrebbe essere escluso come spontaneamente attivo, piuttosto che come rispondente allo stimolo.
  4. In Analizza | Impostazioni di misurazione, selezionare Valore medio di grigio (facoltativo, ma consigliato: deselezionare tutte le altre caselle in Impostazioni di misurazione).
  5. Utilizzare la finestra ROI in Altro | Multi-Measure per misurare l'intensità.
    NOTA: A volte, i neuroni adiacenti sono troppo vicini per tracciare un ROI separato. Questi neuroni possono essere inclusi nel conteggio dei neuroni attivi, ma non possono essere inclusi nelle misurazioni dell'intensità transitoria.
  6. Multi-measure genera un file CSV in una nuova finestra denominata "Risultati". Salva il file CSV cliccando su File | Salva con nome. Apri il file .csv con un software per fogli di calcolo e salva il file come foglio di calcolo.
    NOTA: vedere File supplementare 1 per un modello di analisi.
  7. Calcola l'intensità del transitorio Ca2+ come ΔF/F0 = (Ft- F0)/F0, dove Ft è l'intensità dei pixel nel ROI al punto temporale di interesse e F0 è l'intensità di base determinata dall'intensità media dei 2-4 fotogrammi che precedono il transitorio Ca2+ per l'attività spontanea o i primi 1-5 fotogrammi per i transitori Ca2+ indotti dallo stimolo. Escludere tutti i neuroni che generano picchi di Ca2+ prima della stimolazione e non analizzare l'attività dopo la stimolazione.
  8. Per l'analisi dell'intensità transitoria Ca2+ , campionare in modo casuale approssimativamente lo stesso numero di neuroni da ciascun ganglio per evitare che i gangli che generano il maggior numero di neuroni rispondenti dominino l'analisi. Escludere i picchi con ΔF/F0 < 0,15.
    NOTA: Esistono metodi alternativi pubblicati per analizzare, includere ed escludere i neuroni 15,16,19,22,32,33,34,35.
  9. Misura il diametro dei neuroni calcolando la lunghezza media di una linea tracciata in ImageJ lungo i diametri più lungo e più corto utilizzando lo strumento Linea nella barra degli strumenti.
    NOTA: Un investigatore può anche misurare l'area e i parametri ellittici delle ROI per stimare il diametro.

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Risultati

Imaging di un gran numero di neuroni e di specifici rami del trigemino mediante scansione confocale del ganglio trigemino Pirt-GCaMP
Dopo l'esposizione chirurgica ai TG nei topi Pirt-GCaMP3, la microscopia confocale consente l'imaging di oltre >3.000 neuroni contemporaneamente (Figura 4). Ciò fornisce il potente vantaggio di osservare migliaia di neuroni TG contemporaneamente nel loro normale contesto fisiologico. I transitori spontanei di Ca2+ possono esser...

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Discussione

I disturbi del dolore dell'articolazione temporo-mandibolare e la parodontite apicale colpiscono rispettivamente circa il 5%36 e il 30-70%37,38 della popolazione generale. I neuroni sensoriali primari rilevano stimoli nocivi nella pelle, nella mucosa orale, nei denti e nelle regioni periorbitali e la loro plasticità contribuisce al dolore persistente. La coltura cellulare e gli espianti possono essere util...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal National Institutes of Health Grants R01NS0128574 and R01DE031477 (a Y.S.K.) e da un Rising STAR Award dal sistema dell'Università del Texas (Y.S.K.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Iniezione anasica (xilazina)Covetrus, Akorn33197
Flurar 5x/0,25 M27 obejctiveCal Zeiss420130-9900-000
Applicatori con punta in cotoneMckesson24-106-1S
Emostatico curvoStrumenti per la scienza13007-12
Regolatore di temperatura CCFHC40-90-8D
Termoforo DC TermoregolatoreFHC40-90-2-05
Pinze rivestite in ceramica DumontStrumenti per la scienza11252-50
Regolatore di temperatura CC FHCFHC40-90-8D
Fluriso (isoflurano)MWI Salute Animale, Gruppo Piramal501017
Friedman-Pearson RongeursStrumenti per la scienza16221-14
Schiuma gelPfizer09-0353-01
ImmagineJIstituti Nazionali di Sanitàij153
Ketaset (Ketamina)ZoetisKET-00002R2
Modello 923-B Supporto per testa per anestesia gassosa per topo (mouse adulto)Strumenti Kopf923-B
Nastro da palcoscenico verde luminescenteJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Sistema di manipoli da laboratorio elettrico compatto M35Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.M35
Matrx VIP 3000 Vaporizzatore di isofluranoSegno medio91305430
Forbici per micro dissezioneRobozRS-5882
Forbici a molla per micro dissezioneStrumenti per la scienza15023-10
Forbici a molla per micro dissezioneRobozRS-5677
Mini sonda termistore rettaleFHC40-90-5D-02
Forbici operativeRobozRS-6812
Mouse Pirt-GCaMP3 C57/BL/6JUniversità Johns HopkinsN/AEntrambi i sessi possono essere immaginati ugualmente bene. I topi dovrebbero avere almeno 8 settimane di vita a causa dell'espressione debole o intermittente del promotore di Pirt nei topi più giovani.
Cloruro di potassioFisher ScientificoBP366-500
Fotogramma stereotassicoKopf Modello 923-B923-B
Maschera sterotattica (attiva) per topi < 30 g con tubiRWD Scienze della vita68663
Fresa per fessura conica TNT (31P)Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.31P-ORO
td-Tomato C57BL/6J topiLaboratorio Jackson7909
Piastra superiore, 6" x 10"Newport290-TP
Pipetta di trasferimento, 3mLCole ParmerUX-06226-23
Mouse TrpV1-Cre C57BL/6JLaboratorio Jackson17769
Microscopio confocale Zeiss LSM 800Cal ZeissPannello LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Edizione Blu) 2.6

Riferimenti

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  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
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  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
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