Articolo metodologico

Modello murino di malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica con fibrosi

DOI:

10.3791/68294

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18 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Modello murino di malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) con disfunzione metabolica, alterazioni dell'espressione genica epatica e alterazioni istopatologiche epatiche che assomigliano alla MASLD umana, inclusa la fibrosi che progredisce allo stadio 3 di fibrosi avanzata. Questo modello può essere utilizzato negli studi di fisiopatologia della MASLD e negli studi preclinici di nuove terapie.

Abstract

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La fibrosi epatica è il più importante predittore di esiti avversi nella malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD). Negli studi preclinici sulla MASLD, i topi sono il modello di malattia più comunemente usato. Tuttavia, in questi modelli, la fibrosi epatica è difficile da indurre. Questo protocollo descrive un modello murino di MASLD in cui i topi Ay iperfagici vengono alimentati con una dieta ricca di grassi e fruttosio, che assomiglia alla dieta media negli Stati Uniti. I topi sviluppano steatosi epatica, lesioni, infiammazioni e fibrosi. La fibrosi progredisce da fibrosi pericellulare, stadio 1, dopo 16 settimane, a fibrosi a ponte, stadio 3 dopo 12 mesi. Questi topi sviluppano anche obesità, ipertrigliceridemia, intolleranza al glucosio e iperinsulinemia. Questo modello di malattia replica l'istopatologia epatica, le alterazioni dell'espressione genica epatica e la disfunzione metabolica della malattia umana. Questo protocollo include due metodi per quantificare la fibrosi: la colorazione istologica del collagene mediante rosso picro-sirio e la quantificazione del contenuto epatico di idrossiprolina. Questi metodi possono essere utilizzati per lo studio della fisiopatologia della MASLD e per studi preclinici di potenziali terapie.

Introduzione

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La malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) è la malattia epatica più comune, con una prevalenza dal 31% al 40% negli Stati Uniti e del 42% in tutto il mondo 1,2,3,4. I pazienti con MASLD possono sviluppare steatoepatite associata a disfunzione metabolica (MASH), precedentemente chiamata steatoepatite non alcolica (NASH), cirrosi e carcinoma epatocellulare 5,6. La MASLD aumenta il rischio di carcinoma epatocellulare e, in seguito al recente aumento della prevalenza della MASLD, è diventata la malattia epatica più comune nei pazienti che sviluppano il carcinoma epatocellulare 7,8. Nella MASLD, la fibrosi è il principale predittore della progressione verso la cirrosi e degli esiti clinici avversi, tra cui la morbilità epatica (scompenso epatico, insufficienza epatica o cancro al fegato) e la mortalità epatica 6,9,10,11. Di conseguenza, la Food and Drug Administration incoraggia lo sviluppo di terapie incentrate sulla MASH/NASH con fibrosi, nonché l'uso di modelli animali appropriati12.

Negli studi preclinici sui farmaci e negli studi meccanicistici sulla MASLD, i modelli murini sono i più comunemente usati13. Sono stati descritti migliaia di modelli murini di MASLD, suggerendo una mancanza di consenso su un modello ottimale13,14. La creazione di modelli ottimali deve affrontare diverse sfide. Sebbene sia relativamente facile indurre obesità e steatosi nei topi alimentandoli con diete ricche di grassi, la fibrosi epatica è più difficile da indurre 13,14,15,16. Nei modelli MASLD guidati da diete obesogeniche, la fibrosi si sviluppa lentamente17 Sebbene questa lenta progressione possa imitare meglio la malattia umana18, aumenta la durata e il costo degli studi sugli animali. Le diete ad alto contenuto di colesterolo (ad esempio, il 2%) favoriscono lo sviluppo della fibrosi; Tuttavia, diminuiscono anche la sintesi endogena del colesterolo, che è l'opposto dell'aumento descritto nella malattia umana15,16. Alcuni modelli MASLD utilizzano topi mutanti o geneticamente modificati; Tuttavia, possono avere delle avvertenze: i topi ob/ob sviluppano obesità, steatosi e insulino-resistenza, ma mancano di leptina, che è un mediatore della fibrosi; I topi privi di PTEN sviluppano steatosi ma non sviluppano insulino-resistenza 15,17. Pertanto, i modelli murini di MASLD richiedono spesso lunghi periodi di studio, diete ad alto contenuto di colesterolo o manipolazioni genetiche per sviluppare una fibrosi significativa14. Per affrontare alcuni di questi problemi, abbiamo sviluppato un modello murino in cui gli animali sviluppano MASLD con fibrosi che progredisce da fibrosi pericellulare/perisinusoidale (stadio 1) a fibrosi a ponte (stadio 3)19.

L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere questo modello di MASLD con fibrosi epatica e due metodi per quantificare la fibrosi: colorazione istologica del collagene mediante rosso picro-sirio e quantificazione del contenuto di idrossiprolina epatica.

Il razionale per lo sviluppo di questo modello è stato che i modelli animali più utili sono quelli che meglio replicano la malattia umana, sia nei driver della malattia che nelle alterazioni dell'istopatologia e dell'espressione genica. Pertanto, abbiamo utilizzato una dieta che assomiglia alla dieta media negli Stati Uniti, includendo quantità moderatamente elevate di grassi e fruttosio 19,20. Abbiamo somministrato questa dieta a topi portatori della mutazione del giallo di Agouti (Ay), che sono stati ampiamente utilizzati come modelli di obesità21. Questi topi esprimono ubiquitariamente la proteina agouti, un antagonista dei recettori della melanocortina, incluso MC4R, causando iperfagia e replicando l'aumento dell'assunzione di cibo che è comune nell'obesità umana 21,22,23. Questo modello ricapitola le alterazioni che definiscono la MASH, tra cui steatosi, danno epatocellulare, infiammazione, fibrosi e disfunzione metabolica.

I principali vantaggi di questo modello sono le caratteristiche che lo rendono simile alla malattia umana. Il modello utilizza una dieta di tipo occidentale, che è stata progettata per assomigliare alla tipica dieta statunitense e ha dimostrato di essere la dieta più efficace nel replicare il fenotipo della MASLD umana14,20. I topi sviluppano alterazioni istopatologiche epatiche simili a quelle descritte nei fegati degli esseri umani con MASH19,24. I topi sviluppano una disfunzione metabolica, che è un criterio essenziale per la diagnosi di MASLD5. I fegati dei topi con MASH mostrano cambiamenti nell'espressione genica che ricapitolano quelli negli esseri umani con MASH/NASH19. Uno studio recente ha confrontato 39 modelli murini di MASLD per la loro somiglianza con la malattia umana. Includeva topi knock-out MC4R, che condividono lo stesso meccanismo di iperfagia e hanno ricevuto la stessa dieta del modello che descriviamo14. Questo modello si è classificato al quinto posto (su 39) per la sua somiglianza con la MASLD umana valutata dal fenotipo, dall'istopatologia epatica e dalla trascrittomica14.

Ulteriori vantaggi di questo modello sono: i topi Ay sono disponibili in commercio presso il Jackson Laboratory e sono disponibili nel ceppo C57BL/6J, che è comunemente usato negli studi metabolici21,25; i topi mutanti sono facilmente identificabili dal colore del loro mantello di pelo; il modello può essere combinato con modelli di guadagno o perdita di funzione per studiare il ruolo di geni specifici nello sviluppo di MASLD; infine, il modello non utilizza carenze nutrizionali (carenza di colina o metionina), componenti alimentari insoliti (acido colico, etionina), un contenuto insolitamente elevato di nutrienti specifici (grassi trans) o epatotossine (tetracloruro di carbonio), che non sono cause comuni di MASLD e potrebbero non replicare la malattia umana 13,14,17.

Questo metodo è appropriato per lo studio dei meccanismi che contribuiscono allo sviluppo e alla progressione della MASLD, nonché per la valutazione degli interventi per il suo trattamento o prevenzione. Questo modello è particolarmente utile perché gli animali non solo sviluppano sia la steatoepatite che la disfunzione metabolica, ma sviluppano anche una fibrosi che progredisce allo stadio 3. Il modello potrebbe non essere appropriato per lo studio dei meccanismi che influenzano il comportamento alimentare (ad esempio, gli agonisti del GLP1R), poiché questi topi hanno iperfagia.

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Protocollo

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Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali del Brooklyn College; Numero di protocollo IACUC 318.

1. Modello murino di MASLD con fibrosi

  1. Alleva topi per produrre prole Ay. Formare coppie riproduttive con topi Ay (B6. Cg-Ay/J). Registra la data di nascita dei cuccioli.
  2. Assicurati che le cucciolate abbiano un numero simile di cuccioli per promuovere un'alimentazione e una crescita adeguate e uniformi. Cerca di avere da cinque a sei cuccioli per cucciolata, poiché è la dimensione media della cucciolata per i topi C57BL/6J. I cuccioli in più, preferibilmente quelli del sesso non necessari, possono essere soppressi o affidati.
    NOTA: L'uso di maschi Ay e femmine wild-type (C57BL/6J Jax 0000664) può migliorare l'efficienza dell'allevamento poiché i topi femmina C57BL/6J wild-type sono facili da ottenere e possono essere riproduttori migliori rispetto alle femmine di topi Ay.
  3. Prepara le gabbie per gli esperimenti come descritto di seguito.
    1. Identifica i topi Ay dal colore del mantello giallo. Assegna un'identificazione univoca a ciascun mouse e tagga o contrassegna i topi.
      NOTA: L'allele giallo agouti (Ay) del gene agouti conferisce un colore del mantello giallo. L'allele è semidominante negli eterozigoti. L'omozigosi provoca letalità embrionale. Pertanto, i topi con il colore del mantello giallo sono eterozigoti per il gene Ay.
    2. Svezzare i topi quando hanno 21 giorni. Raggruppa i topi che saranno alloggiati nella stessa gabbia durante lo studio. Ospita tre o quattro topi Ay per gabbia, secondo il peso corporeo previsto e le linee guida istituzionali.
    3. Somministrare cibo e acqua standard. Topi domestici a temperatura standard (20-23 °C) e umidità relativa (dal 40% al 60%) con un ciclo di luce e 12 ore di buio.
  4. Nutrire i topi Ay con una dieta ricca di grassi e fruttosio (dieta ad alto contenuto di grassi e fruttosio, HFFD) a partire dalle 8 settimane di età come descritto di seguito.
    1. Fornire ai topi Ay la dieta occidentale, che è ricca di grassi e saccarosio (Calorie aggiustate Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Preparare una soluzione contenente fruttosio (23 g/L) e glucosio (19 g/L) in acqua potabile. Sterilizzare la soluzione mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,2 μm e conservarla in flaconi sterili. Una volta aperta, conservare la soluzione in frigorifero.
    3. Fornire ai topi la soluzione contenente fruttosio e glucosio da bere, in bottiglie sterili. Sostituire la soluzione e i flaconi almeno una volta alla settimana, controllando la crescita di microrganismi.
    4. Utilizzare lettiere a gabbia prive di valore nutritivo (ad es. trucioli di legno).
  5. Alimentazione topi di controllo una dieta a basso contenuto di grassi e fruttosio come descritto di seguito.
    NOTA: Il tipo di topi di controllo da utilizzare dipende dal disegno dello studio: se i topi Ay-HFFD vengono utilizzati per valutare l'effetto dei farmaci, i topi di controllo possono essere topi Ay-HFFD trattati con un placebo. Se il modello viene utilizzato per studiare l'effetto di una modificazione genetica sullo sviluppo della fibrosi, i topi Ay-HFFD senza la modificazione genetica possono essere utilizzati come controlli. Se si desidera effettuare controlli senza MASH, seguire i passaggi descritti di seguito.
    1. Usa topi selvatici che sono compagni di cucciolata dei topi Ay. Possono essere identificati dal colore del mantello nero.
    2. Somministrare ai topi una dieta di controllo (Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485; denominata Low Fat and Fructose Diet, LFFD) a partire dalla stessa età. Fornisci ai topi acqua potabile regolare.
  6. Monitorare lo sviluppo dell'obesità pesando settimanalmente i topi, mettendo gli animali svegli in un contenitore tarato su una bilancia da laboratorio e registrando il loro peso.
  7. Assicurati che i topi abbiano sempre cibo e soluzione potabile sufficienti. Monitorare e registrare il consumo di alimenti e soluzioni per bere per stimare l'apporto calorico, se lo si desidera.
  8. Raccogliere i fazzoletti come descritto di seguito.
    1. Eseguire la raccolta dei tessuti dopo 16 settimane con la dieta HFFD. Eutanasia del topo per inalazione di anidride carbonica (o altri metodi approvati dall'IACUC dell'istituzione).
      NOTA: Dopo 16 settimane, i topi Ay alimentati con la dieta HFFD di solito hanno una fibrosi allo stadio 1; Prolungare il tempo porterà a una maggiore fibrosi, che progredisce allo stadio 3 dopo 9-12 mesi.
    2. Pesare il mouse e registrare il peso19.
    3. Raccogli il sangue se necessario. Per fare ciò, prelevare il sangue dalla vena cava inferiore con una siringa da 1 ml e un ago da 27 G dopo aver aperto l'addome e prima di sezionare il fegato (o utilizzare qualsiasi altro metodo approvato dall'IACUC).
    4. Sezionare il fegato aprendo l'addome con un'incisione sulla linea mediana, tenendo il fegato per l'ilo con una pinza e tagliando i legamenti che legano il fegato al diaframma e al retroperitoneo con le forbici. Pesare il fegato e registrare il peso.
    5. Sciacquare il fegato in una soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS). Fotografa il fegato e includi un righello o un altro oggetto come riferimento di dimensioni nell'immagine. Mettere il fegato in una capsula di Petri che viene posta sul ghiaccio.
    6. Sezionare campioni (circa 100-150 mg per campione) di diversi lobi, tra cui il lobo mediano, il lobo sinistro e il lobo destro. Assicurarsi che i campioni abbiano uno spessore non superiore a 4 mm per facilitare il fissaggio. Metterli in soluzione fissativa (formalina 10% o formaldeide 4%) per 24 ore e processarli per l'analisi istopatologica (vedi sotto).
    7. Sezionare ulteriori campioni di diversi lobi. Metterli in provette (1,5 o 2 mL), congelarli immergendoli in azoto liquido e conservarli a -80 °C. Questi campioni saranno utilizzati per misurare il contenuto di idrossiprolina.
    8. Raccogliere campioni di altri organi, se lo si desidera (tessuto adiposo, muscolo, ecc.)

2. Colorazione istochimica del collagene e quantificazione morfometrica

NOTA: I passaggi che richiedono l'uso di sostanze chimiche pericolose e/o volatili devono essere eseguiti in una cappa aspirante. Tutti i vetrini devono essere lavorati in parallelo utilizzando piastre di colorazione e supporti per vetrini.

  1. Preparare le sezioni del fegato come descritto di seguito.
    1. Fissare il tessuto epatico tenendolo in formalina (o formaldeide) per 24 ore a temperatura ambiente. Utilizzare un volume di fissativo 20 volte più grande del volume del tessuto. Quindi, trasferire i tessuti al 70% di etanolo. A questo punto il protocollo può essere messo in pausa.
      NOTA: I tessuti possono essere inseriti in cassette istologiche che vengono poi collocate in un contenitore con fissativo o, in alternativa, in contenitori singoli o provette.
    2. Incorporare i tessuti in paraffina. Questo di solito viene fatto da una struttura o da un servizio di istopatologia.
    3. Ottenere sezioni con uno spessore di 0,5 μm montate su vetrini (i vetrini non carichi sono adeguati). Lasciare asciugare le sezioni esponendole all'aria a temperatura ambiente. Una struttura o un servizio di base di istopatologia di solito lo fa. A questo punto il protocollo può essere messo in pausa.
  2. Deparaffinare e reidratare le sezioni come descritto di seguito.
    1. Deparaffinare le sezioni immergendole in due cambi di soluzione deparaffinante/chiarificante (xilene o citrisolv), per 5-15 minuti in ciascuna.
    2. Reidratare immergendo successivamente i vetrini in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 70% e acqua, per 5 minuti ciascuno.
  3. Colorazione di sezioni con rosso picro-sirio come descritto di seguito.
    1. Immergere le sezioni in una soluzione di rosso di Sirio (rosso diretto 80) 1 g/L in acido picrico 1,3% per 1 h. Non colorare molto più a lungo, poiché il rosso diretto può macchiare strutture diverse dal collagene (ad esempio, i nuclei). Aggiungere il verde rapido (1 g/L) alla soluzione colorante se si desidera una controcolorazione26. In alternativa, colorare i nuclei con l'ematossilina27 di Weigert.
    2. Riporre la soluzione di rosso picro-sirius in un contenitore chiuso, di vetro scuro o di plastica per la conservazione. La soluzione può essere riutilizzata più volte (per almeno 20 anni27).
  4. Immergere i campioni in etanolo (100%) per 5 minuti per disidratarli. Ripetere con un secondo cambio di etanolo.
  5. Immergere in una soluzione di chiarificazione (xilene o citrisolv) fino a quando non vengono rimossi singolarmente per il montaggio.
  6. Rimuovere un vetrino alla volta dalla soluzione di chiarificazione e rimuovere il liquido in eccesso tamponando su carta assorbente. Aggiungere il mezzo di montaggio (da 50 a 100 μl circa). Coprire la sezione con un vetrino coprioggetti e premere delicatamente il vetrino coprioggetti verso il basso per rimuovere le bolle d'aria. Lasciare asciugare all'aria.
    NOTA: A questo punto il protocollo può essere messo in pausa.
  7. Osservare le sezioni utilizzando un microscopio ottico con illuminazione a campo chiaro e obiettivi da 4x a 20x: il collagene appare rosso su uno sfondo giallo-arancio chiaro. Immagini di aree di interesse con una fotocamera a colori, secondo le istruzioni della fotocamera.
  8. Eseguire l'imaging con la microscopia a luce polarizzata come descritto di seguito.
    1. Attivare e regolare i filtri del polarizzatore e dell'analizzatore ortogonalmente per garantire che il collagene sia visibile e che il segnale di fondo sia minimo. Il collagene è visibile in bianco, giallo o arancione su uno sfondo scuro. Nelle sezioni con poca o nessuna fibrosi, il collagene nelle pareti dei vasi sanguigni sarà visibile. Mantenere le impostazioni, inclusa l'intensità dell'illuminazione, le stesse per tutti i campioni da confrontare.
    2. Immagine con una fotocamera monocromatica o in modalità monocromatica con una fotocamera a colori. Utilizzare un obiettivo con ingrandimento 4x. Scatta più immagini per sezione. Evita le aree vicino all'ilo se hanno grandi vasi sanguigni. Utilizzare le stesse impostazioni per tutte le immagini da confrontare.
  9. Eseguire la quantificazione morfometrica utilizzando Photoshop (alternativa a) come descritto di seguito.
    1. Quantifica l'area bianca nelle immagini, che corrisponde al collagene. In Photoshop, fai clic su Seleziona > gamma di colori, quindi seleziona Luci e regola i parametri Sfocatura e Intervallo per selezionare i pixel bianchi, corrispondenti al collagene. Successivamente, seleziona Finestra > Istogramma > Vista espansa e registra il numero di pixel selezionati, mostrato accanto al parametro Pixel. Utilizzare gli stessi parametri per tutte le immagini da confrontare.
    2. Quantifica l'area totale dell'immagine. In Photoshop, fai clic su Seleziona > tutto, quindi registra il numero totale di pixel come fatto in precedenza.
    3. Calcola la percentuale dell'area dell'immagine corrispondente al collagene dividendo il numero di pixel bianchi per il numero di pixel totali. I valori sono solitamente espressi come percentuali dell'area.
  10. Eseguire la quantificazione morfometrica utilizzando ImageJ (alternativa b) come descritto di seguito.
    1. Seleziona le aree bianche nelle immagini che corrispondono al collagene. Apri lo strumento Soglia facendo clic su Immagine > Regola > soglia (o premi Maiusc + T). Impostare l'intervallo di soglia per assicurarsi che solo le regioni macchiate di collagene (aree bianche) siano evidenziate in rosso (ad esempio, soglia minima 64; soglia massima: 255) e fare clic su Applica. Questo binarizzerà l'immagine, convertendo la regione del collagene in nera e lo sfondo in bianco.
    2. Misurare l'area totale dell'immagine facendo clic su Analizza > Imposta misure. Controllare l'area e visualizzare l'etichetta. Fare clic su OK. Fare clic su Analizza > Misura (o premere M sulla tastiera). La finestra Risultati visualizzerà l'area totale dell'immagine.
    3. Per misurare l'area e la percentuale di collagene, per prima cosa, abilita Limita alla soglia facendo clic su Analizza > Imposta misurazioni. Controllare l'area, la frazione di area (ImageJ calcolerà automaticamente la % di collagene), il limite alla soglia e l'etichetta di visualizzazione. Fare clic su OK. Quindi, fai clic su Analizza > misura (o premi M). La finestra Risultati mostrerà: Area di collagene (conteggio assoluto di pixel) e Frazione di area (% di collagene dell'immagine totale).
    4. Salva i risultati selezionando Salva con nome o copiali negli appunti e incollali in un foglio di calcolo.

3. Quantificazione dell'idrossiprolina epatica

NOTA: Le fasi che richiedono l'uso di basi forti e acidi devono essere eseguite con adeguati dispositivi di protezione individuale.

  1. Pesare i campioni di fegato preparati al punto 1.8.7 e registrare i pesi. Porre le aliquote di tessuto in una provetta adatta per l'omogeneizzazione. Aggiungere acqua deionizzata utilizzando un rapporto acqua/tessuto di 900 μl di acqua per 100 mg di tessuto.
  2. Omogeneizzare mediante battitura a cordone o altro metodo secondo le istruzioni del produttore fino a quando il tessuto non è completamente omogeneizzato, come valutato dall'osservazione visiva. A questo punto il protocollo può essere messo in pausa e gli omogeneizzati possono essere conservati a -20 °C.
  3. Eseguire la precipitazione delle proteine come descritto di seguito. I passaggi seguenti vengono eseguiti a temperatura ambiente, tranne quando viene specificata una temperatura diversa.
    1. Trasferire circa 500 μl in 1000 μl di omogeneizzato in provette da centrifuga da 1,5 ml. Trasferire lo stesso volume per tutti i campioni.
    2. Aggiungere acido tricloroacetico per una concentrazione finale del 12% (ad esempio, aggiungere 120 μL di acido tricloroacetico a 880 μL di omogeneizzato)28. Agitare brevemente per mescolare.
    3. Incubare i campioni in un bagno di ghiaccio/acqua per 30 minuti. Centrifugare a 6.000 x g a 4 °C per 10 min. Si forma un precipitato contenente la proteina. Rimuovere il surnatante per aspirazione. Mantieni i tubi sul ghiaccio.
    4. Aggiungere 1 ml di etanolo ghiacciato (100%) per lavare il pellet. Risospendere il pellet mediante sonicazione (o altro metodo) e verificare visivamente che il materiale sia risospeso. Centrifugare a 6.000 x g a 4 °C per 10 minuti e rimuovere il surnatante per aspirazione. Utilizzare le impostazioni di sonicazione secondo le istruzioni dell'apparecchiatura (ad esempio, utilizzando un sonificatore Branson SFX 150 con una micropunta di 3,2 mm di diametro, un'ampiezza del 70% per 10 s è efficace per la maggior parte dei campioni). Ripetere il lavaggio 2 volte.
    5. Lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti, o più a lungo se necessario.
  4. Eseguire l'idrolisi delle proteine come descritto di seguito.
    1. Aggiungere 800 μl di acido cloridrico 6 N alle provette contenenti il precipitato proteico. Risospendere il pellet mediante sonicazione (o altro metodo), utilizzando le stesse impostazioni del punto 3.3.4.
    2. Trasferire la sospensione proteica in provette di vetro o fiale con tappi a vite; chiudere ermeticamente. Incubare le provette in forno a 110 °C per 22 ± 2 h29.
    3. Provette da centrifuga a 16.000 x g per 10 min; Il particolato formerà un pellet. Questo di solito richiede il trasferimento dell'idrolizzato dalle fiale di vetro alle provette da centrifuga prima della centrifugazione.
    4. Trasferire il surnatante, che contiene idrossiprolina, in provette da 1,5 mL. A questo punto il protocollo può essere messo in pausa. Gli idrolizzati possono essere conservati a 4 °C.
  5. Preparare una curva standard per la concentrazione di idrossiprolina. Per i campioni di fegato con stadio di fibrosi da 1 a 3, utilizzando le quantità di tessuto indicate in questo protocollo, sono adeguate concentrazioni standard fino a 125 μg/mL (ad esempio, diluizioni seriali di 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 e 0 μg/mL). Preparare gli standard diluendo l'idrossiprolina in acido cloridrico 6 N.
  6. Trasferire 40 μl di ciascun campione e provette da centrifuga standard da 1,5 mL marcate. Aggiungere 10 μl di idrossido di sodio 10 N a ciascuno e agitare brevemente per mescolare.
  7. Eseguire l'ossidazione dell'idrossiprolina come descritto di seguito.
    1. Preparare un tampone acetato-citrato contenente acido acetico 1,2% v/v, acido citrico 46 g/L, acetato di sodio triidrato 120 g/L e idrossido di sodio 34 g/L in acqua deionizzata e regolare il pH del tampone a 6,5.
    2. Preparare una soluzione di 12,7 g/L di clorammina T in tampone acqua:n-propanolo:acetato-citrato (1:1:8 v:v:v). Per prima cosa, sciogliere la cloramina T in acqua mescolando, quindi aggiungere n-propanolo, mescolare, quindi aggiungere tampone acetato-citrato e mescolare.
    3. Aggiungere 450 μl di soluzione di clorammina alle provette con campioni e standard. Mescolare a vortice. Incubare a temperatura ambiente per 25 min30.
  8. Preparare il reagente di Ehrlich con 1 M 4-(Dimetilammino) benzaldeide in acido perclorico:propanolo 1:2 (v/v). Aggiungere 500 μl di reagente di Ehrlich a campioni e standard. Mescolare a vortice.
  9. Incubare a 65 °C per 20 minuti in un blocco riscaldante, a bagnomaria o in un'incubatrice. Al termine dell'incubazione, lasciare raffreddare i campioni e gli standard a temperatura ambiente.
  10. Misura l'assorbanza di campioni e standard a una lunghezza d'onda di 550 nm utilizzando uno spettrofotometro.
  11. Tracciare l'assorbanza rispetto alle quantità standard e utilizzare una regressione lineare per creare una curva standard. Utilizzare i parametri della curva standard per calcolare la concentrazione di idrossiprolina nei campioni.
  12. Calcolare la quantità di idrossiprolina nei campioni di fegato in base al volume totale dell'idrolizzato (passaggio 3.4) e normalizzare per la massa di tessuto corrispondente al volume di omogenato utilizzato per la precipitazione proteica (passaggio 3.3.1). Esprimere i risultati come ng di idrossiprolina per mg di tessuto. In alternativa, è possibile misurare la concentrazione di proteine negli omogeneizzati e esprimere i risultati come massa di idrossiprolina per massa di proteine.

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Risultati

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I topi Ay alimentati con HFFD aumentano di peso rispetto ai topi wild-type alimentati con LFFD e sviluppano obesità (Figura 1A). Aumentano di peso più rapidamente durante le prime 4 settimane di alimentazione HFFD, guadagnando circa 3-4 g/settimana. Dopo 8 settimane, aumentano di peso a una velocità simile a quella dei topi di controllo (circa 0,6 g/settimana)19. Dopo 16 settimane, i topi Ay alimentati con HFFD pesano circa 45-50 g (m...

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Discussione

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Questo protocollo descrive un modello murino di MASLD con fibrosi epatica che replica la malattia nell'uomo 5,6. I topi sviluppano steatosi epatica, come dimostrato dalla steatosi mista micro e macro-vescicolare in istologia e dall'elevato contenuto di triacilglicerolo epatico19. I topi sviluppano anche obesità, ipertrigliceridemia, intolleranza al glucosio e sono stati segnalati per avere ipertensione, ch...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health K22CA178098, R03DK101863 e R15DK131627 e da fondi di avviamento del Brooklyn College (a JMC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-(Dimetilamino)benzaldeideSigma-AldrichD2004
Acido aceticoVariNA
Dieta calorica aggiustataInotivTD.88137Dieta contenente grassi (42% kcal) e saccarosio (34% p/w). Altri fornitori offrono diete con la stessa composizione
B6. Cg-ay/JIl Laboratorio Jackson000021Il ceppo presenta la mutazione gialla letale di Agouti e uno sfondo C57BL6/J. Attualmente, il Jackson Laboratory ha la varietà criopreservata.
C57BL/6JIl Laboratorio Jackson000664
CentrifugaVariNACon rotore per tubi da 1,5 mL, refrigerati, in grado di raggiungere 16.000 xg.
CentrifugaVariNA
Cloramina-T idratoSigma-Aldrich857319
Acido citricoVariNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
EtanoloLaboratori di Decon2701
Soluzione di formalina, buffer neutroSigmaHT501128
FruttosioSigma-AldrichF0127
GlucosioSigma-AldrichG8270
Apparecchiature per l'elaborazione istologicaNANAL'incorporamento e la sezionamento possono essere effettuati nel laboratorio del ricercatore o in una struttura esterna
OmogeneizzatoreVariNALe battutrici a perline sono efficienti per processare più campioni. Possono essere utilizzati altri metodi di omogeneizzazione
Acido cloridricoVariNA
IdrossiprolinaSigmaH5534
Dieta di controllo a basso contenuto di grassiInotivTD.08485Dieta di controllo, povera di grassi (13% kcal) e saccarosio (12% p/w)
Microscopio equipaggiato per la microscopia a luce polarizzataVariNA
N-propanoloVariNA
Acido percloricoVariNA
Mezzo di montaggio PermountFisher ScientificSP15-100
Acido picrico, soluzione acquosa satura, spettroFisher18612375
Triidrato di acetato di sodioVariNA
Idrossido di sodioVariNA
SonicatorVariNASonicator è utile per sospendere i pellet nel passo 2.5, ma non è assolutamente necessario
Acido tricloroaceticoVariNA
Occhiali VWR Micro Cover, rettangolariVWR 48393-081
Vetri VWR Premium Superfrost Plus | VWRVWR 48311-703
Acqua, deionizzataVariNAAcqua deionizzata da un sistema di purificazione o acquistata da un fornitore.
XileniFisher ScientificX3FAgente di compensazione Citrisolv   (Fisher 22-143-975) viene venduta come alternativa ecologica

Riferimenti

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