Questo protocollo utilizza la crusca di frumento in un sistema di fermentazione rotatorio allo stato solido per migliorare la produzione di enzimi. Il substrato, integrato con induttori come la chitina, supporta la crescita fungina in condizioni controllate. I risultati dimostrano che le rese enzimatiche sono 4-6 volte superiori rispetto alla fermentazione sommersa, dimostrando l'adattabilità e l'efficacia del metodo per diverse applicazioni biotecnologiche.
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Articolo metodologico
Progettazione di sistemi di fermentazione allo stato solido per la produzione di enzimi extracellulari idrolitici polimerici da parte di funghi filamentosi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fermentazione allo stato solido (SSF) è un processo di bioconversione che utilizza un substrato solido che non si dissolve in un mezzo acquoso. I microrganismi crescono sulla superficie del substrato e penetrano nella sua matrice solida per estrarre i nutrienti essenziali per il loro sviluppo. La SSF è caratterizzata da una minima quantità di acqua libera, con un contenuto di umidità del substrato mantenuto superiore al 70%, e coinvolge tre fasi interconnesse: gassosa, liquida e solida. Questo protocollo descrive l'uso della crusca di frumento, un sottoprodotto agroindustriale, come substrato di base per la produzione di enzimi in un sistema rotativo. Il substrato è integrato con un induttore, come la chitina, il chitosano, l'amido o la cellulosa, per promuovere la sintesi delle proteine idrolitiche. Il sistema è altamente adattabile e consente l'uso di diverse forme fungine, tra cui micelio, spore o pellet. Nella metodologia descritta, l'induttore e il substrato vengono miscelati in un rapporto di 1:100 (p/p), sterilizzati in autoclave e regolati al livello di umidità desiderato con acqua sterile. Viene quindi aggiunto l'inoculo fungino e il sistema rotante funziona a 10 giri/min per garantire un'adeguata miscelazione e ossigenazione. Il sistema viene incubato per 6-8 giorni in condizioni di crescita ottimali per funghi mesofili o termofili/termotolleranti, migliorandone la versatilità. Dopo l'incubazione, l'enzima viene facilmente estratto utilizzando un tampone freddo appropriato (ad esempio, acetato, citrato o fosfato), a seconda del tipo di enzima. L'estratto viene chiarificato attraverso la centrifugazione e la filtrazione per ottenere un surnatante privo di cellule. L'enzima può quindi essere ulteriormente concentrato o purificato secondo necessità. I risultati hanno dimostrato un aumento di 4-6 volte dell'attività enzimatica rispetto alla fermentazione sommersa (SmF), evidenziando l'efficacia del sistema. La sua adattabilità a diversi substrati, induttori e specie fungine lo rende uno strumento prezioso per varie applicazioni biotecnologiche.
Introduzione
La fermentazione allo stato solido (SSF) è emersa come una tecnologia di bioconversione promettente e sostenibile per la produzione di enzimi, composti bioattivi e metaboliti secondari di alto valore. Questa tecnica prevede la crescita di microrganismi su substrati solidi con una quantità minima di acqua libera, simulando il loro ambiente naturale e consentendo un'efficiente attività metabolica1. L'obiettivo principale di questo protocollo è ottimizzare la produzione di enzimi attraverso un sistema SSF rotante che garantisca un migliore utilizzo del substrato, la diffusione dell'ossigeno e la scalabilità del pr....
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Protocollo
I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione del substrato
NOTA: Utilizzare una marca commerciale di crusca di frumento per ridurre al minimo le variazioni significative nelle caratteristiche del substrato. Ogni lotto di crusca di frumento varia a causa di molteplici fattori, il che lo rende un materiale eterogeneo difficile da standardizzare, con conseguenti fluttuazioni nel suo contenuto costitutivo. Se è necessario un materiale standardizzato, scegliere una matrice al....
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Risultati
La Figura 1A presenta la rappresentazione schematica del miscelatore rotativo utilizzato in questo sistema, che ha una capacità di sei provette coniche da 50 mL. La Figura 2B illustra i cambiamenti che si verificano nella crusca di frumento durante il condizionamento prima di entrare nel processo di fermentazione allo stato solido. Come visto, non sono stati osservati cambiamenti strutturali significativi.
La Figu.......
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Discussione
Questo studio delinea un protocollo rilevante per ottimizzare la produzione di enzimi attraverso sistemi di fermentazione allo stato solido (SSF), specificamente progettati per i funghi filamentosi. Di seguito, vengono discussi gli aspetti critici della metodologia, insieme al suo significato, ai limiti e alle potenziali applicazioni.
Il successo del protocollo dipende fortemente da passaggi chiave come la preparazione del substrato e dell'inoculo. Un corretto.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Secretaría de Investigación y Posgrado dell'Instituto Politécnico Nacional (SIP-IPN) attraverso i numeri di sovvenzione/progetto 20220487, 20230676, 20240793 e 20251269 assegnati a GGS e 20220492, 20230427, 20240335 e 20251139 assegnati a DROH. Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine a ENCB-IPN, alla Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación de México (Secihti), precedentemente nota come Consejo Nacional de Ciencia, Humanidades y Tecnología (CONAHCyT), e BEIFI-program, nonché al Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologías dell'Instituto Politécnico Nacional per i....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 125 mL di matraccio di Erlenmeyer | Sigma-Aldrich | CLS431684 | Per la coltura del micelio in mezzo liquido. |
| Provetta conica da 50 mL | Sigma-Aldrich | CLS430921 | Per la conservazione e la preparazione di substrati e inoculo. |
| Tampone in acetato, pH 5,6 | Sigma-Aldrich | 320866 | Per l'estrazione della chitinasi. |
| Filtri Centricon | Millipore | UFC905024 | Per un'ulteriore purificazione degli enzimi. |
| Camera di conteggio delle celle | Sigma-Aldrich | Z359629 | Utilizzato per contare le spore al microscopio. |
| Carta da filtro | Whatman | 1001-110 | Per filtrare l'estratto enzimatico. |
| Igrometro | Todomicro | - | Per misurare l'umidità relativa del substrato. |
| Induttore (ad esempio, chitina commerciale) | Sigma-Aldrich | Codice: C9752 | Utilizzato per migliorare la produzione di enzimi durante la fermentazione. |
| Tampone fosfato, pH 6,9 | Sigma-Aldrich | P5379 | Per l'estrazione dell'amilasi. |
| Agar di patata e destrosio | Sigma-Aldrich | P2182 | Terreno di coltura per la coltivazione del micelio fungino. |
| Brodo di patate e destrosio | Sigma-Aldrich | P6685 | Terreno di coltura liquido per la coltivazione del micelio fungino. |
| Miscelatore rotativo | Thermo-Fisher Scientifico | 88-861-051 | Per mantenere il substrato in movimento durante la fermentazione. |
| Componenti della soluzione salina (ad es. KH2PO4, Na2SO4, KCl, ecc.) | Sigma-Aldrich | Multiplo | Per la preparazione di una soluzione salina sterile, vedere la ricetta dettagliata nel protocollo. |
| Crusca di frumento | Mercato commerciale | - | Substrato per la fermentazione allo stato solido. |
Riferimenti
- Wang, J., et al. Fungal solid-state fermentation of crops and their by-products to obtain protein resources: The next frontier of food industry. Trends Food Sci Technol. 138, 628-644 (2023).
- López-García, C. L., Guerra-Sánchez, G., Santoyo-Tepole, F., Olicón-Hernández, D. R.
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Ristampe e permessi
