Algoritmi di richiamo dei picchi (WonderPeaks e PeakStream) come strumenti per migliorare l'analisi ChIP-seq e trascrittomica nei patogeni fungini

Sommario

Questo rapporto presenta WonderPeaks, un nuovo strumento computazionale per l'analisi dei dati RNA-seq e ChIP-seq. Questo strumento identifica con successo i picchi (leggi pileup) nei dati di sequenziamento, consentendo la caratterizzazione dei confini delle regioni non tradotte in RNA-seq e rilevando l'arricchimento della cromatina in ChIP-seq, fornendo preziose informazioni per la ricerca sui patogeni fungini.

Abstract

La caratterizzazione dei cambiamenti nell'espressione genica attraverso la trascrittomica e l'attività di regolazione della trascrizione è diventato un approccio fondamentale per comprendere le diverse risposte coinvolte nella patogenesi fungina. Questo articolo introduce due strumenti computazionali progettati per affrontare le sfide chiave nello studio della regolazione trascrizionale nei patogeni fungini, in particolare i non-modello con annotazione genomica limitata. In primo luogo, presentiamo WonderPeaks, un nuovo algoritmo di chiamata dei picchi che sfrutta la derivata prima dei dati genomici mappati provenienti da esperimenti di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per identificare picchi arricchiti nell'immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento (ChIP-seq). In secondo luogo, introduciamo PeakStream, un'estensione di WonderPeaks per l'annotazione di regioni non tradotte (UTR) 3' nei dati trascrittomici generati utilizzando la preparazione di librerie con priming poly(A). Insieme, questi strumenti forniscono una pipeline di analisi dei dati end-to-end, offrendo una soluzione di facile utilizzo per i ricercatori che studiano la regolazione della trascrizione nei funghi. Dimostriamo la loro efficacia con i dati del patogeno fungino Candida albicans, identificando con successo picchi verificati nei dati ChIP-seq e annotando UTR convalidati attraverso il confronto con i dati di sequenziamento dell'RNA totale nelle stesse condizioni. Discutiamo anche i limiti di WonderPeaks per i dati ChIP-seq rispetto agli attuali metodi all'avanguardia e proponiamo direzioni per miglioramenti futuri. In definitiva, questo lavoro fornisce una guida pratica e potenti risorse per lo studio della regolazione trascrizionale, con rilevanza immediata per i funghi patogeni e potenziali applicazioni in studi genomici più ampi.

Introduzione

I patogeni fungini sono un problema emergente per la salute globale, con infezioni in aumento negli ultimi anni¹. Molti di questi patogeni mostrano un'elevata resistenza antifungina e sono associati a tassi di mortalità significativi². Tuttavia, rispetto agli organismi fungini modello, molti funghi patogeni rimangono scarsamente caratterizzati, evidenziando la necessità di ulteriori ricerche sui loro meccanismi di patogenicità. Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) come il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-Seq) e il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq) svolgono un ruolo fondamentale nella scoperta dei meccanismi molecolari dell'espressione genica alla base della patogenicità fungina.

La qualità delle informazioni derivate dai dati NGS dipende fortemente dall'accuratezza del software utilizzato per l'analisi dei dati grezzi. Tra le sfide principali per l'analisi dei dati NGS c'è la chiamata dei picchi, ovvero l'identificazione accurata delle regioni di letture NGS arricchite, che è particolarmente complessa a causa dell'ampia varietà di tecniche di preparazione e sequenziamento delle librerie, che rendono impraticabile una soluzione universale. L'algoritmo MACS³, inclusa la sua versione più recente, MACS3, è ampiamente considerato come il gold standard per l'analisi dei set di dati ChIP-seq. Tuttavia, il MACS si basa su parametri definiti dall'utente, come la lunghezza minima del picco e la distanza massima, che potrebbero non essere universalmente applicabili e sono spesso difficili da determinare prima dell'analisi. In particolare, l'ultima versione di MACS3 include una funzione di analisi cut-off che consente agli utenti di stimare i parametri prima del picco di chiamata. Per migliorare le prestazioni, gli utenti possono anche fornire un elenco di regioni genomiche "nella lista nera" note per introdurre distorsioni dovute alla struttura della cromatina o alla variazione del numero di copie. Sebbene il MACS rimanga lo strumento di peak-calling più comunemente utilizzato e affidabile per i dati ChIP-seq, sono disponibili pochi algoritmi alternativi, in particolare per i casi che richiedono impostazioni di parametri altamente personalizzate.

L'RNA-Seq è una tecnica preziosa per studiare le risposte all'espressione genica di funghi patogeni durante la crescita in vivo, come nelle colture tissutali o nei modelli di infezione murina 4,5,6,7. È necessaria un'elevata profondità di sequenziamento per un'analisi accurata dell'espressione differenziale in queste condizioni, che può essere proibitiva in termini di costi e risorse ^8,9. I metodi di preparazione delle librerie come il sequenziamento della poliadenilazione (poli(A))-priming (3'RNA-Seq), che utilizza primer progettati per ricuocere le code di poli(A) dell'mRNA per la generazione di cDNA, possono aiutare a ridurre la profondità di sequenziamento necessaria per l'analisi dell'espressione genica¹⁰. Tuttavia, questo approccio si basa su annotazioni genomiche di alta qualità, in particolare delle regioni non tradotte 3' (UTR), dove i picchi degli eventi di pol(A)-priming sono tipicamente localizzati¹¹. Le annotazioni del genoma di molti patogeni fungini poco studiati mancano di annotazioni UTR, rendendo difficile l'uso di 3'RNA-Seq in questi organismi. Inoltre, la lunghezza UTR per un singolo gene può essere dinamica in diverse condizioni di crescita e tipi di cellule^12,13. Sebbene siano stati sviluppati numerosi nuovi strumenti di analisi per identificare e annotare gli UTR, molti di essi sono progettati per set di dati sui mammiferi, la cui organizzazione genica differisce notevolmente da quella dei funghi, o richiedono dati provenienti da esperimenti di sequenziamento indipendenti, come il sequenziamento di mRNA su singola cellula o inverso, che possono aumentare i tempi e i costi per un ricercatore che cerca di eseguire l'analisi del trascrittoma^{12, 14,15}.

In questo articolo, presentiamo WonderPeaks, un nuovo software di chiamata dei picchi, progettato secondo i principi della derivata prima, che può essere utilizzato per chiamare dinamicamente i picchi nei set di dati NGS (Figura 1). WonderPeaks identifica i picchi calcolando la derivata prima del segnale di copertura e utilizzando questo valore, la pendenza del picco, per definire i picchi potenziali. L'algoritmo cerca i casi in cui la derivata prima mostra un massimo locale al di sopra di una soglia di pendenza fornita dall'utente o dedotta dai dati (che indica un segnale in aumento), seguita da un minimo locale al di sopra della stessa soglia (che indica un segnale decrescente), rilevando così tutti i picchi candidati nel set di dati. Per le applicazioni ChIP-seq, WonderPeaks confronta tutti i picchi candidati tra i campioni di test e di controllo per identificare i picchi arricchiti in modo univoco. Applicando WonderPeaks a un set di dati ChIP-seq precedentemente pubblicato di un fattore di trascrizione nel patogeno fungino Candida albicans¹⁶, abbiamo dimostrato la sua capacità di identificare con successo i picchi a monte dei geni chiave evidenziati nello studio originale, discutendo anche gli attuali limiti dell'algoritmo in questa applicazione.

Introduciamo anche PeakStream, uno strumento software che sfrutta WonderPeaks per identificare i picchi nei set di dati 3'RNA-Seq. Le librerie 3'RNA-Seq dipendono da accurate annotazioni UTR 3', poiché le letture generate attraverso il poly(A)-priming spesso si estendono oltre il codone di stop delle sequenze codificanti (CDS) dei geni e quindi non vengono conteggiate quando si utilizzano annotazioni standard focalizzate esclusivamente sulle regioni codificanti. La pipeline di analisi PeakStream è stata progettata per creare nuove annotazioni genomiche utilizzando dati RNA-Seq 3', concentrandosi sulle regioni a valle delle regioni della sequenza codificante genica (CDS). PeakStream assegna questi picchi ai geni, generando una nuova annotazione del genoma da utilizzare nei programmi di conteggio delle letture a valle. Mostriamo che l'uso di PeakStream può identificare e assegnare con precisione i picchi generati da poli(A) a valle al gene appropriato in un set di dati 3'RNA-Seq C. albicans . PeakStream annota anche i picchi che difficilmente sono associati a qualsiasi annotazione genica corrente, facilitando la scoperta di possibili nuove trascrizioni. Insieme, PeakStream e WonderPeaks rappresentano una potente suite di strumenti di facile utilizzo per il rilevamento dei picchi nei set di dati di sequenziamento di nuova generazione (NGS).

Figura 1: Figura panoramica del richiamo dei picchi da parte di WonderPeaks e PeakStream. A sinistra: chiamata di picco utilizzando la derivata prima. In alto a destra: Peak-calling su set di dati ChIP-Seq utilizzando WonderPeaks. In basso a destra: Peak-calling su set di dati RNA-Seq utilizzando PeakStream. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Installazione (salta se completata)

1. Prerequisiti
   1. Installare Anaconda o Minconda per caricare i requisiti per eseguire la pre-elaborazione (sezione 5) e WonderPeaks (sezione 6 o sezione 7).
      NOTA: Per una guida per l'utente di Anaconda, vedere il riferimento¹⁶.
   2. Installa Python: Python all'interno di Anaconda o Miniconda.
   3. Installare Jupyter Notebooks per eseguire tutte le funzioni in questo metodo.
      NOTA: Una guida per l'utente per principianti per Jupyter Notebooks è disponibile nel riferimento¹⁷.
      ATTENZIONE: Per i genomi fungini (≤100 Mbp), assicurarsi di disporre di un ambiente di elaborazione con almeno 20 core, 8 GB di RAM e 30 GB di spazio disponibile su disco.
2. Installare le funzioni di pre-elaborazione.
   1. Nel terminale, eseguire: conda create -n WP_preprocessing
   2. Nel terminale, eseguire: conda activate WP_preprocessing
   3. Nel terminale, eseguire: conda env update --file environment.yml --name
      NOTA: Il environment.yml è un file che contiene tutte le dipendenze del pacchetto e deve essere scaricato da https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing.git.
   4. Nel terminale, eseguire: pip install WonderPeaks-preprocessing
   5. Nel terminale, eseguire: conda disattivare WP_preprocessing
3. Installa le funzioni di WonderPeaks:
   1. Nel terminale, esegui: conda create -n WonderPeaks
   2. Nel terminale, eseguire: conda attivare WonderPeaks
   3. Nel terminale, eseguire: conda env update --file environment.yml --name
      NOTA: Il environment.yml è un file che contiene tutte le dipendenze del pacchetto e deve essere scaricato da https://github.com/mgarber21/WonderPeaks.git.
   4. Nel terminale, esegui: pip install WonderPeaks
   5. Nel terminale, eseguire: conda disattivare WonderPeaks
      NOTA: i passaggi 1.2 e 1.3 consentono di ottenere i seguenti risultati: Creano un ambiente Conda dedicato per la pre-elaborazione (sezione 5) e WonderPeaks (sezioni 6 e 7), isolando le dipendenze per evitare conflitti con altri software. Attivano l'ambiente, configurandolo per l'installazione e l'esecuzione di funzioni specifiche di WP_preprocessing o WonderPeaks. Installano le dipendenze software e gli strumenti necessari per la pre-elaborazione dei dati. Disattivano l'ambiente quando non è in uso per evitare modifiche accidentali e liberare risorse di sistema.
4. Scarica Jupyter Notebooks e modelli dal repository GitHub di WonderPeaks. Caricare i download di WonderPeaks sul sistema operativo contenente i dati grezzi (la directory verrà creata nella sezione 2).
   NOTA: i notebook Jupyter contengono script e modelli predefiniti necessari per l'esecuzione di flussi di lavoro di pre-elaborazione, WonderPeaks e PeakStream. Il caricamento nello stesso sistema dei dati grezzi garantisce che i percorsi e le directory siano allineati correttamente.

2. Creare una directory di dati

NOTA: i flussi di lavoro WonderPeaks e PeakStream richiedono che tutti i dati (grezzi ed elaborati) siano memorizzati nella stessa directory. Questo passaggio spiega come creare questa nuova directory ({data_directory} = /path/to/your/data) e come spostare i dati grezzi sperimentali (letture di sequenziamento non elaborate) in una cartella all'interno di questa directory chiamata raw_data.

1. Creare una directory di dati.
   1. Nel terminale, esegui mkdir {data_directory} (ad es. mkdir /percorso/del/tuo/dati)
2. Creare una sottodirectory di dati non elaborati per le letture di sequenziazione non elaborate.
   1. Nel terminale, esegui mkdir {data_directory}/raw_data (ad es. mkdir /percorso/del/tuo/dato /raw_data)
3. Spostare le letture di sequenziazione non elaborate nella directory dei dati non elaborati.
   1. Nel terminale, eseguire mv {current_path_to_raw_data}/*fastq* {data_directory}/raw_data (ad es. mv current/data/path/*fastq* /path/to/your/data /raw_data

3. Creare il file di input dell'utente (NGS_user_input.csv)

NOTA: Il file di input specifica le configurazioni generate dall'utente per l'esecuzione della pre-elaborazione e di WonderPeaks.

1. Scarica i NGS_user_inputs.csv del modello dal repository GitHub di WonderPeaks.
2. Aggiorna i campi in NGS_user_inputs.csv. Aggiornare i campi come segue:
   Directory dei dati: /percorso/del/tuo/dato
   Directory del genoma: /percorso/del/tuo/genoma
   Genoma fasta: genome.fasta
   Annotazione del genoma: genome_annotation.gtf (fornire il nome del file dell'annotazione del genoma in formato GTF)
3. Salvare i NGS_user_inputs.csv aggiornati nella directory dei dati creata nella sezione 2.
   ATTENZIONE: Non modificare il nome del file; WonderPeaks riconoscerà questo file solo se si chiama NGS_user_input.csv.

4. Crea file di metadati (NGS_user_metadata.csv)

NOTA: il file di metadati viene utilizzato per memorizzare tutte le informazioni rilevanti per l'esperimento. È possibile aggiungere colonne aggiuntive per descrivere le condizioni dell'esperimento, ma queste non influiranno sui passaggi successivi.

1. Scarica i NGS_user_metadata.csv del modello dal repository GitHub di WonderPeaks.
2. Aggiorna campi in NGS_user_metadata.csv I campi sono i seguenti:
   1. file: assicurati che il nome del file non contenga spazi, includa l'handle del file (ad esempio, fastq, fastq.gz) e non includa il percorso assoluto.
   2. bedgraph: Specificare se il file deve essere incluso in PeakStream impostando questo campo su TRUE o FALSE.
      1. Impostare il campo bedgraph su FALSE quando il file può essere ragionevolmente escluso dall'analisi PeakStream. Ad esempio, in un esperimento RNAseq, impostare il parametro bedgraph bedgraph=FALSE per i mutanti o altri casi in cui non sono previste differenze UTR tra i campioni. Tuttavia, assicurarsi di impostare il campo bedgraph su TRUE per tutti i file di controllo in un esperimento RNAseq e per tutti i file in un esperimento ChIPseq .
   3. fattore di progettazione
      1. fattore di progettazione1: specificare un fattore di progettazione rilevante per il disegno sperimentale (ad esempio, trattamento o sample_type).
      2. fattore di progettazione2: specificare un secondo fattore di progettazione rilevante per il disegno sperimentale (ad esempio, ceppo o epitopo). Per un esperimento RNAseq , includere il trattamento e la deformazione come fattori di progettazione tipici. La colonna del trattamento elenca i trattamenti applicati (ad esempio, controllo, farmaco1) e la colonna del ceppo elenca le informazioni sul ceppo (ad esempio, wildtype, mutante). Per un esperimento ChIPseq , includere sample_type ed epitopo come fattori di progettazione tipici. La colonna sample_type elenca se la proteina è stata etichettata o non etichettata, mentre la colonna dell'epitopo elenca il nome dell'epitopo utilizzato.
         NOTA: i fattori di progettazione sono attributi specifici del disegno sperimentale.
         WonderPeaks è compatibile con i controlli senza tag o con i controlli di input come linea di base.
      3. Assicurarsi che le colonne del fattore di progettazione non includano un numero di replica univoco (ad esempio, sample_type: [tagged, tagged, untagged_control, untagged_control] non sample_type: [tagged_1, tagged_2, untagged_control _1, untagged_control _2]. Se si specificano numeri di replica univoci, si verificherà un errore durante l'esecuzione.
      4. Assicurarsi di utilizzare i caratteri di sottolineatura (_) anziché gli spazi nei nomi dei fattori di progettazione.
      5. Per l'applicazione ChIPseq, assicurarsi che la colonna sample_type (o nome personalizzato) nel file di metadati includa termini che contengono parole, tag e controllo.
         NOTA: Ad esempio, le voci valide potrebbero includere taggato e untagged_control. Se si fornisce una colonna sample_type senza questi termini, si verificherà un errore durante l'esecuzione.
         ATTENZIONE: Per l'applicazione ChIP, l'utente deve specificare due fattori di progettazione.
      6. Aggiungete i fattori di progettazione alla riga di NGS_user_inputs.csv pertinente. Assicurarsi che i nomi delle colonne utilizzati per i fattori di progettazione siano elencati come stringa separata da punto e virgola (ad esempio, trattamento; filtrare o sample_type; epitopo).
         ATTENZIONE: I fattori di progettazione in NGS_user_inputs.csv devono corrispondere esattamente alle colonne di NGS_user_metadata.csv . Qualsiasi esecuzione non corrispondente genererà un errore durante l'esecuzione (Figura 2, Tabella supplementare S1 e Tabella supplementare S2).

Figura 2: Esempio NGS_user_input.csv e NGS_user_metadata.csv. Esempi di NGS_user_input.csv (pannello superiore) e NGS_user_metadata.csv (pannello inferiore), evidenziando la corrispondenza tra le colonne designfactor e designfactor con testo rosa o blu e frecce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Pre-elaborazione dei dati NGS

NOTA: Passare alla sezione 5 o alla sezione 6 se si utilizza la pre-elaborazione personalizzata.

1. Aprire Jupyter Notebook di pre-elaborazione NGS (NGS_Preprocessing.ipynb).
2. Attiva WP_preprocessing ambiente (creato nel passaggio 1.2) nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia del notebook.
3. Eseguire la prima cella tenendo premuto il tasto Maiusc e quindi premendo Invio (Maiusc+Invio).
4. Nella seconda cella del Jupyter Notebook, aggiorna il percorso della directory impostando Directory = "path/to/your/data", dove path/to/your/data/ è la directory creata nella sezione 2.
5. Genera file di allineamento. Le funzioni di pre-elaborazione eseguiranno il Trimming utilizzando FastP¹⁸; Controllo qualità con FastQC¹⁹ e MultiQC²⁰; Allineamento con STAR²¹. I file di allineamento dell'output vengono salvati in una sottodirectory denominata startout all'interno della directory dei dati (ad esempio, percorso/del/tuo/dati/starout); Filtraggio (opzionale) utilizzando samtools view²², filtra il file di allineamento per mantenere solo le letture al di sopra di una soglia specificata in NGS_user_inputs.csv.
   NOTA: queste funzioni elaboreranno solo singole letture (ad esempio, R1) del set di dati alla volta. Gli utenti possono specificare le opzioni di esecuzione per FastP e STAR nel NGS_user_inputs.csv (ad esempio, FastP: adapter_sequence (opzionale); STAR: genomeDir, genomeFastaFiles, sjdbGTFfil).
6. Esegui le funzioni di pre-elaborazione nella seconda cella con Maiusc + Invio.
   NOTA: il completamento delle attività nella seconda cella potrebbe richiedere diverse ore. Se la corsa viene interrotta, ripetere i passaggi 5.3-5.6 per riavviare la corsa. Lo stato di avanzamento dei passaggi precedenti non verrà sovrascritto e il processo continuerà da dove era stato interrotto.
7. Generare file di traccia della copertura dell'allineamento utilizzando BamCoverage²³ (vedere i passaggi 5.7.1 e 5.7.2).
   NOTA: Per ChIPseq, WonderPeaks richiede singoli file bedgraph contenenti copertura sia per le letture in avanti che per quelle inverse. Per RNAseq con priming Poly(A), PeakStream richiede due file bedgraph, uno per le letture dirette (_fwd.bedgraph) e uno per le letture inverse (_rev.bedgraph). Le letture dirette e inverse vengono generate utilizzando il parametro filterRNAstrand all'interno di BamCoverage²³.
   1. ChIPseq utilizzando i seguenti parametri: outfilfeformat="bedgraph", strand=None, binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      NOTA: Output: Produce singoli file bedgraph contenenti copertura sia per le letture in avanti che in quella inversa. L'output è memorizzato in /path/to/your/data/bedgraphout (Figura 3).
      1. Eseguire la funzione BamCoverage nella terza cella utilizzando MAIUSC + INVIO.
   2. RNAseq utilizzando i seguenti parametri: outfilfeformat="bedgraph", strand="forward" o "reverse", binsize=20, smoothLength=60, minMappingQuality=255, normalizeUsing="CPM".
      ATTENZIONE: Assicurarsi di eseguire la funzione due volte con il trefolo impostato su avanti o indietro per generare file per le letture in entrambe le direzioni.
      NOTA: Output: Produce due file bedgraph: uno per le letture dirette (_fwd.bedgraph) e uno per le letture inverse (_rev.bedgraph). L'output è memorizzato in /path/to/your/data/ bedgraphout (Figura 3).
      1. Eseguire la funzione BamCoverage nella terza cella utilizzando MAIUSC + INVIO.

Figura 3: Organizzazione dei file per WonderPeaks. Uno screenshot della cartella dei dati con i file bedgraph nella directory bedgrapghout/normalizeUsingCPM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. WonderPeaks per ChIPseq

1. Controllo preliminare
   1. Verificare che tutti i file bedgraph con filehandle .bedgraph si trovino in una sottodirectory all'interno della directory dei dati chiamata bedgraphout (Figura 3).
   2. Verificare che user_inputs fattori di progettazione nel file (NGS_user_inputs.csv) (Figura 2) corrispondano alle colonne nel file di metadati (NGS_user_metadata.csv) e che le righe delle colonne del fattore di progettazione non siano univoche (vedere l'attenzione nel passaggio 4.2.4).
2. Aprire Jupyter Notebook di pre-elaborazione NGS (WP4ChIP.ipynb).
3. Attiva WonderPeaks (ambiente creato nel passaggio 1.3) nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia del notebook.
4. Eseguire le celle utilizzando MAIUSC+INVIO fino al punto di interruzione per eseguire la chiamata di picco. Una volta terminato, un record dei dati elaborati verrà salvato e archiviato in una sottodirectory all'interno della directory dei dati chiamata WonderPeaks
   1. Cerca WOnder_init.csv: una concatenazione di tutta la copertura grezza e dei risultati del calcolo della derivata prima.
   2. Nota WOnder_unfiltered_peaks.csv: una concatenazione di tutti i picchi non filtrati chiamati in base alla derivata prima.
   3. Osservare bedgraph_summary.csv: un riassunto delle statistiche del punteggio dopo aver raggruppato ogni file e cromosoma.
5. Definire i parametri di esecuzione:
   1. Esegui la^1a cella sotto il punto di interruzione del ribasso.
      NOTA: Apparirà un grafico che mostra i dati grezzi separati dai fattori di progettazione specificati e una tabella che mostra i fattori di progettazione; utilizzare la tabella e il grafico per determinare i valori nei passaggi successivi (Figura 4).
   2. Nella cella successiva, specificare i valori per score_cut, fold_change e designfactor (Figura 4).
      1. score_cut è il valore di soglia utilizzato per determinare se un picco deve essere considerato nell'output. Per determinare il score_cut, osservare il grafico e scegliere un valore vicino alla mediana dei dati taggati (vedere la linea con hash, Figura 4). Immettere questo valore come segue: score_cut= valore.
      2. fold_change è il valore di soglia dei punteggi del rapporto tagged:untagged utilizzati per determinare se un picco è considerato reale. Per determinare il fold_change, osservare il grafico e scegliere un valore superiore al rapporto tra le mediane dei dati senza tag e con tag. Immettere questo valore come segue: fold_change= valore.
      3. designfactor_value è specificato come parte del disegno sperimentale. I possibili fattori di progettazione sono elencati in rosso nella tabella stampata. Per determinare il fattore di progettazione, scegliere uno dei valori elencati in rosso. Inserisci questo valore tra virgolette come segue: designfactor_value ="{ value}".
6. Esegui le celle successive usando Maiusc + Invio per eseguire il filtraggio e la mappatura dei picchi. I dati e i grafici di riepilogo verranno memorizzati in una sottodirectory all'interno della directory dei dati chiamata WonderPeaks.
   1. Osservare {designfactor_value}_taggedVuntagged.csv: una tabella pivot di tutti i picchi sovrapposti con colonna per ciascuno dei campioni con e senza tag.
   2. Nota {designfactor_value}_all_tagged_peaks.csv: una tabella riassuntiva di tutti i picchi reali, in base ai parametri dell'utente (passaggio 6.5).
   3. Osservare {designfactor_value}_peaks2gtf.csv: una mappatura dei picchi reali, basata sui parametri dell'utente (passaggio 6.5), ai geni nel file di annotazioni specificato dall'utente.
7. Facoltativo: alternare i parametri nel passaggio 6.5 eseguendo nuovamente i passaggi 6.5-6.6. Se si utilizza lo stesso designfactor_value, i file generati, come descritto nel passaggio 6.6, verranno sovrascritti.

Figura 4: Screenshot che evidenzia le soglie designfactor_value e specificate dall'utente in WonderPeaks per ChIP-seq. Screenshot del jupyter notebook WonderPeaks, che evidenzia le possibili opzioni di designfactor_value dalla tabella visualizzata e come implementare il designfactor_value nella cella successiva. La freccia nera superiore indica una tabella che mostra le possibili voci designfactor_value; il valore Op viene cerchiato e mostrato come input utente selezionato per designfactor_value nella cella delle opzioni (freccia nera in basso). Nel grafico, le linee continue e tratteggiate indicano i punteggi di picco mediani approssimativi per campioni marcati e non etichettati, rispettivamente, negli esperimenti con celle opache. Queste mediane vengono utilizzate per definire i parametri score_cut (mediana con tag) e fold_change (il rapporto tra mediane con tag e senza tag). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. PeakStream per 3'RNAseq

1. Controllo preliminare:
   1. Verificare che tutti i file bedgraph si trovino in una sottodirectory all'interno della directory dei dati chiamata bedgraphout (Figura 2).
   2. Aprire Jupyter Notebook di pre-elaborazione NGS (PeakStream.ipynb)
   3. Attiva WonderPeaks (ambiente creato nel passaggio 1.3) nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia del notebook.
2. Eseguire le celle usando MAIUSC+INVIO fino al punto di interruzione per eseguire la chiamata e il mapping dei picchi. Una volta terminato, un nuovo file di annotazione con i file di conteggio delle letture previsti 3' UTR e FeatureCounts²⁴ verrà salvato e archiviato in una sottodirectory all'interno della directory dei dati chiamata PeakStream (Figura 5).
   NOTA: Per impostazione predefinita, il file di output includerà solo annotazioni per i biotipi codificanti le proteine, ma questo può essere attivato utilizzando l'opzione biotipo.

Figura 5: Organizzazione dei file per PeakStream. Uno screenshot della cartella dati con i file del bedgraph nella directory bedgrapghout. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Picchi delle Meraviglie
Dopo aver eseguito un esperimento ChIP-seq, i ricercatori utilizzano comunemente i richiami di picco, come MACS³, per identificare le regioni genomiche arricchite da una proteina legante il DNA marcata con epitopo. Abbiamo sviluppato WonderPeaks come un richiamatore di picchi di facile utilizzo progettato per identificare i picchi utilizzando il metodo descritto sopra.

WonderPeaks identifica i picchi calcolando prima la deriva...

Discussione

Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) forniscono una visione senza precedenti della regolazione e dell'espressione genica nei patogeni fungini. In quanto tali, gli strumenti computazionali devono essere completi – catturando tutti i dati generati in un esperimento – e accessibili agli utenti generici, in particolare agli scienziati da banco. In questo rapporto, abbiamo introdotto due strumenti, WonderPeaks e PeakStream, che rispondono a queste esigenze per i ricercator...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit CORALL Total RNA-seq V1	Lexogen	095	Materiale da laboratorio umido
Funghi filamentosi riboPOOL	siTOOLs	dp-P096-6	Materiale da laboratorio umido
RNA ScreenTape ad alta sensibilità	Agilent	5067-5579	Materiale da laboratorio umido
Scala RNA ScreenTape ad alta sensibilità	Agilent	5067-5581	Materiale da laboratorio umido
Tampone per campioni RNA ScreenTape ad alta sensibilità	Agilent	5067-5580	Materiale da laboratorio umido
			elenco delle dipendenze per WonderPeaks
https://github.com/mgarber21/WonderPeaks_preprocessing/blob/main/environment.yml			elenco delle dipendenze per WonderPeaks_preprocessing
Monarch Spin RNA Cleanup Ki	NEB	T2040L	Materiale di laboratorio umido
pygenometracks (3.9)
QuantSeq 3′ mRNA-Seq FWD Library Prep Kit V1	Lexogen	015	Materiale di laboratorio umido
Kit di analisi dell'RNA Qubit ad alta sensibilità (HS)	Invitrogen	Q32852	Materiale da laboratorio umido
RNA pulito e Concentratore-5	Zymo Research	R1016	Materiale da laboratorio umido
Kit TURBO DNA-free	ThermoFisher	AM1907	Materiale da laboratorio umido
WonderPeaks(0.1.14)
WonderPeaks_preprocessing(0.2.3)