Tecnica di biopsia congiuntivale e immunofluorescenza diretta per la diagnosi del pemfigoide delle mucose

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per il prelievo e l'elaborazione della biopsia congiuntivale per identificare il pemfigoide della mucosa.

Abstract

Il pemfigoide delle mucose oculari (MMP) si presenta come congiuntivite cicatrizzante cronica che, se non trattata, può causare cecità. La diagnosi tempestiva e la terapia immunosoppressiva prevengono la progressione della malattia. La colorazione diretta in immunofluorescenza (DIF) della biopsia congiuntivale per la deposizione di immunocomplessi nella membrana basale è diagnostica di MMP. Il tasso di positività della biopsia dipende dalle caratteristiche della biopsia, dalla lateralità, dall'età avanzata e dall'attività della malattia. L'attuale documento sui metodi descrive la tecnica di raccolta della biopsia congiuntivale e l'utilizzo di cartucce riempite a media temperatura di taglio ottimale per il trasferimento del campione e la preparazione del blocco. Una biopsia viene eseguita da una regione della congiuntiva non cicatrizzata, non coinvolta o relativamente meno coinvolta in entrambi gli occhi. La dimensione abituale della biopsia è di 4-5 mm di lunghezza, 2-3 mm di larghezza e dovrebbe avere un piccolo tessuto sottocongiuntivale sottostante in modo che la membrana basale non venga persa. Si consiglia di eseguire periodicamente la colorazione acida di Schiff per confermare la presenza della membrana basale. Utilizzando un protocollo specificato, le criosezioni delle biopsie vengono colorate con anticorpi coniugati fluorescenti IgG, IgM, IgA e fattori del complemento C3c e C4c. Una biopsia positiva mostra la fluorescenza verde positiva nella membrana basale e, anche se uno degli anticorpi è positivo, è MMP positivo. Una biopsia negativa non esclude la presenza di pemfigoide; tuttavia, uno positivo conferma la MMP e la differenzia dalla congiuntivite cicatrizzante indotta da farmaci o dallo pseudopemfigoide.

Introduzione

Il pemfigoide delle mucose (MMP) è una malattia congiuntivale cronica cicatrizzante di eziologia autoimmune e colpisce le membrane mucose del corpo ^1,2. La congiuntivite cicatrizzante cronica ha diverse eziologie ed è necessaria la differenziazione della MMP da SJS, sarcoidosi, neoplasia squamosa oculare e pseudopemfigoide poiché la prima richiede l'immunosoppressione sistemica ^3,4. Inoltre, la MMP è una malattia potenzialmente cieca in cui i pazienti spesso si presentano in ritardo e vengono diagnosticati erroneamente inizialmente ^1,2,5. Solo il coinvolgimento oculare senza coinvolgimento sistemico può essere osservato nel 27,4% dei pazienti con MMP oculare⁶. La diagnosi di MMP richiede una biopsia congiuntivale per mostrare la presenza di autoanticorpi nella membrana basale ^2,5. L'immunofluorescenza diretta (DIF) è uno strumento diagnostico fondamentale per identificare le malattie autoimmuni che colpiscono la congiuntiva, come la MMP. La DIF aiuta a rilevare la deposizione in situ di immunoglobuline e componenti del complemento nella zona della membrana basale (BMZ), una caratteristica della MMP. I tassi di positività DIF variano dal 30% all'80%^1,5. Tuttavia, alcuni pazienti possono avere una biopsia negativa, specialmente quelli con MMP solo oculare, ma la documentazione clinica della progressione della malattia viene trattata in modo simile ai casi di MMP oculare positiva alla biopsia ^7,8. Pertanto, Dart et al. hanno sottolineato la necessità di criteri diagnostici separati per MMP⁸ solo oculare.

Le ragioni proposte per il basso tasso di positività negli studi sono la malattia avanzata con cicatrici estese sulla superficie oculare, tecniche di lavorazione o colorazione dei tessuti inadeguate e una variante della malattia negativa alla biopsia 8,9,10,11. Un'analisi retrospettiva delle biopsie di 27 pazienti sospettati di MMP oculare ha rivelato solo un tasso di positività del 30% e il 63,7% ha avuto solo un coinvolgimento oculare¹². DIF richiede un protocollo specifico; Non tutti i laboratori diagnostici sono in sintonia con questo. Ci sono differenze per quanto riguarda il sito della biopsia, se eseguire una biopsia da uno o entrambi gli occhi e le soluzioni di trasferimento del campione 13,14,15. In un'analisi retrospettiva delle biopsie congiuntivali presso il nostro centro, il tasso di positività DIF è stato del 54,1%, con più positivi quando biopsia bilaterale (59% vs. 45%)⁸. Sebbene una biopsia sia fondamentale, i segni clinici e la progressiva cicatrizzazione della superficie oculare aiutano a confermare la diagnosi di MMP. È più facile diagnosticare quando è coinvolta una sede extraoculare, come quella orale o cutanea, riportata rispettivamente nel 40% e nel 18% dei pazienti.

Ci sono variazioni nella letteratura esistente e il protocollo qui presentato può fungere da guida di riferimento con le modifiche introdotte per ridurre la necessità di un unico mezzo di trasferimento¹⁴. Le biopsie vengono trasferite in un mezzo di temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelate a scatto nella stessa cartuccia di trasferimento nel laboratorio di patologia, ovviando alla necessità di un mezzo di trasferimento aggiuntivo. Il presente documento delinea la metodologia per la colorazione DIF del tessuto congiuntivale, la raccolta dei tessuti e il protocollo di trasferimento dei campioni.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana del LV Prasad Eye Institute.

1. Tecnica della biopsia congiuntivale

1. Pianificare la biopsia da entrambi gli occhi del paziente sospetto di pemfigoide in anestesia topica o locale e microscopio operatorio.
2. Prendi il consenso informato dal paziente ed elenca i possibili effetti collaterali di sanguinamento, cicatrici e la necessità di iniziare gli steroidi topici dopo l'intervento chirurgico.
3. Metti 1-2 gocce di proparacaina allo 0,5% in entrambi gli occhi e attendi 5 minuti prima di iniziare la procedura.
4. Assicurarsi che il paziente non avverta dolore quando tocca la congiuntiva con una pinza fine. Se il paziente avverte ancora dolore dopo l'applicazione topica di proparacaina, iniettare 0,2 ml di lidocaina sottocongiuntivale al 2% con una siringa di tubercolina da 1 ml.
5. Posiziona uno speculum nell'occhio destro o sinistro, a seconda di quale sia scelto per primo.
6. Esaminare la superficie oculare per individuare eventuali aree cicatriziali e cheratinizzazione. Selezionare l'area bioptica che non sia coinvolta e non cicatrizzata o cheratinzzata.
   NOTA: In questo studio, la congiuntiva bulbare superiore lontana dal limbus è preferita come sito di biopsia, seguita dalla congiuntiva bulbare inferiore.
7. Usa la pinza di Lim per sollevare la sclera dalla congiuntiva e asportare linearmente con le forbici di Westcott, che misurano 4-5 mm di lunghezza e 2-3 mm di larghezza.
8. Trasferire immediatamente l'intera biopsia in un mezzo di taglio ottimale (OCT).
   NOTA: È possibile trasferire le biopsie in soluzione salina normale o in un mezzo di trasporto Michel.
9. Prendi una cartuccia e uno stampo in tessuto di plastica con un pozzetto al centro, puliscilo con soluzione fisiologica e asciugalo all'aria.
10. Riempire la cartuccia con il medium OCT separatamente per l'occhio destro e sinistro. Immergere il tessuto congiuntivale asportato nel mezzo OCT e inviarlo alla patologia.
11. Ripeti i passaggi simili anche per il lato controlaterale.

2. Trasferimento del tessuto

1. Incorporare i campioni bioptici della congiuntiva in un terreno OCT per preservare l'architettura e l'antigenicità dei tessuti se ricevuti nel mezzo di trasporto di Michel o nella soluzione fisiologica normale.
2. Congelare i campioni incorporati utilizzando azoto liquido o ghiaccio secco e conservarli a -80 °C per una notte.

3. Preparazione e sezionamento dei tessuti

1. Sezionare il tessuto congelato in fette da 4-6 μm (in numero di 7) utilizzando un criostato a una temperatura compresa tra -20 °C e -25 °C.
2. Montare le sezioni su vetrini da microscopio rivestiti di polilisina caricati positivamente per garantire l'adesione e conservare a -80 °C fino alla colorazione in un foglio di alluminio.

4. Colorazione immunofluorescente

1. Scongelare i vetrini a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti e fissarli in acetone freddo (100%) per 10 minuti per preservare gli antigeni e prevenire danni ai tessuti.
2. Risciacquare con 1 PBS tre volte, ogni volta per 5 minuti per rimuovere il mezzo OCT in eccesso e l'acetone.
3. Applicare anticorpi coniugati anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM e anti-C3 diluiti (Fibrinogeno-1:10 [controllo positivo], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) sui vetrini.
   NOTA: Gli anticorpi sono diluiti in 1x PBS.
4. Per i controlli negativi, saltare l'applicazione di anticorpi coniugati e seguire i passaggi rimanenti indicati di seguito.
5. Seguire le linee guida del produttore per la diluizione degli anticorpi e standardizzare con i controlli positivi e negativi noti.
6. Incubare i vetrini in camera umidificata a 37 °C per 45-60 min.
7. Lavare i vetrini con PBS (3× per 5 minuti ciascuno) per rimuovere gli anticorpi non legati.
8. Controcolorante con DAPI (4',6 -diamidino-2-fenilidolo) per la visualizzazione nucleare.
9. Posizionare un vetrino coprioggetti sui vetrini e lasciarli indurire per 20 minuti.
10. Esaminare i vetrini utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati per i fluorofori utilizzati (filtro verde di eccitazione per 488 nm).
11. Documenta i risultati con micrografie digitali.

5. Acido periodico rapido - colorazione di Schiff

1. Preparazione dell'acido periodico di Schiff (PAS)
   1. Sciogliere 1 g di fuscina basica in 100 ml di acqua distillata calda.
   2. Aggiungere 10 ml di acido cloridrico e 2 g di disolfito di potassio per decolorare il colorante.
   3. Dopo il raffreddamento, aggiungere 0,5 g di carbone attivo, mescolare e filtrare la soluzione per ottenere un reagente di Schiff acido periodico limpido. Conservare in bottiglia scura.
      NOTA: Per verificare la presenza del reagente di Schiff, versare 10 ml di formalina al 37% in un vetro dell'orologio e aggiungere alcune gocce di Schiff da testare. Un buon reagente di Schiff assumerà rapidamente un colore rosso-violaceo. Un reagente di Schiff deteriorato causerà una reazione ritardata e il prodotto sarà di un blu-viola intenso.
2. Tecnica di colorazione PAS
   1. Idratare gli scivoli in acqua.
   2. Ossidare in soluzione acida periodica allo 0,5% per 5 min.
   3. Sciacquare in acqua distillata.
   4. Mettere nel reagente di Schiff per 15 minuti (le sezioni appaiono rosa chiaro durante questa fase)
   5. Lavare in acqua tiepida del rubinetto per 5 minuti (le sezioni diventano rosa scuro).
   6. Controcolorare l'ematossilina di Mayer per 1 min.
   7. Lavare in acqua di rubinetto per 5 minuti.
   8. Disidratare i vetrini nelle seguenti soluzioni: una volta in alcol etilico all'80% per 1 minuto, due volte in alcol etilico al 90% per 1 minuto, due volte in alcol etilico al 100% per 1 minuto.
   9. Disidratare i vetrini tre volte in xilene per 1 minuto ciascuno.
   10. Posizionare un vetrino coprioggetti sui vetrini utilizzando un supporto di montaggio sintetico (ad es. supporto DPX)
   11. Osservare i risultati PAS al microscopio a campo chiaro.

Risultati

L'interpretazione della DIF richiede la conferma della presenza della membrana basale nelle sezioni di tessuto (Figura 1). Nei vetrini colorati con PAS, la membrana basale apparirà come una membrana rosa brillante situata nella regione basale dell'epitelio congiuntivale (Figura 1C). Anche la continuità e l'architettura della membrana del basamento dovrebbero essere commentate. La positività DIF sarà vista come BM verde brillante (Figura 1B

Discussione

La tecnica di biopsia congiuntivale qui descritta utilizza il terreno OCT come mezzo di trasferimento, ovviando alla necessità di un mezzo di trasferimento aggiuntivo ed evitando la manipolazione della biopsia per il trasferimento al terreno OCT per la criosezione. Uno stampo per cartucce di plastica riempito con terreno e biopsia viene congelato direttamente per creare blocchi di tessuto e quindi sezionato. I vantaggi dell'OCT sono che si congela rapidamente con danni minimi dovuti alla...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 N acido cloridrico	Finar  chimico Limited	7647-01-0
Acetone	Qualità	Domanda 33517
Albumina	DAKO	F0117
Fucsina di base	Qualità	Domanda 39402
C3c	Biosistemi diagnostici	F003
C4c	Biosistemi diagnostici	F005
Cartuccia	Poliscienze	25376-500
Carbone attivato	Sigma	C-5260
Criostato	Leica	CM1860UV
Lame criotomiche	Leica	818
DAPI	Abcam	Codice ab104139
Fibrinogeno	Biosistemi diagnostici	F006
Microscopio a fluorescenza	Olimpo	CX43
Pinze	Joja chirurgico	JS1528A
Camera di umidità	Biosistemi diagnostici	SM365
IgA	Biosistemi diagnostici	F007
IgG	Biosistemi diagnostici	F008
Igm	Biosistemi diagnostici	F009
Vetrini adesivi IHC	Tomo	33140455
Pinze di Lim	Pista di velocità	S-7223
Il mezzo tansport di Michel	Fisher Scinitics	NC0253304
Vetro di copertura microscopico	Stella blu	https://www.bluestarslides.com
OCT Medio	Criomatrice	6769006
PBS	DAKO	dm831
Acido periodico	Sigma	Codice 375810-25G
Disolfito di potassio	Sigma	P2522-500G
Proparacaina 0,5%	Sunway Private	G/1118A
Le forbici di Westcott	Pillig Strumenti Gastronomici	423480