Articolo metodologico

Interfacce elettriche e optoelettroniche bidirezionali in cuori di ratto sani e ischemici ex vivo

DOI:

10.3791/68305

⸱

18 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 2The James Franck Institute, The University of Chicago, 3Department of Chemistry, The University of Chicago, 4The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea la fabbricazione avanzata di materiali e metodi di cuore di ratto ex vivo per la biointerfaccia bidirezionale ottica ed elettrica, consentendo una stimolazione cardiaca precisa, la registrazione e la modellazione dell'infarto per la ricerca bioelettronica.

Abstract

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Gli studi elettrofisiologici sono fondamentali per esplorare le interazioni tra materiali e biointerfacce cardiache. I recenti progressi hanno introdotto vari nuovi materiali conduttori e semiconduttori per interfacce bidirezionali con modelli cardiaci, facilitando la stimolazione a bassa intensità insieme a registrazioni spaziotemporali elevate e con un elevato rapporto segnale/rumore (SNR). Il modello ex vivo del cuore di roditore funge da piattaforma efficace per convalidare le funzionalità di nuovi materiali e dispositivi, collegando i risultati in vitro alle intuizioni traslazionali e riducendo al minimo le preoccupazioni etiche e amministrative. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio l'isolamento e la perfusione ex vivo di cuori di ratto adulti utilizzando un apparecchio di Langendorff, stabilendo una precisa stimolazione bidirezionale e registrando con semiconduttori e conduttori ad alte prestazioni, tra cui silicio nanoporoso, carbonio nanoporoso e array di microelettrodi flessibili a rete. Inoltre, presentiamo un modello di infarto del miocardio indotto da danno da ischemia-riperfusione (I/R), valutato attraverso la registrazione e la mappatura multicanale e la colorazione dell'infarto, consentendo studi rilevanti per le malattie cardiache e potenziali esplorazioni terapeutiche. Questa metodologia offre preziose informazioni sulla ricerca sull'interfaccia materiali-bio e sullo sviluppo della bioelettronica cardiaca di prossima generazione.

Introduzione

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Il campo della bioelettronica cardiaca sta avanzando rapidamente, spinto dalla necessità di sviluppare materiali e dispositivi che consentano comunicazioni bidirezionali precise ed efficienti con il cuore 1,2,3,4. Gli studi elettrofisiologici svolgono un ruolo fondamentale in questo sforzo, fornendo informazioni critiche su come i materiali interagiscono con le biointerfacce cardiache attraverso la modulazione e il rilevamento. Mentre i modelli in vitro, come le linee cellulari HL-1 in coltura e i cardiomiociti primari dei roditori, offrono un ambiente controllato per le valutazioni iniziali 5,6,7,8, la loro semplicità spesso non riesce a replicare le complesse condizioni dinamiche di un cuore vivente. Questi modelli mancano dell'architettura 3D del cuore, cruciale per la conduzione elettrica coordinata e la generazione di forza meccanica, e non possono imitare i cicli ritmici di contrazione-rilassamento o le dinamiche di perfusione critiche per l'apporto di ossigeno e nutrienti9. Al contrario, i modelli in vivo forniscono le informazioni fisiologicamente più rilevanti, ma presentano notevoli sfide etiche, amministrative e tecniche, tra cui la necessità di una formazione approfondita, configurazioni chirurgiche sofisticate e la conformità a rigorosi quadri normativi10.

Per colmare questa lacuna, i modelli di cuore ex vivo, come il cuore di ratto adulto perfuso con Langendorff, offrono un'alternativa convincente alla ricerca scientifica11,12. Questi modelli combinano la rilevanza fisiologica dei sistemi in vivo con la controllabilità e l'accessibilità delle configurazioni in vitro. Isolando il cuore e mantenendolo in uno stato funzionale, l'apparato di Langendorff consente ai ricercatori di condurre studi ad alta fedeltà sull'elettrofisiologia cardiaca in condizioni controllate con precisione. L'assenza di variabili sistemiche come gli input neurali e gli ormoni circolanti semplifica l'interpretazione dei risultati preservando gli aspetti chiave della fisiologia cardiaca. Inoltre, i modelli ex vivo mitigano molte preoccupazioni etiche e riducono l'onere delle risorse, rendendoli una piattaforma versatile e pratica per la ricerca traslazionale13.

Oltre al suo potenziale traslazionale, questo protocollo stabilisce un punto di riferimento per la valutazione delle prestazioni dei materiali. Incorporando strategie materiali rappresentative, come le piattaforme optoelettroniche per la fotostimolazione wireless e i sistemi elettronici per la stimolazione e la registrazione cablate, stabilisce un quadro riproducibile per gli studi comparativi. Questa standardizzazione non solo facilita l'innovazione, ma migliora anche la riproducibilità e l'affidabilità dei risultati tra i gruppi di ricerca. In passato, molti fotoelettrodi ed elettrodi ad alte prestazioni si sono dimostrati molto promettenti per gli studi bioelettrici, come PEDOT: PSS14, MXene15, ossidi di iridio16, platino17, molibdeno18, silicio 19,20,21, punti quantici 22,23,24 e semiconduttori organici 25. Qui, questo protocollo presenta materiali rappresentativi e all'avanguardia, tra cui silicio nanoporoso26, carbonio nanoporoso27 e array di multielettrodi d'oro (MEA) flessibili a forma di mesh28,29, che si integrano nel protocollo per dimostrare le loro capacità nelle interfacce cardiache bidirezionali. Questi materiali consentono una stimolazione soprasoglia a bassa intensità, un'elevata risoluzione spazio-temporale e registrazioni SNR elevate, dimostrando il loro potenziale per il progresso della bioelettronica cardiaca. Inoltre, l'inclusione di un modello di infarto del miocardio indotto da danno I/R fornisce un solido quadro per studi ed esplorazioni terapeutiche rilevanti per la malattia.

Questo lavoro presenta metodi dettagliati per la fabbricazione e l'applicazione di materiali avanzati per la fotostimolazione senza piombo e la stimolazione elettrica e il rilevamento con cuori di ratto ex vivo (Figura 1A). Le membrane di silicio nanoporoso sono state fabbricate attraverso il patterning fotolitografico, l'incisione ionica reattiva (RIE) e il rilascio tamponato di acido fluoridrico (HF) da wafer di silicio su isolante (SOI) con uno strato di dispositivo di 5 μm, seguito da mordenzatura a colorazione e trasferimento su membrane morbide di polidimetilsilossano (PDMS)26. Per la stimolazione elettrica e la registrazione, il carbonio nanoporoso è stato sviluppato mediante ablazione laser di substrati di cellulosa incubati con sale, seguita dal trasferimento in fase acquosa e dalla laminazione a caldo, offrendo migliori capacità di stoccaggio e iniezione della carica rispetto ai tradizionali elettrodi d'oro27. Inoltre, i MEA flessibili sono stati fabbricati su wafer di Si rivestiti di poliimmide utilizzando la fotolitografia, la metallizzazione e-beam, l'incisione, l'incapsulamento e i processi di rilascio per consentire la registrazione e la mappatura epicardica spazialmente risolte28,29.

Oltre alla fabbricazione, il protocollo fornisce un protocollo passo-passo per l'isolamento, la perfusione, il monitoraggio e l'interfacciamento del cuore di ratto adulto con dispositivi ottici ed elettrici. I dispositivi sono stati testati su cuori isolati, dimostrando risultati rappresentativi nella stimolazione e nella registrazione per la valutazione elettrofisiologica. Questo protocollo introduce anche un metodo per la creazione di un modello di infarto del miocardio attraverso l'I/R, convalidato da registrazioni fisiologiche, colorazioni e valutazioni morfologiche. Questa metodologia completa stabilisce un quadro riproducibile per la valutazione di materiali e dispositivi nelle biointerfacce cardiache. La Figura 1B-D delinea i flussi di lavoro della fabbricazione dei materiali per la valutazione in questo modello cardiaco ex vivo. La Figura 2A-C mostra i risultati attesi nelle immagini dei dispositivi fabbricati.

Protocollo

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Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Chicago (numero di protocollo 72378).

1. Fabbricazione di membrane di silicio nanoporoso (Figura 1B, Figura 2A, Figura 3)

  1. Progetta il modello di fotomaschera nel software AutoCAD (Figura 3). Assicurarsi che le dimensioni del dispositivo corrispondano alla scala di lunghezza del bersaglio biologico. Per il cuore di ratto, utilizzare un dispositivo di dimensioni comprese tra 2 e 10 mm. Nel progetto, aggiungere piccoli array di fori di diametro 20 - 100 μm per facilitare il rilascio dello strato del dispositivo Si in HF tamponato. Realizzare i tre grandi fori di 200 - 1000 μm di diametro, formando una lettera L chirale per aiutare a identificare il lato corretto della membrana.
  2. Pulire il wafer SOI con acetone e alcol isopropilico (IPA) per 3 minuti ciascuno nel bagno a ultrasuoni. Eseguire la cottura per disidratazione a 200 °C per 20 minuti sulla piastra calda.
  3. Centrifugare il resist positivo spesso AZ40XT-11D a 3000 giri/min per 45 s, cuocendo a 115 °C per 3 minuti. Fare attenzione a non versare troppo fotoresist sul wafer. Dopo la centrifuga, rimuovere i residui sul retro del wafer utilizzando tamponi di acetone.
    NOTA: AZ40XT-11D è un fotoresist positivo molto viscoso.
  4. Utilizzare lo scrittore diretto Heidelberg MLA150 per esporre il modello di fotoresist a 375 nm e una dose di 800 mJ/cm2. Eseguire la cottura post-esposizione a 110 °C per 2 min.
  5. Sviluppa il modello nello sviluppatore AZ 300MIF per 2 minuti. Sciacquare il wafer con acqua deionizzata (DI) per 60 s e poi asciugare con aria N2 .
  6. Incidere il SOI scoperto utilizzando un processo RIE SF6/CHF3 (20 sccm:50 sccm) per 12 minuti utilizzando plasma accoppiato induttivamente a 600 W e una radiofrequenza di 60 W in un incisore al fluoruro al plasma accoppiato induttivamente con una pressione della camera di 10 mT, con una velocità di incisione di circa 660 nm/min.
  7. Smontare il fotoresist utilizzando AZ NMP in un bagno a ultrasuoni a 80 °C per 10 minuti e pulire il wafer in un bagno a ultrasuoni per 3 minuti in acetone, seguito da 3 minuti in alcool isopropilico e asciugato con azoto compresso.
  8. Immergere il campione in HF tamponato a temperatura ambiente per eliminare gli strati di ossido sepolti. Il dispositivo si sgancia in 4 - 8 ore. Aumentare leggermente la temperatura della soluzione (40 °C) per facilitare il rilascio.
  9. Trasferire con cura le membrane rilasciate con carta da filtro da 1 cm x 1 cm in due bagni d'acqua DI separati in sequenza per rimuovere eventuali residui di HF.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui. Immergere la membrana in un bagno di alcool isopropilico per la conservazione a 4 °C.
  10. Trasferire la membrana utilizzando carta da filtro in una capsula di Petri con acqua deionizzata (DI). La membrana galleggerà sulla superficie dell'acqua a causa dell'idrofobicità e della tensione superficiale.
    NOTA: Le membrane in silicone possono passare rigorosamente dall'IPA all'acqua grazie all'effetto Marangoni30.
  11. In una piastra di Petri separata, preparare la soluzione di mordenzatura contenente un rapporto in volume di 100:1 di HF concentrato e acido nitrico concentrato (ad esempio, 10 mL di HF e 0,1 mL di HNO3). Mescola bene prima di incidere.
  12. Trasferire la membrana con carta da filtro nella soluzione mordenzante e mordenzare per 30 s. Prestare attenzione al lato della membrana Si notando l'orientamento della lettera L formato dai tre fori principali. La membrana Si dovrebbe galleggiare sul mordenzante, dove è inciso solo un lato della membrana.
  13. Trasferire la membrana con la carta da filtro in due vaschette separate per l'acqua deionizzata per lavare via il residuo HF.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui. Trasferire la membrana in alcool isopropilico per la conservazione a 4 °C.
  14. Realizzare un substrato di supporto con PDMS sottile. Miscelare la parte A (polimero di base) e la parte B (agente indurente) con un rapporto in peso di 10:1 e degassare per 30 minuti.
  15. Spin coat PMMA (495 A6) strato sacrificale su vetrino a 2.000 giri/min per 45 s. Infornare a 180 °C per 60 s.
  16. Spin coat PDMS a 4.500 giri/min per 45 s sul vetro rivestito in PMMA, che dovrebbe portare a uno spessore di 10 - 20 μm. Polimerizzare in forno o piastra riscaldante a 80 °C per 2 ore.
    NOTA: Per mitigare i danni meccanici, il PDMS è stato utilizzato come substrato morbido per l'alloggiamento delle membrane di silicio nanoporose, fornendo protezione contro potenziali danni derivanti dalla manipolazione diretta con le pinzette.
  17. Trasferire la membrana di Si mordenzata con colorazione dall'IPA al PDMS. Utilizzare un fazzoletto pulito per rimuovere l'IPA in eccesso e la membrana Si si attaccherà saldamente al PDMS dopo l'evaporazione dell'IPA. Prestare attenzione al lato della membrana Si identificando l'orientamento della lettera L formato dai tre fori principali. Il Si poroso inciso dovrebbe essere rivolto verso l'esterno e il Si non inciso dovrebbe interfacciarsi con il PDMS.
  18. Tagliare il PDMS circonferenzialmente utilizzando una lametta che contiene la membrana Si. Lasciare spazio sufficiente e fare attenzione a non danneggiare la membrana Si.
  19. Immergere il dispositivo nell'acetone fino a quando il Si/PDMS non viene rilasciato. Evitare l'ammollo troppo a lungo, in quanto potrebbe causare gonfiore al PDMS. Sciacquarlo con acqua deionizzata e asciugarlo con N2. Eseguire il trattamento al plasma O2 a 400 W per 10 min.

2. Fabbricazione di array di microelettrodi flessibili (Figura 1C, Figura 2B, Figura 4)

  1. Progettare la struttura dei MEA flessibili in AutoCAD (Figura 4). Introduciamo due diversi design con la stessa area di proiezione dell'elettrodo ma diverse strutture del substrato (Figura 2B, Figura 4).
  2. Pulire il substrato del wafer di silicio in acetone e IPA per 3 minuti ciascuno in un bagno a ultrasuoni.
    NOTA: Questo protocollo non richiede un trattamento superficiale aggiuntivo per migliorare l'adesione tra la poliimmide (PI) e il wafer di Si per facilitare il rilascio del dispositivo. Il trattamento al plasma di ossigeno può essere utilizzato per migliorare l'adesione, se necessario.
  3. Versare 4 mL della soluzione precursore PI di poli (dianidride-co-4,4′-ossidianilina) piromellitica sul wafer. Centrifugare il wafer a 1.500 giri/min per 45 s. Utilizzare NMP o acetone per rimuovere il precursore sul retro del wafer.
  4. Precuocere a 110 °C per 3 min, poi a 180 °C per 3 min. Polimerizzare il wafer rivestito di PI nel forno resist con una modalità profilo. Iniziare dalla temperatura ambiente, riscaldare fino a 250 °C alla velocità di rampa di 4 °C/min e mantenere premuto per 30 minuti. Quindi riscaldare il wafer a 350 °C alla velocità di rampa di 2,5 °C/min e mantenerlo a 350 °C per 60 minuti, quindi raffreddare lentamente a RT. Il risultato è un film PI di circa 5 μm di spessore.
  5. Spin coat del wafer rivestito in PI con AZ nlof 2020 a 2.000 giri/min per 45 s. Cuocere la cialda a 110 °C per 2 min. Utilizzare lo scrittore diretto Heidelberg MLA150 per esporre il modello di fotoresist a 375 nm e una dose di 200 mJ/cm2.
  6. Eseguire la cottura post-esposizione a 110 °C per 2 min. Sviluppa il modello in AZ 300MIF Developer per 1 minuto. Sciacquare il wafer con acqua deionizzata per 60 s e poi asciugare con aria N2 .
  7. Deposita 10 nm di titanio e 200 nm di oro utilizzando un evaporatore a fascio elettronico. Smontare il fotoresist utilizzando AZ NMP in un bagno a 80 °C per 3 ore e pulire il wafer in un bagno a ultrasuoni per 3 minuti in acetone, seguito da 3 minuti in IPA e asciugato con azoto compresso.
  8. Spin coat lo spesso resist positivo AZ40XT-11D a 3.000 giri/min per 45 s. Pulisci il fotoresist sul retro del wafer usando acetone. Infornare la cialda a 115 °C per 3 min.
  9. Utilizzare lo scrittore diretto Heidelberg MLA150 per esporre il modello di fotoresist a 375 nm e una dose di 800 mJ/cm2. Eseguire la cottura post-esposizione a 110 °C per 2 min.
  10. Sviluppa il modello in AZ 300MIF Developer per 3 minuti. Sciacquare il wafer con acqua deionizzata per 60 s e poi asciugare con aria N2 .
  11. Incidere il PI scoperto utilizzando un processo RIE SF6/CHF3 (20 sccm:50 sccm) per 20 minuti con plasma accoppiato induttivamente a 600 W e una radiofrequenza di 60 W in un incisore al fluoruro al plasma accoppiato induttivamente con una pressione della camera di 10 mT.
  12. Smontare il fotoresist con AZ NMP in un bagno a 80 °C per 10 minuti e pulire il wafer con una leggera sonicazione per 3 minuti in acetone, seguito da 3 minuti in IPA e asciugato con azoto compresso.
    NOTA: Utilizzare ultrasuoni a bassa potenza per evitare che il dispositivo si stacchi. Evitare la sonicazione se il PI mostra segni di distacco.
  13. Lavorare il wafer in un forno di esametiltililazano (HMDS) per applicare il trattamento HMDS. Spin coat SU-8 2002 a 2.000 giri/min per 45 s. Ciò si traduce in uno spessore di SU8 di circa 2,5 μm.
  14. Infornare la cialda a 95 °C per 20 min. Utilizzare lo scrittore diretto Heidelberg MLA150 per esporre il modello di fotoresist a 375 nm e una dose di 950 mJ/cm2.
  15. Sviluppa il modello in SU-8 Developer per 1 minuto. Sciacquare con IPA e acqua deionizzata e asciugare con gas N2 . Se durante il risciacquo con alcool isopropilico compaiono macchie bianche, immergere il wafer nello sviluppatore SU8 fino a quando le macchie bianche non scompaiono.
  16. Eseguire una cottura dura a 160 °C per una notte. Utilizzare tempi di cottura più brevi (~30 min) per esperimenti acuti. Non cuocere a temperature inferiori a 150 °C o superiori a 200 °C. Staccare il MEA flessibile supportato da PI dal substrato.

3. Fabbricazione di carbonio nanoporoso ( Figura 1D, Figura 2C, Figura 5)

  1. Progetta il modello del film di carbonio nel software di progettazione (Figura 5).
    NOTA: Questo metodo contiene il protocollo di fabbricazione per due tipi di elettrodi: elettrodo di stimolazione nanoporoso a base di carbonio ed elettrodo di rilevamento.
  2. Impregnare la carta da filtro in soluzioni acquose di borato di sodio (0,15 M, pH 9,4) per 1 ora e quindi asciugare a 60 °C per una notte (Figura 1D).
    NOTA: La carta da filtro Whatman di grado 1 è servita principalmente come substrato poroso rappresentativo a base di fibre. Il borato di sodio viene incorporato nelle fibre di cellulosa dopo il processo di impregnazione ed essiccazione. Il sale agisce come catalizzatore che facilita la carbonizzazione fotochimica sotto sintesi laser27.
  3. Eseguire la sintesi laser utilizzando un laser CO2 con modelli predefiniti (Figura 5A). Esegui la modellazione in modalità raster con parametri ottimizzati: potenza = 1,8 W; velocità = 1,6 cm/s; punti per pollice = 1000.
  4. Preparare un film di polietilene tereftalato (PET) con uno spessore di 50 μm e pulire il film con acetone e alcol isopropilico (IPA) per 3 minuti ciascuno nel bagno a ultrasuoni.
  5. Deposita 5 nm di titanio e 100 nm di oro utilizzando un evaporatore a fascio elettronico. Applicare la procedura di trasferimento in fase acquosa per trasferire il MEA sul film PET (12,5 μm).
    NOTA: Il trasferimento in fase acquosa è stato condotto utilizzando due processi consecutivi: separazione in fase acquosa e trasferimento capillare.
  6. Immergere gradualmente i substrati di carta in acqua deionizzata per la delaminazione durante la separazione in fase acquosa.
    NOTA: L'energia di deformazione indotta dal rigonfiamento della cellulosa ha facilitato la separazione della membrana di carbonio dal substrato di supporto in meno di un secondo, facendola galleggiare sulla superficie dell'acqua.
  7. Utilizzare il substrato di supporto, ad es. una pellicola in PET, per trasferire i modelli in mezzo acquoso durante il trasferimento capillare. Immergere il substrato in acqua e portarlo a contatto con un'estremità della membrana di carbonio desiderata per formare una linea di contatto (il fronte di trasferimento). Quindi, tenere il substrato con la mano e muoverlo in direzione inclinata o verticale a bassa velocità.
    NOTA: Per i substrati di supporto idrofobici, è possibile applicare una forza esterna o un trattamento al plasma O2 per facilitare la formazione della linea di contatto.
  8. Dopo il trasferimento, applicare circa 20 μl di soluzione polimerica di acido perfluorosolfonico (PFSA) (con una concentrazione di ~5% in una miscela di alcoli alifatici inferiori e acqua) sui modelli di carbonio e lasciare asciugare a temperatura ambiente (23 °C) e pressione (1 atm) per il fissaggio.
  9. Fissare l'elettrodo di stimolazione nanoporoso a base di carbonio collegandolo a un filo di Cu utilizzando un adesivo conduttivo all'argento. Incapsulare la giunzione esposta tra il filo di Cu e l'elettrodo con adesivo siliconico per garantire isolamento e stabilità. Dopo una polimerizzazione di 3 ore a temperatura ambiente, l'elettrodo di stimolazione è pronto per l'uso. L'esperimento può essere messo in pausa qui.
  10. Progetta il modello di carbonio e MEA in AutoCAD (Figura 5B). Fabbricare array di microelettrodi 4 x 4 su una pellicola PI da 25 μm utilizzando la procedura di fotolitografia standard come descritto nel passaggio 2.
    NOTA: Il film PI può essere creato tramite precursore PI o laminando film PI commerciale su wafer di Si utilizzando il fotoresist AZ2020. Il protocollo per la fotolitografia e la deposizione dei metalli è lo stesso della fase 2.
  11. Creare una membrana monolitica di carbonio (2 cm x 2 cm) su un substrato di carta dopo l'impregnazione salina e la scrittura laser, come nei passaggi 3.1-3.3. Trasferire il modello di carbonio su una pellicola di supporto in PET preprogettata utilizzando un metodo di trasferimento standard in fase acquosa, come nei passaggi 3.6-3.9.
  12. Applicare una soluzione di polietilene-co-vinil acetato (EVA) al 10% in peso in esano sul modello di carbonio e attendere l'asciugatura a temperatura ambiente (23 °C) e pressione (1 atm). Progetta e taglia al laser un modello in PET di 10 μm di spessore (con un rivestimento in EVA sul lato inferiore) con 16 fori allineati al modello MEA, che fungono da strato di incapsulamento.
  13. Allineare il MEA, lo strato di incapsulamento in PET e la membrana in carbonio sul supporto in PET. Pressare l'assemblaggio utilizzando una laminatrice a caldo commerciale a una temperatura di lavorazione di 120 °C per il trasferimento e l'incapsulamento.
  14. Raffreddare l'elettrodo di rilevamento nanoporoso abilitato al carbonio a temperatura ambiente, rimuovere il residuo e sciacquarlo con etanolo e acqua 3 volte prima di utilizzarlo.

4. Isolamento, perfusione e monitoraggio del cuore di ratto (Figura 6)

  1. Preparare i ratti prima dell'estrazione cardiaca (Figura 6A). Questo protocollo ha utilizzato ratti maschi CD/SD di 3 o 4 mesi, ottenuti da Charles River.
  2. Preparare la soluzione di Tyrode per acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico (HEPES) sciogliendo le sostanze chimiche secondo la Tabella 1. Regolare il pH a 7,2-7,4 con 2M NaOH. Pre-ossigenare facendo gorgogliare ossigeno gassoso per 0,5-1 h e continuare l'ossigenazione fino alla fine degli esperimenti.
  3. Metti tre tubi di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS, senza calcio, senza magnesio) sul ghiaccio. Preparare strumenti chirurgici puliti (forbici affilate, forbici piegate, due emostatici, pinzette affilate, due paia di pinzette piccole).
    NOTA: La chirurgia non è pensata per la sopravvivenza, quindi la sterilità non è necessaria.
  4. Prelevare i ratti maschi adulti CD/SD di peso compreso tra 400 e 500 g dalla struttura per animali. Somministrare 0,5 mL di eparina (1000 UI/kg) per via intraperitoneale nell'addome inferiore. Usa guanti spessi per tenere il topo per proteggerlo.
  5. Afferra il topo per la parte superiore della schiena, in modo che l'addome sia esposto. Tenere saldamente il topo, ma senza forza eccessiva per non ferire l'animale. Iniettare rapidamente e con precisione la soluzione di eparina. Attendere 20-30 minuti. Nel frattempo preparare l'apparecchio Langendorff.
    NOTA: Il ratto può essere anestetizzato in anticipo per garantire la corretta fase di preparazione della procedura chirurgica.
  6. Prima di ricaricare la soluzione di HEPES Tyrode, lavare la sacca per terapia endovenosa (IV) con acqua e asciugarla completamente per garantire la corretta composizione finale. Riempire la sacca con la soluzione preossigenata di HEPES Tyrode.
  7. Accendere il termostato e la circolazione dell'acqua nell'apparecchio Langendorff a 37 °C (Figura 6A). Preparare la cannula, la sutura e posizionare la capsula di Petri sull'impacco freddo per il sezionamento dei tessuti. Adescare la cannula con HBSS ghiacciato prima del sezionamento.
  8. Prepararsi a eseguire la toracotomia di ratto (Figura 6B). Anestetizzare l'animale con isoflurano in una configurazione a campana. Mettere da 8 a 10 mL di isoflurano in una provetta da 50 mL riempita con una garza. Racchiudere l'animale con la provetta aperta (con isoflurano) in un contenitore.
  9. Osservare l'andamento dell'anestesia testando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Gli animali verranno messi sotto anestesia e perderanno conoscenza entro 2-3 minuti. Monitora attentamente le condizioni del ratto e trasferiscilo sulla tavola chirurgica subito dopo che ha perso conoscenza. L'anestesia prolungata può provocare la morte del topo.
  10. Trasferire l'animale sulla tavola operatoria. Mettilo sulla schiena e metti 5 ml di isoflurano in una provetta da 50 ml riempita con una garza sulla bocca del ratto. Confermare l'anestesia generale pizzicando una delle zampe. Continuare solo se non è stata rilevata alcuna risposta.
  11. Fissare la parte superiore e inferiore delle braccia alla tavola chirurgica con gli aghi. Praticare un'incisione (~ 5 cm) per aprire la gabbia toracica del topo appena sotto il torace. Tagliare con cura il diaframma per esporre il cuore e i polmoni.
  12. Tagliare le nervature su entrambi i lati per aprire completamente la gabbia toracica per fornire un accesso completo. Fissare la gabbia toracica allo sterno utilizzando un emostato. Tenere la vena cava da sotto il cuore usando un emostato. Rimuovere il cuore tagliando sotto l'emostatico con forbici smussate piegate il più vicino possibile al fondo della gabbia toracica.
  13. Trasferisci il cuore in un HBSS ghiacciato. Ridurre al minimo la durata del passaggio per evitare l'interruzione prolungata dell'apporto di ossigeno al cuore in contrazione.
  14. Prepararsi a eseguire la perfusione e il monitoraggio di Langendorff. Riempire completamente la cannula e la capsula di Petri con HBSS ghiacciato. Assicurarsi che non siano presenti bolle nel sistema.
  15. Trasferire il cuore nella capsula di Petri preriempita con HBSS per il sezionamento. Usando una pinzetta e le forbici, rimuovere i polmoni e altro tessuto connettivo (Figura 6C).
    NOTA: Si consiglia la dissezione smussata per la procedura di sezionamento per prevenire potenziali danni al cuore. Per il sezionamento dei tessuti adiacenti, utilizzare due forbici e strappare con cura il tessuto.
  16. Localizza l'aorta premendo sul cuore e tracciando il percorso del sangue mentre esce. Tagliare sotto la prima arteria ascendente e incannulare l'aorta se l'arco aortico è conservato durante l'estrazione (Figura 6D). Fissare l'aorta alla cannula con un doppio nodo.
    NOTA: Evitare di inserire la cannula troppo in profondità per assicurarsi che la valvola rimanga chiusa. Non posizionare la sutura troppo in basso, poiché ciò potrebbe ostruire le arterie coronarie.
  17. Adescare l'apparato di Langendorff con soluzione di lavoro preossigenata. Aprire il flusso tampone e collegare la cannula all'apparecchio (Figura 6E). Assicurarsi che non vengano introdotte bolle d'aria. Il cuore inizia a contrarsi in questa fase.
    NOTA: Inizialmente, un po' di tampone può schizzare dai ventricoli, ma non sono previste perdite eccessive. Regolare la sutura secondo necessità per evitare perdite di tampone. In questa fase non si osserverà alcuna fibrillazione cardiaca se l'intervento chirurgico e la preparazione vengono condotti correttamente.
  18. Taglia gli atri. Sgonfiare il palloncino prima di inserirlo nel ventricolo sinistro, quindi riempirlo d'acqua utilizzando la siringa collegata.
  19. Collegare le sonde BP-100 alla linea di perfusione e ai palloncini riempiti d'acqua per monitorare rispettivamente la perfusione e la pressione ventricolare sinistra (LVP) (Figura 6F).
    NOTA: Le sonde BP-100 devono essere calibrate prima dell'uso. Le bolle nei palloncini devono essere espulse per garantire un rilevamento preciso della pressione.
  20. Monitorare la pressione tampone dell'HEPES Tyrode e la linea di base dell'LVP. Assicurarsi che la pressione del tampone sia mantenuta entro l'intervallo ottimale di 80-100 mmHg. Regolare l'LVP basale a circa 20 mmHg modificando il volume d'acqua iniettato nel palloncino (Figura 6F).
  21. Collegare gli elettrodi ECG. Mettere a terra la cannula e posizionare l'elettrodo sui lati, sulla parte superiore o sull'apice in base alle preferenze (Figura 6F).
  22. Amplifica tutti i segnali (perfusione, pressione ventricolare sinistra ed ECG) utilizzando un amplificatore IA-400D e interfacciato con un computer utilizzando un digitalizzatore con software Clampex (Figura 6F).

5. Creazione di infarto del miocardio mediante processo IR (Figura 6G, Figura 7)

  1. Riempire la camera riscaldata con tampone HEPES Tyrode preriscaldato a 37 °C. Immergere il cuore nel tampone all'interno della camera riscaldata e regolare il rubinetto per fermare il flusso del tampone, inducendo un'ischemia globale. Regolare la durata dell'ischemia in base agli obiettivi specifici dell'esperimento.
  2. Ruotare il rubinetto per ripristinare il flusso tampone nel cuore dopo 30 minuti di ischemia, avviando la riperfusione. Lasciare riperifondere il cuore per 45 minuti prima di terminare l'esperimento per la colorazione per valutare le dimensioni dell'infarto (Figura 6G).
    NOTA: Il tempo di ischemia o riperfusione è determinato in base agli obiettivi sperimentali.
  3. Verificare la corretta induzione dell'ischemia osservando la riduzione della frequenza cardiaca e i modelli ECG irregolari (Figura 7A). Si osserverà aritmia o fibrillazione ventricolare.
  4. Somministrare lentamente 10 ml di HBSS a 4 °C attraverso la porta laterale del rubinetto per arrestare il cuore. Rimuovere il cuore dalla colonna di perfusione, tagliare via il tessuto atriale rimanente e posizionare il cuore in una matrice di taglio dei tessuti.
  5. Coprire la matrice con pellicola trasparente e congelare il cuore a -80 °C per circa 8 min o fino a raggiungere una consistenza simile a un marshmallow. Togli la matrice per affettare i tessuti dal congelatore e inserisci le lamette da barba per tagliare il cuore in sezioni spesse 2 mm.
  6. Rimuovere le fette di tessuto dalla matrice di affettatura una ad una e conservarle a -80 °C fino a quando non sono necessarie per esperimenti biochimici.
  7. Eseguire la colorazione dell'infarto (Figura 7B). Incubare le fette di cuore in 10 mL di cloruro di trifeniltetrazolio all'1% p/v (TTC) a 37 °C per 30 minuti.
  8. Trasferire la fetta di tessuto in formalina tamponata al 10% e lasciarla fissare a temperatura ambiente per una notte. Per ottenere i migliori risultati, rimuovere il cuore dalla formalina e visualizzare il tessuto entro 24 ore. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce durante questa fase per evitare il degrado della macchia.
  9. Fotografare la fetta macchiata e utilizzare software come ImageJ per stimare le dimensioni dell'infarto.

6. Stabilire interfacce optoelettriche bidirezionali tra dispositivi e tessuto cardiaco (Figura 8, Figura 9)

  1. Posizionare la membrana optoelettronica in silicone nella posizione desiderata per la stimolazione. La membrana di silicio si attacca automaticamente all'epicardio con forza capillare (Figura 8A). Se l'attaccamento è difficile, utilizzare adesivi per tessuti umidi per facilitare l'attaccamento.
    NOTA: Ridurre il tasso di perfusione potrebbe ridurre la quantità di acqua sulla superficie del cuore, facilitando l'attaccamento. Una volta attaccata alla superficie del cuore, la membrana di silicone si attacca tipicamente alla posizione predeterminata durante il funzionamento.
  2. Collegare gli elettrodi ai sistemi RHD o ad altre piattaforme elettrofisiologiche per la registrazione dei dati. I MEA sono dotati di piazzole I/O a 16 canali con un passo di 0,5 mm a un'estremità, che sono collegate tramite un connettore ZIF (Zero-Insertion-force) a una scheda adattatore. La scheda adattatore viene quindi collegata all'headstage tramite un connettore Omnetics.
  3. Posizionare i MEA flessibili sulle superfici ventricolari del cuore di ratto isolato (Figura 8A). Posizionare i MEA all'interno della finestra se si utilizza una membrana in silicone a forma di finestra (Figura 8B).
  4. Programmare la sorgente laser a 635 nm con la frequenza (ad es. 4 Hz) e il ciclo di lavoro desiderati (ad es. 0,4%, durata dell'impulso di 1 ms) utilizzando segnali TTL (Transistor-Transistor Logic). Focalizzare lo spot laser sulla membrana di silicone, con una dimensione dello spot di circa 1 mm. Indossare occhiali protettivi di sicurezza laser. Inizia con una bassa intensità per la messa a fuoco.
  5. Avviare il protocollo di registrazione e stimolazione. Aumentare gradualmente l'intensità del laser fino a quando non si osserva una stimolazione di override ininterrotta (Figura 8C).
    NOTA: Negli standard di questo protocollo, definisce l'intensità di soglia alla quale il laser consente 10 secondi di stimolazione ininterrotta.
  6. Programmare il profilo laser con diverse durate dell'impulso per ottenere un profilo di intensità rispetto alla durata per confrontare le prestazioni del dispositivo (Figura 8D). La configurazione consente la registrazione multicanale di ECG, TTL e LVP (Figura 8E).
  7. Modificare la posizione della membrana di silicio o la posizione del punto luminoso e ripetere i passaggi 6.3-6.6 per studiare come le diverse posizioni di stimolazione influenzano le forme d'onda stimolate e la conduzione cardiaca (Figura 9A).
  8. Identificare i picchi QRS stimolati da ciascun sito di registrazione per costruire l'isocrona o la mappa del ritardo di attivazione. Identificare il primo picco QRS e impostare tale posizione come ritardo zero per tracciare la mappa del ritardo di attivazione (Figura 9B-C).
    NOTA: Mentre la mappa del ritardo di attivazione nel ritmo sinusale (senza stimolazione) può servire come riferimento, il suo schema può variare in modo significativo a seconda delle condizioni cardiache e del posizionamento MEA18,30. I risultati sono più significativi quando è presente una chiara fonte di stimolazione, come la stimolazione esterna.

7. Stabilire interfacce elettriche bidirezionali tra dispositivi e tessuto cardiaco ( Figura 10)

  1. Collegare gli elettrodi di stimolazione (0,5 cm x 0,5 cm) in una configurazione a due elettrodi, posizionando l'elettrodo di lavoro sulla parete ventricolare sinistra mentre il controelettrodo si trova sulla parete ventricolare destra.
  2. Fornire forme d'onda di corrente quadra (ad es. 1 mA, durata dell'impulso di 1 ms) attraverso un potenziostato fino a quando la stimolazione non riesce (Figura 10A-B). Eseguire test per ottenere grafici della corrente di stimolazione rispetto alla durata dell'impulso e della tensione di stimolazione rispetto alla durata dell'impulso per valutare l'efficacia della stimolazione del materiale (Figura 10C-D).
  3. Esecuzione della registrazione elettrica utilizzando un array di microelettrodi 4 x 4 (distanza di 2 mm tra gli elettrodi) e registrazione utilizzando una scheda di interfaccia USB RHD e un headstage di registrazione con ingresso RHD a 16 canali. Registra i segnali a 10 kS/s nella larghezza di banda 0,1-100 Hz.
  4. Misurare il rumore di ciascun elettrodo di registrazione (Figura 10E). Calcolare l'SNR utilizzando la seguente equazione (Figura 10F):
    figure-protocol-1ofigure-protocol-2
    dove il segnale è l'ampiezza del segnale e ilrumore standard è la deviazione standard dei livelli di rumore. Nella registrazione, il filtro notch a 60 Hz è disattivato per riflettere i risultati grezzi.
  5. Esegui ulteriori analisi e traccia mappe isocrone della propagazione elettrica utilizzando Python.
  6. Determina un timestamp della deflessione di picco (complesso QRS stimolato) per ogni contrazione e calcola la media per più segnali. Utilizzare l'interpolazione gaussiana per il rendering della mappa per migliorare la leggibilità.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'elettrofisiologia della stimolazione di un'ampia gamma di materiali optoelettronici ed elettronici può essere convalidata in modo efficiente utilizzando il sistema cardiaco ex vivo , che fornisce una configurazione comoda e controllata (Figura 1A). I materiali ad alta iniezione di carica, come il silicio poroso e il carbonio poroso, facilitano la modulazione bioelettrica con bassa intensità ottica e stimolazione a bassa tensione, garantendo sicurezza e funzionamento capacitivo con bilanciamento della carica.

Il silicio nanoporoso mostra una generazione di fotocorrente significativamente più elevata rispetto alle strutture di silicio convenzionali, come le giunzioni p-n o p-i-n (Figura 11A), grazie alla sua eterogiunzione20 abilitata alla porosità, alla maggiore capacità di accumulo di carica, all'impedenza ridotta e al migliore assorbimento ottico. Queste fotocorrenti prevalentemente capacitive consentono una stimolazione biosicura e bilanciata in carica31 (Figura 12A-B), raggiungendo la stimolazione ottica di cuori di ratto ex vivo a 240 bpm con un'intensità luminosa di 0,51 mW/mm2 e una durata dell'impulso di 1 ms (Figura 8C), o fino a 0,167 mW/mm2 con una durata dell'impulso di 10 ms (Figura 11B) - valori paragonabili o inferiori ai metodi optogenetici e ben al di sotto delle soglie di sicurezza laser31, 32. Al di sotto di queste intensità, può verificarsi una cattura parziale o mancata di impulsi luminosi. Al contrario, altri materiali, come le membrane di silicio p-i-n o le membrane di silicio p-i-n decorate in oro, richiedono intensità ottiche significativamente più elevate per suscitare la stimolazione (Figura 11B). La stimolazione continua con silicio nanoporoso aumenta la contrazione meccanica, come indicato da LVP elevato (Figura 8E). Inoltre, nella sua forma monolitica, il dispositivo dimostra un'iniezione di fotocorrente ad alta risoluzione spaziale sotto impulsi luminosi localizzati, consentendo studi di stimolazione multisito e potenziali ad accesso casuale26.

Negli studi bidirezionali sulla membrana di silicio a forma di finestra (Figura 3D, Figura 8B), la stimolazione multisito produce profili di registrazione multielettrodo e modelli di conduzione cardiaca distinti, convalidando l'originalità della propagazione dell'onda da ciascun punto di stimolazione (Figura 9). Questa caratteristica evidenzia la capacità del sistema di analizzare complesse vie di conduzione cardiaca con elevata precisione e la capacità di diagnosticare condizioni cardiache anomale come l'infarto del miocardio.

I MEA fabbricati hanno uno spessore di circa 10 μm e incorporano strutture macroporose o interconnessioni a serpentina per ridurre al minimo la rigidità alla flessione e migliorare la flessibilità o l'estensibilità (Figura 4)33,34. Gli array sono costituiti da 16 siti di registrazione indipendenti disposti in una configurazione 4 x 4, che coprono un'area di 6 mm x 6 mm. Questi array consentono la registrazione diretta del segnale epicardico in più siti sulla superficie del cuore. Una registrazione rappresentativa a 16 canali è illustrata nella Figura 13. Le mappe isocrone costruite dalle registrazioni visualizzano la conduzione elettrica attraverso la superficie del cuore, con o senza stimolazione localizzata. La stimolazione localizzata spesso induce ritardi nella conduzione che annullano il ritmo sinusale intrinseco del cuore ex vivo e le vie di conduzione (Figura 9B).

I materiali di carbonio nanostrutturati rappresentano una soluzione efficace per migliorare le prestazioni dei dispositivi bioelettronici grazie alla loro elevata capacità di accumulo di carica e alla bassa impedenza (Figura 14). Il nostro metodo di trasferimento laser assistito da sale consente una facile modellazione e il trasferimento istantaneo di dispositivi in carbonio nanoporoso su substrati flessibili o elettrodi Au tradizionali per migliorare le prestazioni della bioelettronica. La caratterizzazione dell'impedenza ha ulteriormente confermato che il rivestimento in carbonio ha sostanzialmente ridotto l'impedenza dell'elettrodo Au di circa 2 ordini di grandezza, da 7244,4 Ω a 63,1 Ω a 100 Hz di frequenza pertinente ai segnali ECG (Figura 14A-B). La capacità di Helmholtz dell'elettrodo Au è aumentata significativamente dopo il rivestimento in carbonio, da 0,025 mF/cm2 a 1,98 mF/cm2 (Figura 14C). L'aumento della capacità utilizzando questa strategia di rivestimento del microcondensatore può ridurre efficacemente la tensione di polarizzazione rispetto all'elettrodo Au tradizionale (Figura 14D).

Questo protocollo stabilisce una piattaforma nanoporosa a base di carbonio per biointerfacce efficaci verso la modulazione elettrica o il rilevamento dei sistemi cardiaci (Figura 10). Per valutare le prestazioni dell'elettronica del carbonio nanoporoso per la stimolazione cardiaca, l'elettrodo Au o Au-C è stato posizionato sulla parete ventricolare sinistra (LV) per l'iniezione di carica a forme d'onda bifasiche a corrente quadra35 (Figura 10A). Dopo una stimolazione a 4 Hz (1 mA), entrambi gli elettrodi Au e Au-C hanno raggiunto un'efficace stimolazione overdrive (Figura 10B). Tuttavia, nel gruppo Au-C è stata osservata un'ampiezza ECG notevolmente più elevata, indicativa della forza di contrazione. Entrambi gli elettrodi hanno dimostrato una diminuzione esponenziale della corrente di soglia per la stimolazione con la durata dell'impulso. Anche le soglie di stimolazione, che indicano le tensioni più basse per un'efficace modulazione di frequenza, sono state misurate su varie larghezze di impulso (Figura 10C-D). La curva forza-durata è stata modellata utilizzando l'equazione:

figure-results-1

dove I(t) si riferisce alla corrente di stimolo alla durata dell'impulso (t), Ireobase è la corrente di soglia a una durata dell'impulso infinitamente lunga (reobase) e τ è la costante di tempo della membrana36. Il calcolo utilizza la carica minima necessaria per una stimolazione di successo a chronaxie come figure-results-2. Qmin. I valori sono stati determinati come 0,79 e 0,71 μC rispettivamente per gli elettrodi Au e Au-C (Figura 10C). A una corrente di stimolazione di 4 mA/cm2, sono state osservate tensioni di soglia per una stimolazione efficace rispettivamente a 1,32 V e 0,90 V per gli elettrodi Au e Au-C (Figura 10D). La riduzione del 30,3% della tensione di soglia suggerisce una potenziale diminuzione dello stress ossidativo durante la stimolazione prolungata31, facilitando così applicazioni bioelettroniche più sicure con danni minimi ai tessuti. Inoltre, è stato sviluppato un elettrodo Au a 16 canali innestato in carbonio per una migliore rilevazione del segnale ECG epicardico (Figura 10E-F). Il trasferimento di carbonio nanostrutturato ha notevolmente migliorato il rapporto segnale/rumore di 8,0 volte rispetto ai tradizionali elettrodi Au, dimostrando l'efficacia dei rivestimenti nanoporosi a base di carbonio per la bioelettronica ad alta fedeltà.

Il successo dell'induzione di modelli di infarto I/R è stato convalidato in loco durante l'esperimento o post-sperimentale attraverso il monitoraggio del segnale fisiologico o la colorazione TTC, rispettivamente. Dopo l'affettatura e la colorazione, il cuore infartuato mostrerà una regione di colore bianco, che rappresenta il danno miocardico e corrisponde alla dimensione dell'infarto (Figura 7B). Al contrario, un cuore sano mancherà di regioni bianche dopo la colorazione. Durante il monitoraggio in tempo reale, un modello di ischemia di successo mostrerà una frequenza cardiaca significativamente ridotta, evidente nelle letture LVP ed ECG. Inoltre, la mappatura MEA del cuore ischemico rivelerà una diminuzione della velocità di conduzione elettrica attraverso l'epicardio, con conseguente aumento del tempo di ritardo37 (Figura 7A).

figure-results-3
Figura 1: Illustrazione schematica del protocollo e del flusso di lavoro di fabbricazione. (A) Illustrazione schematica della configurazione ex vivo del cuore di ratto e dell'interfaccia del dispositivo. (B) Processo di fabbricazione di membrane di silicio porose (fase 1). La fabbricazione della membrana porosa di Si inizia con un wafer SOI, in cui uno strato di fotoresist viene modellato tramite fotolitografia per definire le caratteristiche esagonali. Il RIE rimuove selettivamente il silicio esposto, seguito da un processo di lift-off in HF tamponato per rilasciare le membrane di Si. La membrana viene sottoposta a mordenzatura in una soluzione a base di HF, generando una struttura di Si nanoporosa. La membrana porosa di Si risultante viene accuratamente staccata e trasferita su un substrato PDMS per il supporto meccanico. Infine, il trattamento al plasma modifica le proprietà della superficie per migliorare le fotocorrenti. (C) Processo di fabbricazione di array multielettrodi macroporosi flessibili (fase 2). La fabbricazione di MEA flessibili inizia con il rivestimento PI su un wafer di silicio che funge da strato di substrato flessibile. La fotomodellazione viene eseguita utilizzando il fotoresist AZ 2020 per definire le aree degli elettrodi. La deposizione di metalli (Au/Ti) viene effettuata tramite evaporazione a fascio di elettroni per creare tracce conduttive, seguita da un'altra fase di fotopatterning utilizzando AZ 40XT-11D per proteggere regioni selezionate da RIE per formare un substrato macroporoso. Una fase di fotomodellazione SU-8 e hard bake aggiunge l'incapsulamento prima che il processo di decollo finale rilasci il MEA flessibile dal wafer di Si. (D) Flusso di lavoro della modellazione e del trasferimento della membrana di carbonio (fase 3), che comprende la lavorazione delle fibre tramite impregnazione salina, la microfabbricazione attraverso la sintesi laser e il trasferimento del modello assistito dall'acqua dal substrato di carta ad altri supporti. La Figura 1D è stata modificata da27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 2: Immagini ottiche e SEM dei dispositivi as-fabriced. (A) SEM in sezione trasversale (in alto) e immagine al microscopio ottico (in basso) di Si nanoporoso. (B) Immagini ottiche di array di multielettrodi macroporosi con design cavo (in alto) e serpentino (in basso). (C) Immagine al microscopio ottico in sezione trasversale (in alto) e foto (in basso) di substrati carbonizzati. La Figura 2A è stata modificata da26. La Figura 2C è stata modificata da27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 3: Progetti CAD del dispositivo a membrana Si. La figura descrive in dettaglio i parametri per (A) dispositivi a membrana in silicio piccoli, (B) medi, (C) grandi e (D) aperti a forma di finestra. Unità: mm. Questa cifra è stata modificata da26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 4: Progettazione CAD dei MEA macroporosi. (A) I disegni di progetto e le annotazioni per il MEA di forma cava. (B) I disegni di progetto e le annotazioni per il MEA a forma di serpentina. Unità: mm. La Figura 4A è stata modificata da26. La Figura 4B è stata modificata da28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-7
Figura 5: Schemi e progetti degli array di elettrodi a base di carbonio per l'interfacciamento cardiaco. (A) Progettazione delle interfacce degli elettrodi stimolanti (fase 3). Durante una stimolazione tipica, gli elettrodi di stimolazione sono stati collegati in una configurazione a due elettrodi. L'elettrodo di lavoro (serpentino nanoporoso in carbonio) è stato posizionato sulla parete ventricolare sinistra, mentre il controelettrodo è stato posizionato sulla parete ventricolare destra e collegato al suolo. Le forme d'onda a corrente quadra sono state erogate attraverso un potenziostato. (B) I MEA a 16 canali per il mascheramento e il trasferimento dell'elettrodo di carbonio (fase 3). Lo strato 1 indica il pattern Au di un MEA a 16 canali su un substrato PI. Lo strato 2 indica il film di incapsulamento in PET. Questa cifra è stata modificata da27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-8
Figura 6: Rappresentazione schematica e fotografica dell'allestimento ex vivo e del processo sperimentale. (A) Apparecchi e strumenti utilizzati per l'allestimento ex vivo, compresi i contenitori per matracci conici, gli strumenti chirurgici, i sistemi di perfusione e i sistemi di controllo della temperatura (fase 4). (B) Processo di estrazione del cuore di ratto: anestetizzare l'animale con isoflurano; Fissare le braccia del topo; aprire la gabbia toracica del topo; Raccogli il cuore di topo. (C) Rimozione del tessuto adiposo circostante dal cuore estratto per prepararlo alla configurazione sperimentale. (D) Attaccamento del cuore estratto al sistema di perfusione ex vivo. (E) Configurazione della perfusione che mostra il cuore collegato al sistema per simulare le condizioni fisiologiche. (F) Impostazione della registrazione ECG cardiaca. (G) I processi di ischemia-riperfusione (I/R) sono dimostrati attraverso il setup (fase 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-9
Figura 7: Confronto tra cuore sano isolato e cuore I/R. (A) I ritardi di LVP, ECG e propagazione dell'ECG sono stati registrati da cuori sani fittizi e da cuori di ischemia/riperfusione (I/R). (B) Fotografie rappresentative di un cuore sano colorato con trifeniltetrazolio cloruro (TTC) e sezioni di cuore I/R. L'area bianca indica la dimensione dell'area infartuata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-10
Figura 8: Stimolazione optoelettronica bidirezionale e registrazione elettrica di un cuore di ratto ex vivo utilizzando membrana di silicio poroso e MEA flessibili. (A) Fotografia che mostra l'attacco della membrana di silicio e il posizionamento di MEA a forma di serpentino accanto alla membrana di silicio sul cuore. (B) Fotografia che mostra il fissaggio di una membrana di silicio aperta a forma di finestra e MEA di forma cava montati all'interno della finestra Si. (C) Stimolazione ottica sul cuore di ratto ex vivo che mostra la non cattura, la cattura parziale e la cattura completa a tre diverse intensità a 240 bpm e una durata dell'impulso di 1 ms. (D) Grafico dell'intensità rispetto alla durata per valutare la soglia di stimolazione del dispositivo. (E) Profili di stimolazione ottica con intensità inferiore a 0,24 mW/mm2 e durata dell'impulso di 10 ms. Le figure 8B-D sono state modificate da26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-11
Figura 9: Pacing e mappatura multisito nelle interfacce bidirezionali. (A) Posizioni dei siti di stimolazione e registrazione. (B) La mappa isocrona mostra il ritardo di attivazione del segnale elettrico dopo la fotostimolazione di otto diverse posizioni su un dispositivo Si monolitico a finestra aperta. (C) Il controllo esemplare e le tracce ECG a 16 canali stimolate in diverse posizioni di stimolazione. Stimolando varie posizioni, l'attivazione spaziale ha indotto ritardi temporali nell'evoluzione del QRS rilevati nei tessuti in diversi siti di registrazione. Questi possono essere rappresentati come una mappa del ritardo di attivazione, che consente l'esame delle vie di conduzione sulla superficie del cuore. Questa cifra è stata modificata da26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-12
Figura 10. Bioelettronica a base di carbonio nanoporoso per la stimolazione e la registrazione cardiaca. (A) Immagine ottica di un elettrodo di Au (Au-C) innestato con membrana di carbonio poroso per la stimolazione cardiaca. L'immagine nel riquadro mostra la vista ingrandita di un microcondensatore strutturato a serpentina sull'elettrodo Au. (B) Risposta ECG del cuore di ratto isolato alla stimolazione bifasica della forma d'onda a corrente quadra a una frequenza di 4 Hz. Con la stessa densità di corrente di 4,0 mA/cm2, il cuore ha mostrato diverse risposte ECG sotto stimolazione da elettrodi Au o Au-C. (C) Le curve durata-intensità degli elettrodi di stimolazione Au e Au-C e il loro adattamento della curva sono presenti a una frequenza di stimolazione di 4 Hz. (D) La tensione di soglia applicata agli elettrodi per una stimolazione efficace a durate diverse per gli elettrodi Au e Au-C. (E) Curve di base dei segnali ECG registrati con l'elettrodo Au e gli elettrodi Au-C. (F) Il rapporto segnale/rumore (S/N) è calcolato dalle curve ECG registrate. Le figure nel riquadro mostrano le immagini ottiche dell'array di elettrodi Au e Au-C utilizzati per la registrazione ECG (dimensione dell'elettrodo: 1 mm; passo 7,5). Questa cifra è stata modificata da27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-13
Figura 11: Confronto delle fotocorrenti per diversi dispositivi Si e valutazione della soglia di stimolazione. (A) Confronto delle magnitudini della fotocorrente in quattro dispositivi basati su Si. Le tracce blu rappresentano le fotocorrenti medie di N = 8 dispositivi indipendenti, mentre le tracce grigie sovrapposte illustrano le misurazioni dei singoli dispositivi. Il grafico a barre allegato mostra i valori di fotocorrente di picco (in blu) e le iniezioni di carica integrate (in arancione). I grafici a barre sono espressi come media ± s.d. Barra della scala, 10 ms. (B) La stimolazione cardiaca ex vivo è stata eseguita utilizzando i tre diversi dispositivi. La stimolazione è stata condotta con una frequenza di 240 b.p.m. e un'ampiezza dell'impulso di 10 ms. Questa cifra è stata modificata da26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-14
Figura 12: Caratterizzazione del bilancio di carica integrando la carica iniettata e quella restituita. (A) Illustrazione del processo di carica e scarica nel caratteristico tracciato di fotocorrente. (B) Calcolo degli oneri totali relativi all'iniezione e al ritorno della carica. I risultati hanno mostrato nel complesso un buon bilanciamento della carica a diverse durate di stimolazione. Questa cifra è stata modificata da26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-15
Figura 13: I segnali elettrici rappresentativi raccolti da ciascun elettrodo nel MEA a 16 canali. I segnali elettrici in 16 canali (Ch) mostrano le informazioni dell'elettrocardiogramma (ECG) del cuore pulsante ex vivo. La cifra è stata modificata da28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-16
Figura 14. Proprietà elettrochimiche della bioelettronica nanoporosa a base di carbonio. (A) L'interfaccia elettrochimica tra tessuti eccitabili e interfacce di carbonio modellate. (B) Impedenza e spettri di fase degli elettrodi Au e Au-C con curve adattate secondo il circuito visualizzato in A. (C) Misura CV di pattern Au e C con la stessa geometria, con un intervallo di tensione da -0,2 a 0,4 V rispetto a un elettrodo Ag/AgCl standard. (D) Variazioni di tensione degli elettrodi Au e Au-C durante un ciclo di stimolazione galvanostatica bifasica. Questa cifra è stata modificata da27. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

CompostoVarietà consigliataConc. [mM]MWPer 1 LPer 2 L
NaClSigma (S9625)12658.47.3614.7
KclSigma (P4504)5.474.60.40.8
GlucosioSigma (G7021)101801.83.6
HEPESSigma (H4034)102382.3834.766
MgCl2.7H2OSigma (M9272)12031 ml2 ml
Stock 1 MStock 1 M
CaCl2.2H2OSigma (C3881)21471 ml2 ml
Calcio 2 MCalcio 2 M
NaH2PO4Sigma (S0751)0.391201 ml2 ml
Calcio 0,39 MCalcio 0,39 M

Tabella 1: Componenti della soluzione HEPES Tyrode.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo ha introdotto la piattaforma ex vivo per il cuore di ratto (Figura 1A) e il modello I/R per offrire studi di elettrofisiologia a livello di organo rapidi e convenienti per accompagnare gli sforzi e le richieste di ricerca in rapida crescita nel campo della bioelettronica38. Ha dettagliato la fabbricazione e la convalida di tre sistemi di dispositivi, vale a dire silicio nanoporoso, array multielettrodi flessibili e carbonio nanoporoso (Figure 1B-D), come punto di riferimento per le interrogazioni elettrofisiologiche bidirezionali. Il silicio nanoporoso consente una stimolazione spaziotemporale a bassa intensità, capacitiva e elevata, gli array multielettrodi flessibili consentono la registrazione multicanale e la mappatura delle attività epicardiche e il carbonio nanoporoso porta alla stimolazione a bassa tensione e alla registrazione SNR elevata se combinato con MEA27.

La stimolazione ottica è stata precedentemente dimostrata utilizzando l'optogenetica, un metodo che richiede la modificazione genetica per esprimere canali ionici sensibili alla luce nei tessuti bersaglio33. Sebbene efficace, l'optogenetica introduce una complessità significativa a causa della necessità di vettori virali o approcci transgenici, sollevando preoccupazioni in termini di sicurezza, etica e regolamentazione, in particolare per le applicazioni cliniche. Al contrario, la biostimolazione non genetica basata su semiconduttori offre un'alternativa più semplice e più valida dal punto di vista traslazionale 39,40,40,42. Materiali come il silicio e altri semiconduttori organici consentono la modulazione optoelettronica diretta dei tessuti senza alterazione genetica, sfruttando le fotocorrenti capacitive per una stimolazione biosicura e bilanciata in carica. Questo approccio raggiunge prestazioni paragonabili o addirittura superiori all'optogenetica in termini di intensità di stimolazione, operando ben al di sotto delle soglie di sicurezza del laser per ridurre al minimo il danno tissutale31,32 (Figura 8). La natura non genetica della biostimolazione basata su semiconduttori elimina le barriere associate alla modificazione genetica, aprendo la strada a una più ampia adozione in contesti clinici e a diverse applicazioni nell'ingegneria tissutale e nella medicina bioelettronica. Tuttavia, i dispositivi devono essere progettati con cura per integrarsi con il tessuto, dove la biocompatibilità deve essere attentamente considerata, così come il luogo di interfaccia per una stimolazione e una registrazione efficienti (Figura 8A-B). Inoltre, la presenza di materiale sulla superficie del tessuto può ostacolare la possibilità di imaging in tempo reale, a meno che un dispositivo non possa essere progettato per essere trasparente alla finestra di eccitazione-emissione di determinati agenti di imaging.

Il silicio nanoporoso si distingue tra i fotostimolatori a semiconduttore in quanto non richiede un elettrodo di ritorno artificiale, a differenza dei materiali precedentemente riportati26. Questa proprietà unica deriva dalla sua capacità di formare regioni catodiche e anodiche spazialmente risolte in base alle dimensioni e alla posizione del punto luminoso. La superficie illuminata funge da sito di iniezione catodica, mentre le regioni periferiche circostanti facilitano il ritorno della corrente anodica. Questo meccanismo consente la stimolazione multisito su membrane monolitiche prive di pixel, consentendo una stimolazione precisa e localizzata. In particolare, la stimolazione della luce localizzata, piuttosto che l'illuminazione globale, è fondamentale per creare profili di stimolazione bipolare efficienti. Inoltre, le dimensioni del dispositivo influiscono in modo significativo sulle prestazioni; I dispositivi più grandi generano correnti più elevate nelle stesse condizioni di stimolazione, migliorando ulteriormente la loro versatilità funzionale.

Il fallimento della stimolazione ottica può derivare da vari fattori, anche in modelli biologici sani, principalmente legati all'integrità del dispositivo e all'accoppiamento della biointerfaccia. In primo luogo, un'accurata caratterizzazione della fotocorrente è fondamentale prima della stimolazione cardiaca. Fotocorrenti inferiori al previsto possono derivare dalla degradazione del materiale43 passivazione dell'ossido dopo uno stoccaggio prolungato, dalla sovraincisione durante il processo di mordenzatura, dalle fratture del dispositivo durante la manipolazione o il trasferimento o dall'orientamento errato del dispositivo durante l'interfacciamento. Per mitigare i danni meccanici, il PDMS è stato utilizzato come substrato morbido per accogliere le membrane di silicio nanoporose, fornendo protezione contro potenziali danni derivanti dalla manipolazione diretta con le pinzette. In secondo luogo, è essenziale stabilire un'interfaccia senza soluzione di continuità con l'epicardio, che in questa configurazione viene perfuso con i biofluidi. Uno spesso strato di biofluido può ostacolare il corretto attaccamento e compromettere l'efficacia del stimolo. Per migliorare l'accoppiamento della biointerfaccia, è possibile utilizzare bioadesivi42,43 o sutura per stabilizzare la connessione e garantire una stimolazione affidabile. In particolare, il silicio nanoporoso utilizzato nel nostro studio è biodegradabile, supporta applicazioni di stimolazione temporanee ma degrada le prestazioni entro 1-2 giorni in condizioni fisiologiche. Per una stabilità a lungo termine, si dovrebbe prendere in considerazione la passivazione superficiale44 o l'uso di materiali semiconduttori più durevoli.

Durante la stimolazione ex vivo, il graduale aumento del LVP (Figura 8E) a frequenze più elevate (ad esempio, 4 Hz) deriva probabilmente da una maggiore contrattilità miocardica, dall'accumulo di calcio e dal meccanismo di Frank-Starling45. Frequenze di stimolazione elevate migliorano il ciclo intracellulare del calcio e la dinamica di riempimento ventricolare, aumentando la forza di precarico e di contrazione46. Sebbene ciò possa aumentare la domanda di ossigeno del miocardio e il rischio di aritmia, questi effetti possono essere mitigati da una sufficiente pre-ossigenazione, da un attento monitoraggio dell'ECG e da parametri di stimolazione controllati. Nei nostri esperimenti, non sono stati osservati effetti avversi significativi.

Nella registrazione multielettrodo, specificare le posizioni degli elettrodi sul cuore e le loro posizioni relative all'elettrodo di stimolazione è fondamentale per un'analisi significativa. È essenziale eliminare la diafonia tra gli elettrodi per garantire la cattura di forme d'onda distinte e modelli temporalmente risolti. Gli array di elettrodi flessibili in genere stabiliscono una buona interfaccia con l'epicardio; Tuttavia, l'adesione può essere ulteriormente migliorata utilizzando rivestimenti adesivi ionicamente conduttivi, come strati sottili di idrogel28,43 per migliorare la stabilità e la qualità del segnale.

I materiali nanostrutturati in grafene/carbonio, con ampie superfici per lo stoccaggio e l'iniezione di carica, possono migliorare le prestazioni dei dispositivi bioelettronici riducendo l'impedenza alle giunzioni elettrodo-soluzione salina e aumentando le capacità di iniezione di carica35. I metodi attuali per modellare i materiali di grafene su elettrodi flessibili (ad esempio, Au) includono l'elettrodeposizione, lo spin coating e la serigrafia47. Tuttavia, questi metodi sono in genere associati a processi di fabbricazione complessi, capacità di modellazione limitate e prestazioni ridotte a causa del volume inattivo dei leganti. È stato utilizzato un metodo di sintesi laser per generare modelli di carbonio nanostrutturati su substrato di cellulosa e quindi trasferirli su altri film morbidi per creare una biointerfaccia conforme, che presenta un modo semplice ed efficace per la fabbricazione di bioelettronica. La combinazione di rivestimenti in carbonio modellati con piccole dimensioni geometriche fino al livello di una singola cellula, che aumenterebbero il campo elettrico localizzato, e strutture altamente porose della membrana di carbonio per ridurre la resistenza all'interfaccia elettrodo-tessuto, raggiungerà sinergicamente un'efficiente stimolazione biologica e registrazione in futuro48.

Sebbene sia un modello di malattia conveniente, il modello I/R ex vivo di Langendorff manca di interazioni sistemiche, isolando il cuore dalle risposte neuroormonali e immunitarie, e si basa sulla perfusione artificiale con tamponi, che possono alterare condizioni fisiologiche come l'erogazione di ossigeno e la funzione endoteliale. La sua limitata vitalità limita gli studi agli eventi acuti. Ciononostante, il modello offre un ambiente altamente controllato con regolazioni precise dei parametri e una buona riproducibilità. Consente inoltre la misurazione della funzione cardiaca in tempo reale, il che lo rende uno strumento prezioso per esplorare nuove strategie terapeutiche per la cardiopatia ischemica. Ad esempio, i dispositivi elettroceutici potrebbero essere concepiti per precondizionare il cuore, addestrandolo a sopportare ambienti di specie reattive dell'ossigeno (ROS) o per mitigare i livelli di ROS per un migliore recupero. L'efficacia di tali trattamenti potrebbe essere valutata attraverso metriche come i modelli di battito cardiaco, le forme d'onda ECG e la velocità di conduzione. Inoltre, una piattaforma di stimolazione multisito potrebbe fornire informazioni spaziali sull'infarto del miocardio, consentendo una valutazione più dettagliata delle regioni colpite. Questo approccio potrebbe anche dimostrare soglie di stimolazione migliorate, correlate alla gravità dell'infarto, offrendo un quadro completo per la valutazione e l'ottimizzazione terapeutica.

Sebbene il protocollo abbia evidenziato l'uso dei tre dispositivi in modelli cardiaci bidirezionali ex vivo , la loro applicabilità si estende ben oltre i tessuti cardiaci. Questi dispositivi possono essere facilmente adattati per l'uso con altri tessuti o organi elettricamente eccitabili, come tessuti neurali, muscoli scheletrici e sistemi gastrointestinali, dove la modulazione elettrica precisa è fondamentale, rendendoli strumenti versatili sia per la ricerca che per le applicazioni traslazionali nella medicina bioelettronica.

Dichiarazioni

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P.L. e B.T. hanno depositato un brevetto sulla fabbricazione e l'applicazione del dispositivo in silicio nanoporoso. P.L., C. Y. e B. T. hanno depositato un brevetto per la fabbricazione e l'applicazione di dispositivi in carbonio nanoporoso. P. L. e B.T. hanno depositato un brevetto sulla fabbricazione e l'applicazione di array di microelettroni flessibili.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dal National Institute of Health attraverso la sovvenzione 1R56EB034289-01 e 1R01EB036091-01 e dall'US Army Research Office attraverso la sovvenzione W911NF-24-1-0053. P. L. è grato per il sostegno conferito dal Grier Prize in Biophysical Sciences Innovation.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Headstage a 16 canaliTecnologie IntanCodice: C3334
Cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolioSigma AldrichT8877-5Gcloruro di trifeniltetrazolio
2-propanolo (IPA) Fischer ScientificTrasmissione A451-4
Laser da 635 nm, 500 mWBagliore laserNA
AcetoneFischer ScientificA18-4
Evaporatore a fascio elettronico Angstrom EvovacAngstromNA
Sviluppatore AZ 300MIFMicrochimica18441123163Sviluppatore
AZ nlof 2020 Microchimica1A002020
AZ NMP MicrochimicaNADispositivo di rimozione del fotoresist
AZ40XT-11D Microchimica1000300Fotoresist
HF tamponatoTermo ScientificoAA44627K2
CaCl2.2H2OSigma Aldrich(C3881)
Laser CO2 Sistemi laser universaliVLS 4.60
Vernice conduttiva all'argentoPELCO16062Adesione conduttiva tra l'elettrodo e il filo di Cu di collegamento
Filo di rame incapsulato 0,1 mmAmazzonehttps://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/
B09TNM51S5/ref=asc_df_B09
TNM51S5?mcid=155de761ea4
c389ea86d45ba61a83e8d& tag
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=g& HVRand=664358781094905
4431& hvpone=& HVPTWO=& hvqmt
=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint
=& hvlocphy=9021716& hvtargid=
pla-1878323158943& psc=1
Digitalizzatore Digidata 1550Dispositivi molecolariNA
GlucosioSigma AldrichG7021
HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenoloTermo Scientifico14175095
Heidelberg MLA150 sceneggiatore direttoHeidelbergNA
eparina (1000 UI/kg)Sagent Pharmaceuticals1009655
HEPESSigma Aldrich(H4034)
Esano Sigma Aldrich52750-10MLSolvente
HFFisher ScientificoA513-500Grado di Tracemetal
HMDS Forno a vapore PrimeSistemi di ingegneria del rendimentoNA
HNO3Fisher ScientificoA509P500Grado di Tracemetal
Laminatore a caldoDeposito ufficiL410-AIncapsulamento multistrato
Sistemi Intan RHDTecnologie IntanVisualizzazione del materiale C3100
ECG iWorxiWorx IA-400D
Sonda LVD iWorxiWorxBP-100
Preamplificatore iWorxiWorxC-ISO-256
KclSigma Aldrich(P4504)
Palloncino in lattice (misura 4)Radnoti170404
MgCl2.7H2OSigma Aldrich(Codice: M9272)
NaClSigma Aldrich(S9625)
Nafion 117 contenente soluzioneSigma Aldrich31175-20-9Reagente di fissaggio per pattern di carbonio nanoporoso
NaH2PO4Sigma Aldrich(S0751)
NaOHSigma Aldrich221465
Sensori di sicurezzaFisher ScientificoNC9285739
Plasma-Therm incisore al fluoruro al plasma accoppiato induttivamentePlasma-ThermNA
PMMA (495 A6) MicrochimicaM130006
poli (dianidride-co-4,4'-ossidianilina piromellitica)Sigma Aldrich575801Precursore PI
Poli(etilene-co-vinil acetato)Sigma AldrichCodice 437247-250GPolimero per infiltrazione
Poli(alcol vinilico)Sigma AldrichCodice 341584-25G
Polietilene tereftalato (PET)AmazzoneKS-6304-21-11Tipo D Foglio in PET trasparente .0005" di spessore x 27" di larghezza x 10 piedi di lunghezza 1 pz
PotenziostatoBiologiciSP-200Stimolazione elettrica
resistere al forno SpedireLCC1-15-5
Microscopia elettronica a scansioneCarl ZeissSmeriglioStrumento per la caratterizzazione morfologica
wafer di silicio Materiali elettronici NOVAHS39626
Adesivo siliconicoWPIKWIK-SIL-SIncapsulamento
Borato di sodioSigma AldrichSX0355
Wafer SOIUltrasil3-10541Tipo-Orientamento:P/B(100) DT:7+/-1um DR:<. 005 Ohmcm HT:300+/-10um HR:1-30 Ohmcm Scatola:1um+/-5% UD-13998/UH-13962
SU-8 2002MicrochimicaSU-8 Serie 2000
Sviluppatore SU-8MicrochimicaSU-8 Serie 2000
Adesivo per tessuti umidi3MCodice: 1469SB
Carta da filtro qualitativa Whatman, Grado 1Sigma AldrichWHA1001150Substrato per la modellazione del carbonio

Riferimenti

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