Articolo metodologico

Isolamento e valutazione citofluorimetrica delle interazioni neuroimmunitarie in un modello murino di mini-ictus

DOI:

10.3791/68308

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20 giugno 2025

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1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la funzione delle cellule immunitarie dopo ictus ischemico utilizzando l'analisi citofluorimetrica in un modello di mini-ictus. Questo metodo consente un esame dettagliato delle interazioni neuroimmunitarie e può essere adattato per lo studio di altre malattie neurodegenerative, migliorando la nostra comprensione delle risposte immunitarie nella patologia dell'ictus.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ictus è una delle principali cause di morte e disabilità a lungo termine in tutto il mondo, con l'ictus ischemico che rappresenta la maggior parte dei casi. A seguito di un ictus ischemico, le cellule immunitarie residenti e infiltranti si attivano, contribuendo a un ulteriore danno neuronale. Tuttavia, i ruoli del sistema immunitario nella patologia dell'ictus ischemico non sono completamente compresi, in gran parte a causa della complessa e dinamica regolazione delle risposte immunitarie in reazione ai cambiamenti nel microambiente durante la neuroinfiammazione. Pertanto, è essenziale monitorare e analizzare l'attivazione delle cellule immunitarie residenti e infiltranti nel tempo dopo un ictus ischemico. In questo studio, presentiamo un protocollo per valutare la funzione di queste cellule immunitarie a seguito di ictus ischemico utilizzando l'analisi citofluorimetrica in un modello di mini-ictus. Microsezioniamo il tessuto cerebrale infartuato in punti temporali specifici e poi lo dissociamo in una sospensione unicellulare utilizzando metodi sia meccanici che enzimatici. Le cellule vengono fatte passare attraverso un colino cellulare da 70 μm e marcate con cocktail di anticorpi marcati in fluorescenza prima di essere quantificate mediante analisi citofluorimetrica. Sebbene questo test sia stato sviluppato specificamente per studiare le interazioni neuroimmunitarie dopo l'ictus ischemico, può anche essere facilmente adattato per studiare i meccanismi neuroimmunitari in altre malattie neurodegenerative, come la sclerosi multipla, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer.

Introduzione

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L'ictus è una causa predominante di mortalità e disabilità a lungo termine in tutto il mondo, con l'ictus ischemico che rappresenta la stragrande maggioranza dei casi 1,2,3. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di migliorare la nostra comprensione delle interazioni neuroimmunitarie che si verificano a seguito di un ictus ischemico, fornendo un approccio raffinato per valutare l'attivazione delle cellule immunitarie residenti e infiltranti in un modello murino di mini-ictus 4,5. L'intricata interazione tra queste cellule immunitarie e il microambiente neuronale è fondamentale per comprendere la fisiopatologia dell'ictus ischemico. Tuttavia, i meccanismi precisi alla base di queste interazioni neuroimmuni rimangono scarsamente chiariti, principalmente a causa della natura dinamica e sfaccettata delle risposte immunitarie innescate dalla neuroinfiammazione6. Questa tecnica mira a chiarire le complesse dinamiche delle risposte immunitarie nel contesto della neuroinfiammazione e il loro successivo impatto sul danno neuronale e sugli esiti di recupero.

Il razionale alla base dello sviluppo di questa tecnica deriva dal ruolo critico che le cellule immunitarie svolgono nell'esacerbare il danno neuronale e nell'influenzare il recupero a seguito di un evento ischemico. I metodi tradizionali di studio di queste interazioni spesso mancano della risoluzione necessaria per catturare le sfumature temporali e spaziali dell'attivazione delle cellule immunitarie. Utilizzando l'analisi citofluorimetrica su sospensioni di singole cellule derivate da tessuto cerebrale infartuato microdissezionato, questo protocollo offre una valutazione più dettagliata e dinamica dei profili delle cellule immunitarie nel tempo 7,8. Questo approccio consente l'identificazione di specifiche popolazioni di cellule immunitarie e dei loro stati funzionali, che sono fondamentali per comprendere la fisiopatologia dell'ictus ischemico.

Rispetto a tecniche alternative come la colorazione istologica o il sequenziamento dell'RNA di massa, che possono fornire informazioni limitate sui contributi individuali dei tipi di cellule immunitarie, questo metodo citofluorimetrico presenta diversi vantaggi. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che la citometria a flusso consente l'analisi ad alto rendimento di più marcatori contemporaneamente, facilitando una caratterizzazione più completa dei fenotipi e delle funzioni delle cellule immunitarie 9,10,11,12,13. Inoltre, la capacità di questo metodo di adattarsi a una varietà di condizioni neurodegenerative, come la sclerosi multipla, il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer, dimostra la sua versatilità e rilevanza nel più ampio corpus di letteratura che affronta le interazioni neuroimmunitarie.

Per i ricercatori che stanno valutando l'applicazione di questo metodo, è essenziale valutare gli obiettivi specifici del loro studio. Questa tecnica è particolarmente adatta per indagini che richiedono un'analisi temporale dettagliata delle risposte immunitarie nel contesto dell'ictus ischemico o delle malattie neurodegenerative correlate. Si raccomanda agli utenti di possedere una conoscenza di base della citometria a flusso e dell'esperienza con i modelli murini per implementare efficacemente questo protocollo e interpretare i dati risultanti. Fornendo un solido quadro per lo studio delle interazioni neuroimmunitarie, questo metodo contribuisce in modo significativo agli sforzi in corso per delineare le complessità del coinvolgimento immunitario nella patologia dell'ictus.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University. Si raccomanda che tutte le soluzioni siano sottoposte a filtrazione sterile e che tutte le provette utilizzate siano sterili.

1. Preparazione dei reagenti e del tampone

  1. Miscela di enzimi per la digestione: sciogliere la collagenasi IV per ottenere una concentrazione dello 0,25% e diluire la DNasi I per raggiungere una concentrazione finale di 2 U/mL.
  2. Tampone di selezione cellulare attivata magneticamente (MACS): sciogliere l'albumina sierica bovina (BSA) e l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per raggiungere concentrazioni rispettivamente dello 0,5% e 2 mM in 1x PBS.

2. Modello di ictus ischemico focale

NOTA: I topi C57BL/6 J (8-10 settimane) sono stati impiegati per stabilire un modello di ictus ischemico focale, come precedentemente descritto14. I topi possono essere anestetizzati in alternativa utilizzando una soluzione di avertina all'1,25% alla dose di 0,2 ml per 10 g di peso corporeo.

  1. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 3%, mantenendo un dosaggio dell'1,5% con un apparecchio per anestesia gassosa. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C durante l'intera procedura utilizzando un termoforo.
    NOTA: Questo studio sottolinea l'importanza di verificare il raggiungimento del piano chirurgico prima dell'inizio della procedura. Questo passaggio è fondamentale per garantire un accesso ottimale all'area mirata e per ridurre al minimo le potenziali complicanze durante l'intervento chirurgico.
  2. Taglia il pelo nella regione tra l'occhio destro e l'orecchio destro usando un rasoio elettrico. Creare un'incisione verticale nell'area designata adiacente agli occhi con un microscopio da dissezione.
  3. Separare delicatamente tutti i tessuti per esporre il cranio e identificare il ramo distale dell'arteria cerebrale media destra (MCA), caratterizzata da una struttura vascolare verticale a forma di "Y". Utilizza un trapano elettrico per penetrare nel cranio, avendo cura di rimuoverlo con cautela.
  4. Asportare delicatamente le meningi con micro-pinze.
  5. Esporre il ramo distale dell'arteria cerebrale media destra (MCA), quindi eseguire la legatura permanente del ramo distale dell'MCA destro utilizzando una sutura 10-0.
  6. Riposizionare il tessuto al suo stato originale e chiudere l'incisione cutanea del viso con adesivo per tessuti.
  7. Posiziona il mouse in posizione supina e taglia il pelo nella zona del collo con un rasoio elettrico.
  8. Creare un'incisione orizzontale nella regione del collo e separare delicatamente le ghiandole sottomandibolari.
  9. Sezionare accuratamente la guaina carotidea con micro-pinze, identificando l'arteria carotide comune e separandola dal nervo vago.
  10. Infilare una sutura 4-0 attraverso l'arteria carotide comune e fissarla con un nodo scorsoio.
  11. Ripetere il passaggio 10 sull'arteria carotide comune controlaterale. Occludere temporaneamente le arterie carotidi comuni bilaterali (CCA) per 7 minuti.
  12. Riposizionare il tessuto della ghiandola sottomandibolare nella sua posizione originale e chiudere l'incisione del collo con adesivo per tessuti.
    NOTA: Il gruppo di operazioni fittizie è stato sottoposto a procedure identiche a quelle del gruppo con ictus, con la singolare eccezione che l'MCA distale e il CCA sono rimasti non legati.
  13. Monitorare il topo durante e dopo la procedura chirurgica, compresa la respirazione e la temperatura corporea. Tenere il mouse su un tappetino riscaldante fino a quando non è completamente sveglio.

3. Perfusione e dissezione cerebrale

  1. Preparare una siringa da 50 ml e collegare un ago da 26 G alla sua estremità. Riempire la siringa con soluzione salina.
  2. Somministrare una doppia dose di avvertina all'1,25% per ottenere un'anestesia profonda nel topo.
    NOTA: Il mouse deve essere accuratamente confermato per essere completamente anestetizzato prima di procedere al passaggio successivo.
  3. Posiziona il topo in posizione supina su un pannello di gommapiuma, estendendo gli arti anteriori e posteriori, fissandoli in posizione con aghi da 26 G.
  4. Una volta che il topo è completamente anestetizzato, afferrare la pelle addominale con una pinza oftalmica e praticare un'incisione laterale per rivelare il fegato. Procedere a tagliare lungo entrambi i lati delle costole per esporre il cuore.
  5. Inserire l'ago da 26 G nel ventricolo sinistro e recidere il padiglione auricolare, quindi premere la siringa per consentire al sangue di defluire.
  6. Continuare il processo di perfusione fino a quando il sangue che fuoriesce dal padiglione auricolare appare chiaro.
  7. Decapitare il topo appena sopra il midollo spinale usando le forbici chirurgiche diritte.
  8. Crea un'incisione posteriore-anteriore nella pelle della testa per scoprire il cranio. Praticare due incisioni laterali all'incrocio tra le pareti laterali e la base del cranio.
  9. Taglia il cranio lungo la sutura sagittale e fai un'incisione tra le orbite.
  10. Utilizza una pinza per rimuovere il cranio che copre ogni emisfero, esponendo così il cervello, e trasferiscilo in una matrice cerebrale in acciaio di topo. Successivamente, sezionare il cervello in fette coronali consecutive di 2 mm di spessore.

4. Digestione del tessuto corticale in sospensione di una singola cellula e colorazione degli anticorpi per citometria a flusso

  1. Introdurre 500 μl di miscela di enzimi di digestione in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
  2. Separare delicatamente il tessuto dell'infarto e trasferirlo nella miscela di enzimi per la digestione utilizzando micro-pinze (Figura 1).
  3. Frammentare minuziosamente il tessuto in pezzi più piccoli possibili con una forbice oftalmica e incubare a 37 °C per 20 minuti.
  4. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare delicatamente e dosare la soluzione 10 volte per dissociare il tessuto in singole cellule, quindi far passare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Sciacquare continuamente sia la piastra a 12 pozzetti che il filtro cellulare con HBSS ghiacciato contenente calcio e magnesio.
  5. Centrifugare a 500 × g a 4 °C per 5 minuti, quindi scartare con cura il surnatante.
    NOTA: Dato che i pellet prodotti sono piuttosto sciolti e si staccano facilmente, si prega di astenersi dal disturbarli per evitare la perdita di celle.
  6. Risospendere il pellet in 1 mL di 1x PBS e ripetere il passaggio 5. Successivamente, risospendere il pellet in 150 μL di 1x PBS e trasferire la sospensione in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Centrifugare nuovamente a 500 × g a 4 °C per 5 min.
  7. Afferrare saldamente la piastra a 96 pozzetti e capovolgerla rapidamente per scartare il surnatante.
  8. Diluire il colorante a fluorescenza per la vitalità cellulare in un rapporto di 1:100 in 1x PBS, quindi risospendere il pellet in un'aliquota da 150 μl. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), al riparo dalla luce.
  9. Centrifugare a 500 × g a 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Diluire il cocktail di anticorpi sulla superficie cellulare nel tampone MACS. Senza lavare le cellule, aggiungere il cocktail di anticorpi sulla superficie cellulare e incubare per altri 15-20 minuti a 4 °C.
  10. Centrifugare a 500 × g a 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 150 μl di tampone MACS.
  11. Ripetere il passaggio 4.10 e trasferire la sospensione in provette da centrifuga da 1,5 mL o in provette da 5 mL in polistirene a fondo tondo.

5. Analisi e smistamento della citometria a flusso

  1. Progetta un pannello di citometria a flusso multicolore in base alla configurazione dello strumento, utilizzando tecniche manuali o uno strumento di progettazione online, per ottimizzare la selezione dei fluorofori coniugati agli anticorpi e ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale.
    NOTA: Quando si progetta un pannello di citometria a flusso multicolore, è necessario tenere conto di diverse considerazioni fondamentali. In primo luogo, è essenziale familiarizzare con la configurazione dello strumento in uso, compresi i laser e i filtri, prima dell'inizio. In secondo luogo, utilizzare marcature fluorofore luminose sugli anticorpi per antigeni a bassa abbondanza, optando per marcature fluorofore deboli su anticorpi mirati ad antigeni altamente espressi. Infine, è imperativo includere un colorante per la vitalità cellulare nel pannello per escludere efficacemente le cellule e i detriti non vitali dai dati. In particolare, per garantire un adeguato gating di antigeni a bassa abbondanza o scarsamente caratterizzati, dovrebbero essere utilizzati controlli a fluorescenza meno uno (FMO)15. I controlli FMO comprendono tutti i marcatori di lignaggio ad eccezione di quello di interesse, facilitando una delineazione precisa tra cellule colorate positivamente e negativamente16.
  2. Regolare le impostazioni dei rilevatori di diffusione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) per garantire che le celle di interesse siano visualizzate in modo appropriato sulla scala e possano essere controllate secondo necessità.
  3. Regolate meticolosamente FSC e SSC per eliminare detriti o rumori estranei. Differenzia i doppietti dalle singole celle all'interno di un grafico a punti che illustra sia l'area che l'altezza dell'FSC. Isolare le cellule vitali in base al segnale negativo del colorante di fluorescenza della vitalità cellulare.
    NOTA: Le impostazioni dei vari strumenti possono presentare lievi variazioni. Ad esempio, alcuni selezionatori cellulari utilizzano la larghezza e l'altezza dell'FSC per distinguere i doppietti dalle singole cellule, mentre altri utilizzano l'area e l'altezza dell'FSC per lo stesso scopo.
  4. Regolare la compensazione per ciascun canale.
    NOTA: Sia i campioni cellulari che le perle di compensazione disponibili in commercio possono essere impiegati ai fini della compensazione dello spillover fluorescente.
    1. Confrontare il controllo dell'autofluorescenza (cellule non colorate) con i controlli positivi delle cellule colorate per garantire che le cellule colorate siano scalate in modo appropriato per ciascun parametro. Inoltre, è possibile ottimizzare la compensazione analizzando campioni di cellule multicolore, monitorando i grafici a punti a 2 colori e regolando le impostazioni di compensazione verso l'alto o verso il basso per garantire che le popolazioni cellulari siano allineate verticalmente o orizzontalmente l'una con l'altra.
    2. Utilizza i segnali CD45 e CD11b per distinguere tra linfociti (CD11b-CD45high), microglia (CD11b+CD45int), cellule mieloidi (CD11b+CD45high) e astrociti (CD11b-CD45- GLAST+)17,18.
    3. Utilizzare il tessuto cerebrale fittizio come controllo dell'autofluorescenza e come riferimento per i linfociti discriminanti. Se un bersaglio specifico è in esame, utilizzare un controllo FMO con tessuto cerebrale post-ictus.
  5. Iniziare la raccolta dei dati di controllo e di esempio e assicurarsi che vengano salvati.
    NOTA: Dato che il modello di mini-ictus qui descritto si traduce in un piccolo infarto, in genere vengono raccolte meno cellule rispetto al modello di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO). Generalmente, la raccolta di 5 × 105 cellule produce rispettivamente circa 5 × 103 microglia e 1 × 105 astrociti.
  6. Selezionare e suddividere le popolazioni cellulari desiderate in provette da 5 mL di polistirene a fondo tondo o provette da centrifuga coniche da 15 mL.
    NOTA: Aggiungere 500 μl di PBS e sciacquare meticolosamente la provetta per garantire la vitalità delle cellule e favorire la formazione del pellet cellulare.

6. Analisi dell'espressione genica in popolazioni cellulari selezionate

NOTA: L'estrazione dell'RNA totale può essere condotta in alternativa utilizzando kit commerciali seguendo le linee guida del produttore.

  1. Centrifugare le cellule dal punto 5.6 a 500 × g a 4 °C per 3 minuti, quindi eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di reagente TRIzol.
    NOTA: Il numero di cellule selezionate è notevolmente inferiore rispetto alle cellule o ai tessuti in coltura. Di conseguenza, una maggiore velocità di centrifugazione può aiutare a formare un pellet cellulare più compatto. Le cellule ottenute da questa fase possono essere utilizzate per applicazioni successive, come colture cellulari o pipeline di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
  2. Lasciare riposare il campione a RT per 5 minuti per facilitare la dissociazione dei complessi nucleoproteici.
  3. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio al campione e fissare la provetta. Agitare energicamente le provette per 15 s, quindi incubare per 2 minuti a RT.
  4. Centrifugare i campioni a 10.000 g per 15 minuti a 4 °C. L'RNA rimarrà esclusivamente nella fase acquosa superiore.
  5. Trasferire con cautela la fase acquosa superiore in una provetta pulita, facendo attenzione a non disturbare l'interfaccia.
    NOTA: Il volume della fase acquosa deve essere di circa 500 μL.
  6. Precipitare l'RNA dalla fase acquosa introducendo 0,5 mL di isopropanolo e mescolando delicatamente capovolgendo più volte la provetta. Incubare i campioni a RT per 10 minuti.
  7. Centrifugare i campioni a 10.000 g per 10 minuti a 4 °C per raccogliere l'RNA.
  8. Decantare il surnatante e rimuovere accuratamente il liquido residuo mediante aspirazione.
  9. Lavare una volta il pellet di RNA con etanolo al 75%, aggiungendo un minimo di 1 mL di etanolo al 75%. Miscelare accuratamente il campione, quindi centrifugare a 7500 × g per 5 minuti a 4 °C.
  10. Elimina ogni traccia di etanolo. Asciugare all'aria il pellet di RNA per 5 minuti.
  11. Sciogliere l'RNA in 10 μL di acqua priva di RNasi pipettando su e giù.
  12. Procedere all'esecuzione della PCR in tempo reale secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

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In questo studio, presentiamo un protocollo raffinato per valutare la funzionalità delle cellule immunitarie dopo ictus ischemico, impiegando l'analisi citofluorimetrica all'interno di un modello di mini-ictus. Il mini-ictus è stato indotto dalla legatura permanente del ramo distale dell'arteria cerebrale media destra (MCA), seguita da un'occlusione di 7 minuti delle arterie carotidi comuni bilaterali (CCA). Questa metodologia produce un ictus lieve caratterizzato da volumi di lesione piccoli e costanti e un tasso di mor...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per valutare la funzione delle cellule immunitarie dopo ictus ischemico, utilizzando l'analisi citofluorimetrica in un modello di mini-ictus. Le fasi critiche di questo protocollo includono l'instaurazione di un ictus ischemico focale attraverso la legatura permanente del ramo distale dell'arteria cerebrale media destra (MCA) insieme a un'occlusione di sette minuti delle arterie carotidi comuni bilaterali (CCA). Questo approccio chi...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82201622) e dalla Natural Science Foundation of Inner Mongolia (n. 2020MS03017).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLNIDO615601Materiale di laboratorio
1&volte; PBSCorning21-040-CMReagente
Micropiastra a 96 pozzetti con fondo rotondo trasparente trattata TCCorning3799Materiale di laboratorio
APC anti-topo CD19Bioleggenda152410Anticorpo
APC/Cyanine7 anti-topo CD45Bioleggenda103116Anticorpo
Avertina (1,25%)Nanjing Aibei Biotecnologia Motore M2920Reagente
BD FACSAria IIBD642510Attrezzatura
Brilliant Violet 421 anti-topo CD4Bioleggenda100437Anticorpo
Brilliant Violet 605 anti-topo / umano CD11bBioleggenda101237Anticorpo
BSASigma-AldrichA1933-1GChimico
Collagenasi IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzima
DNasi IBiolaboratori del New EnglandCodice: M0303LEnzima
EDTASigma-AldrichEDS-100GChimico
Falcon 5 mL Provette in Polistirene a Fondo Tondo FalconCorning352052Materiale di laboratorio
Falco Provette da centrifuga coniche da 15 mLCorning352095Materiale di laboratorio
Flusso Jo V10BDSoftware
Anticorpo GLAST (ACSA-1), PEMiltenyi Biotec130-118-344Anticorpo
IsofluranoRWD Scienze della VitaR510-22-10Reagente
PE/Cyanine7 anti-topo CD3Bioleggenda100220Anticorpo
PE/Dazzle 594 anti-topo NK-1.1Bioleggenda156518Anticorpo
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific Inc.15596026Reagente
Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasiThermo Fisher Scientific Inc.10977015Reagente
Adesivi tissutali Vetbond3MCodice: 1469SBMateriale di laboratorio
Kit di viabilità riparabile Zombie AquaBioleggenda423102Colorante fluorescente reattivo all'ammina

Riferimenti

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