Articolo metodologico

Esplorazione degli eventi cellulari sequenziali della fagocitosi innescata da Godanti Bhasma nelle cellule di mammifero

DOI:

10.3791/68321

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11 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio chiarisce l'elaborazione fagocitaria delle particelle Godanti Bhasma (GB) nelle cellule di mammifero, caratterizzandone l'assorbimento cellulare, la dinamica del vacuolo, l'acidificazione e la degradazione. Questi risultati non solo migliorano la nostra comprensione dei meccanismi fondamentali della fagocitosi, ma stabiliscono anche la GB come un promettente sistema modello per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Abstract

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La fagocitosi è un meccanismo cellulare vitale attraverso il quale le cellule inghiottono e degradano particelle estranee, agenti patogeni o detriti, svolgendo un ruolo chiave nella difesa immunitaria e nel mantenimento dell'omeostasi tissutale. Le interruzioni di questo processo sono associate a varie malattie. Per esplorare gli eventi complessi coinvolti nella via della fagocitosi, sono essenziali particelle intelligenti avanzate e tecniche di monitoraggio efficaci. Godanti Bhasma (GB), una medicina tradizionale indiana composta da particelle bioattive di solfato di calcio, viene rapidamente internalizzato mediante fagocitosi nelle cellule di mammifero, inducendo una significativa vacuolizzazione citoplasmatica. Le fasi chiave della fagocitosi indotta da GB sono state valutate utilizzando la citometria a flusso (FC), l'imaging su cellule vive e tecniche di colorazione specifiche. L'analisi citofluorimetrica ha dimostrato la formazione di strutture fagocitiche a forma di coppa associate all'internalizzazione delle particelle. L'imaging di cellule vive ha consentito l'osservazione in tempo reale dei processi fagocitici, tra cui l'assorbimento di particelle, la formazione di vacuoli, la degradazione dei materiali inghiottiti e il turnover vacuolare. La colorazione con rosso neutro e arancio acridino è stata impiegata per valutare l'acidificazione vacuolare. È interessante notare che il trattamento con l'inibitore lisosomiale BFA1 in cellule trattate con GB non ha portato a vacuolizzazione, come evidenziato dalla mancanza di captazione di rosso neutro, sottolineando la necessità di un ambiente acido per la vacuolizzazione. Questi risultati sottolineano il potenziale della fagocitosi indotta da GB come modello per chiarire gli eventi cellulari sequenziali coinvolti in questo processo, che è fondamentale per comprendere le interazioni ospite-patogeno, il traffico intracellulare e lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative per i disturbi correlati alla fagocitosi.

Introduzione

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La fagocitosi è un processo cellulare essenziale svolto dai fagociti professionali residenti nei tessuti, come i macrofagi e le cellule dendritiche, così come dai fagociti non professionali, come le cellule epiteliali e i fibroblasti, che inghiottono e degradano le particelle estranee. Queste cellule internalizzano ed eliminano particelle estranee, agenti patogeni o detriti cellulari, contribuendo in modo significativo alla difesa immunitaria e all'omeostasi dei tessuti1. Questo processo inizia con il riconoscimento di agenti patogeni, detriti o particelle attraverso i recettori di riconoscimento dei modelli (PRR), come i recettori Toll-like (TLR), che si legano ai modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP)2. Questo riconoscimento innesca la formazione di una coppa fagocitica, in cui le sporgenze della membrana plasmatica si estendono attorno alla particella bersaglio3. I filamenti di actina svolgono un ruolo cruciale in questa fase, guidando il rimodellamento della membrana necessario per l'inghiottimento delle particelle4. Una volta che la particella è racchiusa in un fagosoma, si forma una vescicola legata alla membrana. Il fagosoma subisce una maturazione, caratterizzata dalla fusione con endosomi precoci e poi tardivi, seguita dall'incorporazione di lisosomi contenenti enzimi idrolitici5. Questi enzimi, come le catepsine, il lisozima e le nucleasi, sono attivati dall'acidificazione all'interno del fagosoma, ottenuta dall'ATPasi vacuolare (V-ATPasi), abbassando il pH a 4,5-5,5. Il processo degradativo si conclude con l'esocitosi dei resti dalla cellula. Le disfunzioni in questo processo dinamico e complesso possono portare a sfide immunitarie significative 6,7,8.

Per valutare con precisione il complesso processo cellulare della fagocitosi, sono necessari metodi migliori e semplici per il monitoraggio dei principali eventi cellulari della fagocitosi. Tradizionalmente, il metodo di monitoraggio per la quantificazione della fagocitosi prevede tecniche come il fissaggio dei fagociti a intervalli di tempo predeterminati per la visualizzazione microscopica, la misurazione dell'internalizzazione di bersagli marcati con colorante attraverso l'imaging o la citometria a flusso o il conteggio del numero di cellule bersaglio rimanenti dopo una determinata durata di fagocitosi, tuttavia, questi metodi non catturano le fluttuazioni minuto per minuto che si verificano durante il processo di fagocitosi9. Inoltre, i metodi che si basano su indicatori indiretti come l'assorbimento del colorante potrebbero non riflettere accuratamente gli eventi fagocitici effettivi a causa del potenziale trasferimento passivo del colorante10.

I recenti progressi nell'imaging di cellule vive, nella citometria a flusso e nelle tecniche di colorazione hanno rivoluzionato la nostra capacità di monitorare la fagocitosi con un'elevata precisione spaziotemporale. L'imaging su cellule vive, ad esempio, consente l'osservazione continua di processi dinamici con il monitoraggio sequenziale degli eventi11. La citometria a flusso è ampiamente utilizzata per analizzare le cellule di mammifero e rilevare biomarcatori nella ricerca clinica12. Tuttavia, i metodi FC tradizionali non sono attrezzati per valutare le caratteristiche morfologiche e spaziali delle singole cellule12. La citometria a flusso (IFC) rappresenta un'alternativa robusta che consente la raccolta di informazioni dettagliate da singole cellule. L'IFC combina le capacità analitiche della citometria a flusso con l'imaging ad alta risoluzione, consentendo l'analisi di singole cellule con dettagli morfologici e spaziali. Varie particelle, tra cui perle di lattice fluorescenti, zimosan-APC e nanoparticelle sintetiche, sono comunemente usate per studiare la fagocitosi, fornendo informazioni sul coinvolgimento dei recettori, sulla formazione dei fagosomi e sulle risposte immunitarie12.

A differenza delle tecniche biochimiche convenzionali, che in genere si basano sull'analisi degli endpoint, l'imaging su cellule vive fornisce un monitoraggio continuo e dinamico dei processi cellulari. Questo metodo offre un'elevata risoluzione spazio-temporale e la capacità di osservare eventi sequenziali in fagocitosi. Di conseguenza, è un potente strumento per studiare il complesso processo di fagocitosi, consentendo approfondimenti più accurati e dettagliati sui comportamenti e sui meccanismi cellulari13.

Oltre ai progressi nei sistemi di imaging, c'è bisogno di particelle fagocitiche intelligenti in grado di evidenziare distintamente gli eventi fagocitici, in particolare le fasi di degradazione che si verificano all'interno del fagosoma. Gli studi di fagocitosi utilizzano spesso particelle come perle di lattice, zimosoni, batteri, cellule apoptotiche e nanoparticelle sintetiche per esplorare meccanismi come l'impegno dei recettori, la formazione dei fagosomi e le risposte immunitarie. Sebbene queste particelle forniscano informazioni preziose, hanno dei limiti nel tracciare l'intero processo di degradazione o nel valutare direttamente la maturazione dei fagosomi. Ad esempio, le perle di lattice non sono biodegradabili e non possono dimostrare degradazione, mentre lo zimoso e i batteri spesso richiedono un'etichettatura complessa e potrebbero non produrre profili di degradazione coerenti14,15.

Il nostro studio precedente ha dimostrato l'utilità del GB, una formulazione ayurvedica tradizionale composta principalmente da solfato di calcio, come particella ideale per studiare la maturazione e la degradazione dei fagosomi16. Il GB si dissolve nel tempo all'interno dell'ambiente acido del fagosoma, consentendo una chiara visualizzazione della degradazione delle particelle. Inoltre, la capacità del GB di indurre una robusta formazione di vacuolo facilita lo studio di fasi distinte della maturazione dei fagosomi, dalla formazione precoce all'acidificazione e alla risoluzione finale. A differenza di altre particelle, GB elimina la necessità di marcatura esterna, fornendo un sistema autosufficiente per studiare l'intero ciclo di vita dei fagosomi, rendendolo un modello ideale per comprendere le dinamiche della fagocitosi e dei disturbi associati16.

Questo studio presenta un protocollo standardizzato e riproducibile progettato per valutare la fagocitosi indotta da particelle e la formazione di vacuolo utilizzando Godanti Bhasma (GB) in linee cellulari fagocitiche sia professionali (RAW 264.7) che non professionali (HeLa e 3T3-L1). L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una solida piattaforma per lo studio dei meccanismi di assorbimento cellulare, della biogenesi vacuolare e dell'elaborazione intracellulare delle particelle in diversi tipi di cellule. Il GB è stato sospeso in DMEM a una concentrazione di 10 mg/mL e, per garantire l'uniformità, le particelle più grandi sono state lasciate depositare mentre la frazione superiore è stata raccolta per uso sperimentale. Per i saggi di citometria a flusso, le cellule sono state seminate a una densità di 2 x 105 cellule per pozzetto in piastre a 12 pozzetti e sono stati aggiunti 300 μl della sospensione di lavoro GB a ciascun pozzetto. Per le analisi basate sull'imaging, sono state seminate 5.000-10.000 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti o su vetrini da camera. Questo metodo stabilisce GB come un modello affidabile per studiare la formazione di vacuolo e l'internalizzazione di particelle in diversi tipi cellulari.

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Protocollo

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1. Coltura cellulare e semina

  1. Preparare un terreno DMEM completo integrato con FBS inattivato al calore al 10% e antibiotici (100 μg/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina). Sterilizzare tutti i reagenti e le attrezzature prima dell'uso.
  2. Coltura delle cellule 3T3-L1, HeLa e RAW 264.7 in fiasche da 25 cm2 e piastre di coltura da 35 mm utilizzando DMEM. Mantenere le colture a 37 °C in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 e sostituire il terreno ogni 48 ore.
  3. Per la subcoltura, lavare le cellule 2 volte con PBS, quindi staccare le cellule aderenti utilizzando 500 μL di tripsina-EDTA e incubare per 5 minuti. Aggiungere 1 mL di DMEM per neutralizzare la soluzione di tripsina-EDTA, pipettare per creare una sospensione a singola cellula e regolare il volume a 10 mL con DMEM fresco. Centrifugare a 300 x g per 5 min, risospendere il pellet in 1 mL di terreno fresco.
  4. Miscelare 10 μL di sospensione cellulare con blu di tripano allo 0,4% (1:1), contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro, calcolare la densità come cellule/mL = conta media x 104 x 2.
  5. Per piastre da 96 pozzetti: erogare 100 μl della sospensione cellulare (contenente 10.000 cellule) in ciascun pozzetto. Per i vetrini di cavità, seminare 50 μl della sospensione cellulare (contenente 5000 cellule) in due cavità, lasciando vuota la cavità centrale. Aggiungere 50 μl di DMEM a ciascuna delle cavità seminate.
  6. Incubare le piastre e i vetrini a 37 °C in una CO2 al 5% per 24 ore per consentire l'adesione e la stabilizzazione delle cellule. Ispeziona le cellule al microscopio invertito con un ingrandimento di 20x per valutare la morfologia, la confluenza e la contaminazione prima di procedere con gli esperimenti.

2. Preparazione della soluzione madre GB per colture cellulari

  1. Procurati GB e pesa con precisione 100 mg di polvere. Sospendi la polvere in 10 ml di DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Agitare la sospensione e lasciarla riposare per 1 minuto per consentire alle particelle più grandi di depositarsi. Quindi, trasferire i 5 mL superiori della sospensione in una provetta da centrifuga sterile.
  3. Designare questa sospensione GB preparata da 5 mL come soluzione madre per i successivi esperimenti di coltura cellulare. Agitare accuratamente la sospensione per garantire una dispersione uniforme delle particelle prima di aggiungerla alle celle.

3. Analisi di citometria a flusso

  1. Raccogliere cellule RAW 264.7, HeLa o 3T3-L1 mediante tripsinizzazione, neutralizzare con DMEM completo, centrifugare a 300 x g per 5 minuti, risospendere in 1 mL di terreno fresco, miscelare 10 μL con tripan blu allo 0,4% (1:1), contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro, calcolare la densità e regolare a 2 x 105 cellule/mL.
  2. Seminare 2 x 105 cellule per pozzetto in una piastra da 12 pozzetti e coltura per 24 ore. Incubare a 37 °C con CO2 al 5%.
  3. Trattare le cellule con sospensione GB (300 μL per pozzetto) per varie durate: 30 min, 1 h e 12 h. Dopo il trattamento, lavare le cellule 5 volte con PBS per rimuovere le particelle in eccesso.
  4. Tripsinizzare le cellule come al punto 1.3 e lavarle accuratamente con PBS. Caricare la sospensione preparata nella porta del campione del citometro a flusso. Avviare il software e selezionare le impostazioni di acquisizione appropriate. Scegli la modalità Campo chiaro per l'imaging.
  5. Avviare l'acquisizione dei dati facendo clic su Esegui nel software. Acquisisci dati per almeno 10.000 eventi mentre il sistema acquisisce immagini delle singole cellule che passano attraverso la cella di flusso.
  6. Usa i grafici a dispersione dell'area rispetto al rapporto d'aspetto per controllare singole celle intatte. In questo modo è possibile escludere doppietti e cluster. Visualizza le immagini corrispondenti nella libreria di immagini. Raccogli le immagini delle singole cellule dalla libreria di immagini del software per studiare i cambiamenti morfologici indotti dal trattamento.
  7. Per l'analisi delle particelle, seminare 2 x 105 cellule per pozzetto in piastre da 12 pozzetti e coltivare per 24 ore. Trattare le cellule con sospensione GB (300 μL per pozzetto) per durate diverse: 1 h, 7 h, 14 h e 24 h.
  8. Dopo il trattamento, agitare delicatamente la piastra di coltura per 1 minuto e raccogliere il terreno di coltura in provette da 1,5 mL. Lavare le cellule 5 volte con PBS per rimuovere eventuali particelle extracellulari.
  9. Aggiungere 500 μl di tampone RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100; 1% sodio desossicolato) per lisare completamente le cellule.
  10. Far scorrere separatamente il terreno di coltura e i campioni di cellule lisate contenenti particelle attraverso il citometro a flusso. Caricare i campioni nella porta di campionamento del sistema. Avviare il software e selezionare le impostazioni di acquisizione appropriate. Scegli la modalità Campo chiaro per l'analisi delle particelle.
  11. Avviare l'acquisizione dei dati facendo clic su Esegui nel software. Acquisisci dati per almeno 20.000 eventi mentre il sistema acquisisce immagini di singole particelle che passano attraverso la cella di flusso.
  12. Usa i grafici a dispersione dell'area rispetto al rapporto d'aspetto per controllare tutte le particelle. Utilizzare gli strumenti del grafico a dispersione per analizzare il conteggio delle particelle.

4. Microscopia time-lapse

  1. Coltura di cellule 3T3-L1 (3,0 x 104) in una piastra da 35 mm con 2 mL di DMEM a 37 °C in una CO2 al 5% fino a raggiungere la confluenza del 70%.
  2. Miscelare accuratamente 300 μl di sospensione di GB nel terreno di coltura fresco preriscaldato da 2 mL, quindi posizionare il piatto di coltura con le cellule e il GB sul tavolino del microscopio per immagini.
  3. Seleziona l'obiettivo 10x. Attivare l'illuminazione in campo chiaro utilizzando il pulsante Bright. Fare clic sul pulsante Filmato per accedere alla modalità time-lapse. Impostare l'intervallo di tempo su 5 min. Avvia la registrazione facendo clic sul pulsante Rec .
  4. Acquisisci immagini a intervalli di 5 minuti per un periodo compreso tra 16 e 24 ore, garantendo immagini continue in condizioni standard in un incubatore a CO2 .
  5. Utilizzare il software ImageJ per compilare le immagini acquisite in un video time-lapse. Questa tecnica consente la differenziazione di vari stadi della fagocitosi, dall'internalizzazione alla completa degradazione delle particelle.

5. Colorazione rossa neutra

  1. Dopo 24 ore di crescita cellulare in piastre a 96 pozzetti e vetrini a cavità, miscelare accuratamente la sospensione di particelle GB e aggiungere 30 μl di sospensione a ciascun pozzetto o cavità.
  2. Incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 24 ore per indurre la formazione di vacuoli. Utilizzare pozzetti o cavità non trattati come controlli negativi.
  3. Per la colorazione con rosso neutro (NR), preparare una soluzione NR da 0,5 mg/mL in DMEM privo di siero e filtrarla con un filtro da 0,2 μm.
  4. Per l'imaging dei vacuoli in piastre a 96 pozzetti e vetrini per cavità: rimuovere il terreno, aggiungere 60 μl di colorante NR e incubare a 37 °C per 15 minuti. Lavare 3 volte con PBS per rimuovere il colorante in eccesso e quindi procedere con l'imaging microscopico.
  5. Esamina i vacuoli al microscopio utilizzando l'obiettivo 20x, per valutare le dimensioni, la morfologia e il numero di vacuoli.

6. Trattamento con Bafilomicina A1 per la formazione di vacuole e l'inibizione dell'acidificazione

  1. Preparare una soluzione madre di Bafilomicina A1 (BFA1) a una concentrazione di 100 μg/mL (160,5 nM) sciogliendo 100 μg di BFA in 50 μL di DMSO, seguita da diluizione in 950 μL di DMEM. Diluire 1 μL di questo stock in 1,6 mL di DMEM per ottenere una soluzione di lavoro di 0,1 nM.
  2. Miscelare accuratamente e aggiungere 100 μl della soluzione BFA di lavoro ai pozzetti contenenti le cellule nelle piastre a 96 pozzetti. Inoltre, aggiungere 30 μl di sospensione di particelle GB per valutare l'inibizione della formazione di vacuolo e fagosomi.
  3. Per inibire l'acidificazione dei fagosomi, aggiungere 100 μL della soluzione BFA di lavoro a pozzetti con vacuoli preformati (precedentemente trattati con particelle di GB). Incubare tutti i pozzetti a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore.
  4. Aggiungere 60 μl di colorante rosso neutro (NR) a ciascun pozzetto, incubare per altri 15 minuti e analizzare la formazione e l'acidificazione del vacuolo.

7. Colorazione arancione acridina (AO)

  1. Trattare le cellule coltivate in vetrini di cavità con 50 μL di GB e incubare per una notte in condizioni sperimentali standard.
  2. Dopo il trattamento, incubare le cellule con una soluzione di arancia acridina (1 mg/mL) per 15 minuti a 37 °C per consentire la colorazione selettiva dei vacuoli e degli organelli vescicolari acidi.
  3. Lavare le cellule 3 volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS) per rimuovere il colorante non legato e ridurre al minimo la fluorescenza di fondo.
  4. Analizza rapidamente i vetrini con un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 20x e un intervallo del filtro di eccitazione blu di 450-492 nm, per valutare la morfologia cellulare e l'assorbimento dell'arancio acridino, che fornirà informazioni sulla dinamica vacuolare.

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Risultati

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Lo studio evidenzia le risposte cellulari chiave alle particelle di GB nelle cellule di mammifero. Abbiamo utilizzato un citometro a flusso per imaging per studiare l'internalizzazione delle particelle GB nelle cellule 3T3-L1 (Figura 1). Le cellule sono state esposte a particelle per durate comprese tra 30 minuti e 12 ore. Dopo 30 minuti, abbiamo osservato le particelle sulla superficie cellulare (Figura 1B) e la membrana cellulare ha iniziato a ripiegarsi verso...

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Discussione

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La fagocitosi funge da meccanismo di difesa immunitaria cruciale, consentendo l'inghiottimento e la successiva eliminazione di particelle, agenti patogeni e cellule apoptotiche. Per comprendere i processi di formazione e maturazione dei fagosomi, le particelle biocompatibili intelligenti combinate con tecniche di imaging avanzate sono essenziali per studiare eventi dinamici come la progressione vacuolare, l'acidificazione e la degradazione dei materiali inghiottiti18,19...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata dal Science & Engineering Research Board (SERB) Core Research Grant (CRG/2022/009045), Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Governo dell'India.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
25 cm2 Fiasche di colturaNEST, India707001
Piastre a 96 e 6 pozzettiTarsons India Pvt. Ltd., Calcutta, India; Thermo Scientific, India980040; 140675
Arancio acridinaSRL, India82407
Antibiotici e soluzione di tripsina-EDTAHigh Media, India628242; 655111
Linee cellulari - HeLa, 3T3-L1 e RAW-264.7Centro nazionale per la scienza cellulare (NCCS), Pune, Maharastra
piatti di coltura (35 mm) SPL Lifesciences, India101350
Dulbecco' s Eagle medium modificato (DMEM)MP Biomedicles, India1033126
Siero fetale bovino (FBS)High Media, India651257
Citometro a flussoMillipore, Stati UnitiAmnisAmnis Citometri a flusso per immagini,
Microscopio a fluorescenzaDiGi Lab, IndiaModello: DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurveda240002
Colorante rosso neutroCDH, India593630
Microscopio time lapseNanoEnTek Inc. Seoul, Corea.JuliAnalizzatore di cellule fluorescenti intelligente JuLi,
Microscopio time lapseLEEDZ MICRO IMA. Regno UnitoS.No. LIM225552358A58EA PRIME Microscopio invertito

Riferimenti

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