Articolo metodologico

L'RNA-Seq rivela la via di differenziazione delle cellule Th17 come meccanismo di lesione cerebrale indotta da radiazioni

561 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

20 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo studio mira a studiare l'attivazione della via di differenziazione delle cellule Th17 nei topi con lesione cerebrale indotta da radiazioni.

Abstract

La radioterapia è una modalità terapeutica prevalente per le neoplasie maligne della testa e del collo; tuttavia, provoca invariabilmente danni indotti dalle radiazioni al normale tessuto cerebrale, che culminano in lesioni cerebrali indotte da radiazioni (RBI). Nonostante le ricerche approfondite sulla neuroinfiammazione indotta dalle radiazioni, l'associazione tra RBI e la via di differenziazione delle cellule Th17 rimane inadeguatamente compresa. I topi C57BL/6 sono stati sottoposti a una singola somministrazione di irradiazione cranica da 30 Gy per sviluppare il modello RBI. La funzione cognitiva è stata valutata attraverso il labirinto d'acqua di Morris (MWM), il test in campo aperto, il test di riconoscimento di nuovi oggetti e il test rotarod. Le alterazioni istopatologiche nel tessuto cerebrale sono state analizzate utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E). La colorazione in immunofluorescenza è stata impiegata per valutare l'attivazione della microglia (IBA-1) e degli astrociti (GFAP). Il sequenziamento dell'RNA è stato condotto per identificare i geni differenzialmente espressi, mentre Simple Western e qPCR sono stati utilizzati per esaminare le molecole chiave di segnalazione coinvolte nel differenziamento delle cellule Th17. I topi RBI hanno dimostrato marcati deficit cognitivi, in particolare nell'apprendimento spaziale e nella conservazione della memoria. L'esame istologico ha indicato l'attivazione della microglia e degli astrociti all'interno della corteccia e dell'ippocampo dei topi irradiati. L'analisi del sequenziamento dell'RNA ha identificato un arricchimento significativo della via di differenziazione delle cellule Th17 nella corteccia del gruppo RBI. Un'ulteriore validazione attraverso analisi Simple Western e qPCR ha confermato l'upregolazione di TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 e P-STAT3 nella corteccia dei topi RBI. Questi risultati hanno suggerito che la via di differenziazione delle cellule Th17 ha svolto un ruolo fondamentale nella patogenesi delle lesioni cerebrali indotte da radiazioni. La neuroinfiammazione mediata dalle cellule Th17 può essere un meccanismo critico alla base della disfunzione cognitiva indotta dalle radiazioni.

Introduzione

La radioterapia è un trattamento cruciale sia per i tumori primari che per quelli metastatici della testa e del collo, ma la lesione cerebrale indotta da radiazioni (RBI) può verificarsi come una grave complicanza, caratterizzata da danno al sistema nervoso centrale. L'incidenza di RBI varia in base al tipo di tumore e alla modalità di trattamento, con tassi riportati che variano dal 28% al 50% dopo radioterapia stereotassica per i meningiomi1, dall'1,9% al 5% per il carcinoma nasofaringeo 2,3, dall'1% al 24% per i gliomi di basso grado 4,5 e dall'8% al 20% per le metastasi cerebrali 6,7. L'RBI è classificato in tipi acuti, ritardati precocemente e ritardati tardivamente, con disfunzione cognitiva, in particolare compromissione della memoria, e deficit di apprendimento prominenti nella forma ritardata tardiva. La disfunzione cognitiva indotta dalle radiazioni (RICD), che colpisce il 50%-90% dei sopravvissuti a lungo termine ai tumori della testa e del collo, ha un impatto significativo sulla qualitàdella vita8, ma la sua patogenesi rimane poco conosciuta e mancano strategie preventive e terapeutiche efficaci.

La neuroinfiammazione è una caratteristica patologica chiave dell'RBI, che esacerba l'interruzione della barriera emato-encefalica e ostacola la neurogenesi nell'ippocampo. Le cellule Th17, un sottogruppo di cellule T CD4+ note per la produzione della citochina pro-infiammatoria IL-179, sono state collegate a varie malattie neurodegenerative, tra cui la sclerosi multipla e il morbo di Parkinson10,11. Queste cellule, in determinate condizioni infiammatorie, possono attraversare la barriera emato-encefalica e contribuire alla neuroinfiammazione12. Dalla loro scoperta nel 2005, le cellule Th17 hanno attirato l'attenzione per il loro ruolo sia nelle risposte immunitarie contro i patogeni che nel loro coinvolgimento nelle malattie infiammatorie, rendendole un potenziale bersaglio per lo studio dei meccanismi dell'RBI e della disfunzione cognitiva correlata13.

In questo studio sono stati utilizzati solo topi maschi. L'esclusione delle femmine mirava ad evitare potenziali effetti confondenti derivanti dalle fluttuazioni neuroinfiammatorie associate al ciclo estrale, poiché i livelli di progesterone possono variare fino a dieci volte nelle diverse fasi del ciclo14. Inoltre, il nostro modello sperimentale è stato progettato per riflettere il contesto clinico della radioterapia del cancro della testa e del collo, in cui circa il 72% dei pazienti sono maschidi 15 anni. Coerentemente con ciò, la maggior parte degli studi pubblicati che indagano i meccanismi della lesione cerebrale indotta da radiazioni (RBI) hanno utilizzato roditori maschi per stabilire le caratteristiche patologiche di base16.

Sebbene siano stati impiegati vari modelli per studiare l'RBI, le metodologie tradizionali come la colorazione istopatologica e il semplice Western blotting incontrano limitazioni in termini di sensibilità, produttività e accuratezza17. Recenti progressi come il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq) e la proteomica ad alto rendimento hanno fornito informazioni più solide sui meccanismi molecolari alla base dell'RBI18. Queste tecnologie consentono una comprensione completa dei cambiamenti dell'espressione genica e delle alterazioni proteiche, fornendo dati più precisi rispetto ai metodi precedenti19. Simple Western, in particolare, è una tecnica innovativa e automatizzata che combina i vantaggi dell'elettroforesi capillare con la rilevazione delle proteine tramite chemiluminescenza, facilitando l'analisi ad alto rendimento con un volume di campione minimo e una maggiore riproducibilità20. Rispetto al Western blotting tradizionale, Simple Western elimina la necessità di trasferimento di membrana e fornisce dati quantitativi di espressione proteica, offrendo diversi vantaggi in termini di sensibilità e riproducibilità, soprattutto nella rilevazione di proteine a bassa abbondanza21,22.

Le linee guida pratiche per l'estrazione e la preparazione dell'RNA sono fondamentali per il successo di un sequenziamento e di una quantificazione di alta qualità. Per un'estrazione ottimale dell'RNA, si consiglia di utilizzare kit di isolamento dell'RNA di alta qualità e di assicurarsi che la concentrazione sia compresa tra 100 e 1000 ng/μL, con un numero di integrità dell'RNA (RIN) superiore a 7,0 per evitare la degradazione. Quando si esegue l'analisi delle proteine con Simple Western, è importante assicurarsi che i campioni proteici siano adeguatamente denaturati e caricati a una concentrazione di circa 1-5 μg per capillare. Per la convalida della qPCR, utilizzare cDNA di alta qualità sintetizzato da almeno 1 μg di RNA, garantendo condizioni di trascrizione inversa coerenti. Le insidie comuni nella preparazione dell'RNA, come la contaminazione con DNA genomico o la degradazione dell'RNA, dovrebbero essere evitate utilizzando apparecchiature prive di RNAsi ed eseguendo prontamente la separazione di fase per prevenire la degradazione dell'RNA.

Incorporando questi metodi, questo studio mira a indagare se la via di differenziazione delle cellule Th17 è attivata in modelli murini di RBI e come contribuisce alla patogenesi della disfunzione cognitiva indotta da radiazioni.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Le procedure sperimentali condotte qui sono in stretta conformità con le linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). L'approvazione è stata ottenuta dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Istituto di Radioterapia di Pechino (Approvazione n. AF/SC-08/02; Data: 25 febbraio 2024).

1. Irradiazione cranica nei topi

  1. Utilizzare un totale di 10 topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane nello studio, assegnando cinque animali al gruppo RBI e cinque al gruppo di controllo, dove il gruppo di controllo è costituito da topi di controllo in bianco che non hanno ricevuto RBI. Mantenere i topi in condizioni ambientali controllate, tra cui temperatura e umidità regolate e un ciclo luce/buio di 12 ore. Acclimatare i topi per 1 settimana prima di iniziare l'esperimento.
  2. Anestetizzare gli animali utilizzando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% a 50 mg/kg di peso corporeo. Confermare la corretta anestesia controllando l'assenza di risposta riflessiva a un forte pizzicamento della zampa. Applicare un unguento oftalmico veterinario su entrambi gli occhi subito dopo l'inizio dell'anestesia per prevenire l'essiccazione corneale.
  3. Posizionare gli animali in posizione prona utilizzando un apposito dispositivo di ritenuta in legno e coprire le aree non mirate del corpo con una piastra di schermatura in piombo (Pb) spessa 3 mm (purezza del 99,9%) per garantire un'irradiazione localizzata.
  4. Collimare il campo di irradiazione 2 x 2 cm2 con filtrazione intrinseca (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu). Allinea il campo alla linea mediana cranica con il mirino laser integrato (λ = 635 nm ± precisione di 0,5 mm) e verifica il posizionamento in tempo reale con un sistema di telecamere CMOS integrato e retroilluminazione IR. Irradiare la regione cranica con una singola dose di raggi X da 30 Gy a 1,325 Gy/min utilizzando un sistema X-RAD 320 con i seguenti parametri: 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Eseguire la calibrazione della dose settimanale utilizzando una camera di ionizzazione tracciabile posizionata all'isocentro. Mantenere i parametri del fascio a 320 kVp/12,5 mA con filtrazione HVL da 3,2 mm Cu per ottenere un tasso di dose di 1,325 Gy/min (± variazione del 3%). Verificare quotidianamente l'uniformità del fascio (> 95% all'interno del campo) utilizzando la pellicola Gafchromic EBT3.
  6. Somministrare meloxicam (1-2 mg/kg, per via sottocutanea) una volta al giorno per 3 giorni per gestire il dolore post-operatorio. Posizionare gli animali in una camera di recupero preriscaldata e monitorarli continuamente fino a quando non riacquistano la piena coscienza e possono mantenere la decubito sternale. Non lasciare gli animali incustoditi durante il periodo di recupero.
  7. Registra il peso corporeo di tutti i topi settimanalmente durante lo studio. Osservare i topi per un totale di 4 settimane, di cui 1 settimana di acclimatazione e 3 settimane dopo l'irradiazione.

2. Analisi del comportamento animale

  1. Eseguire esperimenti comportamentali 3 settimane dopo l'RBI.
  2. Labirinto d'acqua di Morris
    1. Riempire una piscina circolare (diametro: 120 cm, altezza: 50 cm) con acqua opaca (20-22 °C) utilizzando latte in polvere per oscurare la piattaforma sommersa. Posiziona una piattaforma nascosta (diametro: 10 cm) 1 cm sotto la superficie dell'acqua in un quadrante fisso.
    2. Acclimatare i topi alla sala prove per almeno 30 minuti prima delle prove. Inizia la fase di allenamento posizionando ogni topo in acqua da uno dei quattro punti di partenza selezionati pseudo-casualmente (N, S, E, W).
    3. Consenti al mouse di nuotare per un massimo di 60 s per individuare la piattaforma nascosta. Se il mouse non riesce a trovare la piattaforma entro 60 s, guidalo verso la piattaforma e lascialo rimanere lì per 15 s.
    4. Condurre quattro prove al giorno per topo con un intervallo di 15 minuti tra le prove. Asciuga accuratamente ogni topo con un asciugamano caldo tra una prova e l'altra per prevenire l'ipotermia. Continua la formazione per 5 giorni consecutivi per valutare l'acquisizione dell'apprendimento.
    5. Il giorno della prova della sonda, rimuovere la piattaforma e lasciare che il mouse nuoti liberamente per 60 secondi. Registra parametri come il tempo trascorso nel quadrante di destinazione, gli attraversamenti delle piattaforme e i percorsi di nuoto.
    6. Traccia e analizza tutte le prove utilizzando un sistema di tracciamento video automatizzato con gli sperimentatori all'oscuro dell'assegnazione di gruppo.
  3. Test in campo aperto
    1. Acclimatare i topi alla sala prove per almeno 30 minuti prima dell'esperimento. Utilizzare un apparecchio per campi aperti (50 cm x 50 cm x 40 cm) in plastica opaca. Illumina l'arena in modo uniforme (in genere 25-30 lux) per evitare ombre forti e ridurre al minimo lo stress.
    2. Pulisci l'arena con etanolo al 70% prima di testare ogni animale per eliminare i segnali di odore. Posiziona delicatamente il mouse al centro del campo aperto per iniziare il test. Consenti al mouse di esplorare liberamente l'arena per 10 minuti.
    3. Registra l'attività locomotoria e la posizione utilizzando un sistema di tracciamento automatizzato. Definite la zona centrale come il 20%-25% interno dell'area totale. Misura il tempo trascorso nella zona centrale e la distanza totale percorsa.
    4. Dopo la sessione, rimetti il mouse nella sua gabbia domestica e pulisci accuratamente l'apparato.
  4. Nuovo test di riconoscimento degli oggetti
    1. Acclimatare i topi alla sala prove per almeno 30 minuti prima dell'esperimento. Utilizzare un'arena in campo aperto (50 cm x 50 cm x 40 cm) con illuminazione uniforme (20-30 lux). Pulisci accuratamente l'arena con il 70% di etanolo tra gli animali per eliminare i segnali olfattivi.
    2. Posiziona ogni topo nell'arena vuota e lascialo esplorare liberamente per 10 minuti. Non posizionare alcun oggetto durante questa fase.
    3. Dopo 24 ore, posizionare due oggetti identici (A e A') negli angoli opposti dell'arena (ad almeno 8 cm dalle pareti). Posiziona delicatamente il mouse al centro dell'arena e lascialo esplorare per 10 minuti.
    4. Registra l'interazione con gli oggetti utilizzando un sistema video automatizzato. Definisci l'esplorazione degli oggetti come il muso del topo che si trova entro 2 cm dall'oggetto mentre è orientato verso di esso.
    5. Rimetti il topo nella sua gabbia di casa dopo la prova e pulisci l'arena e gli oggetti.
    6. Dopo un intervallo di ritenzione di 1 ora, posizionare un oggetto familiare (A) e un nuovo oggetto (B) nelle stesse posizioni. Rimetti il mouse nell'arena e lascialo esplorare per 5 minuti.
    7. Registra il tempo trascorso a esplorare ogni oggetto utilizzando gli stessi criteri di prima. Calcola l'indice di riconoscimento come:
      Indice di riconoscimento (%) = [Tempo su un nuovo oggetto / (Tempo su un nuovo + un oggetto familiare)] x 100
  5. Prova Rotarod
    1. Acclimatare i topi alla sala prove per almeno 30 minuti prima del test. Utilizzare un apparecchio rotarod motorizzato con un diametro dell'asta di ~3 cm e un'altezza di ~30 cm sopra la base.
    2. Impostare la modalità di rotazione sulla velocità di accelerazione (da 4 giri/min a 40 giri/min in 5 minuti). Pulisci la superficie dell'asta con etanolo al 70% prima di posizionare ciascun mouse.
    3. Posizionare delicatamente il mouse al centro dell'asta rotante, rivolto in avanti. Avvia la rotazione e inizia subito il cronometraggio.
    4. Registra la latenza in modo che diminuisca automaticamente dal sistema. Afferra il mouse in modo sicuro dopo la caduta per evitare lesioni. Consentire un periodo di riposo di almeno 15 minuti tra le prove per prevenire l'affaticamento.
    5. Conduci 3 prove consecutive per mouse al giorno e calcola la media della latenza come risultato finale. Assicurarsi che tutti i test siano eseguiti da sperimentatori in cieco in condizioni coerenti. Rimetti il topo nella sua gabbia di casa dopo aver testato e disinfetta accuratamente l'apparecchio.

3. Eutanasia animale e preparazione del campione

  1. Raccogliere campioni di tessuto 5 settimane dopo l'RBI.
  2. Preparare pentobarbital sodico (100 mg/kg) e una siringa sterile. Iniettare pentobarbital sodio per via intraperitoneale. Attendi che il topo smetta di respirare e che il battito cardiaco cessi, confermando la morte.
  3. Decapitare rapidamente alla giunzione occipitale e incidere agittalmente le suture craniche usando le forbici sottili, quindi sollevare con cura i lembi cranici bilaterali con una pinza curva preservando l'integrità meningea prima di recidere le connessioni neurali.
  4. Trasferire il cervello intatto in una matrice pre-raffreddata entro 60 s per la bisezione sagittale media utilizzando lame di rasoio sterili. Registrare immediatamente le dimensioni anteroposteriori (8,2 ± 0,3 mm), la larghezza mediolaterale (4,5 ± 0,2 mm) e la massa tissutale (112 ± 8 mg) con strumentazione di precisione.
  5. Sezionare i tessuti corticali e ippocampali sul ghiaccio. Congelare l'emisfero sinistro in azoto liquido per il sequenziamento dell'RNA, la qPCR e la Simple Western.
  6. Fissare l'emisfero destro con paraformaldeide al 4% (PFA) per l'istologia. Disidratare i cervelli fissi in etanolo graduato dal 70% al 100%, con ogni passaggio della durata di 30 minuti.
  7. Liberare il cervello nello xilene per 2 ore. Infiltrare i tessuti con paraffina fusa a 60°C per 4 ore. Incorporare i cervelli puliti in blocchi di paraffina e lasciarli solidificare a temperatura ambiente. Tagliare le sezioni coronali con uno spessore di 5 μm utilizzando un microtomo.

4. Colorazione con ematossilina ed eosina

  1. Deparaffinare le sezioni di tessuto immergendo i vetrini nello xilene per 5 minuti, 3x. Reidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato: 100%, 95%, 70% e acqua distillata, per 5 minuti ciascuna.
  2. Colorare le sezioni con ematossilina per 5 minuti, a seconda dell'intensità di colorazione desiderata. Sciacquare le sezioni in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti per rimuovere l'ematossilina in eccesso.
  3. Differenziare le sezioni in acido cloridrico all'1% in etanolo per alcuni secondi per ottenere il contrasto desiderato. Sciacquare nuovamente in acqua corrente per 5 minuti. Colorare le sezioni con Eosin per 1 minuto.
  4. Sciacquare brevemente le sezioni in acqua distillata. Disidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato: 70%, 95% e 100%, per 5 minuti ciascuna.
  5. Eliminare le sezioni in xilene per 5 minuti, 3 volte. Montare le sezioni con un vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio Nikon Eclipse Ni-U con obiettivo 20x.

5. Immunofluorescenza

  1. Fissare il tessuto immergendo i vetrini in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti, 3 volte, per rimuovere il PFA in eccesso.
  2. Permeabilizzare il tessuto incubando i vetrini con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Bloccare il legame aspecifico incubando i vetrini con siero normale al 5% per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Incubare con gli anticorpi primari IBA-1 e GFAP, diluiti in tampone bloccante a diluizione 1:2000, per una notte a 4 °C, a seconda delle specifiche dell'anticorpo. Lavare i vetrini in PBS per 5 minuti, 3 volte, per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
  4. Incubare con l'anticorpo secondario IgG Anti-Coniglio di capra coniugato ad Alexa Fluor 488, diluito a 1:1000 per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Lavare i vetrini in PBS per 5 minuti, 3 volte, per rimuovere l'eccesso di anticorpi secondari.
  5. Montare le diapositive con un supporto di montaggio antisbiadimento contenente DAPI. Sigillare il vetrino coprioggetti con smalto trasparente.
  6. Acquisisci immagini a fluorescenza utilizzando un sistema di microscopio confocale con un obiettivo 20x.
  7. Quantifica l'intensità della fluorescenza utilizzando ImageJ. Esegui analisi quantitative utilizzando lo strumento Analizza particelle di ImageJ con soglie dimensionali di 50-200 μm2 (microglia) e 100-500 μm2 (astrociti). Sottrarre lo sfondo utilizzando l'algoritmo Rolling Ball (raggio = 50 pixel).

6. Analisi qPCR

  1. Estrarre l'RNA totale dal tessuto utilizzando un kit di estrazione dell'RNA. Seguire il protocollo del produttore per l'omogeneizzazione, la lisi e la purificazione dell'RNA.
  2. Quantificare l'RNA estratto utilizzando uno spettrofotometro per misurare la concentrazione e valutare la purezza (rapporto A260/A280). Assicurarsi che la concentrazione di RNA sia appropriata per la sintesi del cDNA (100-500 ng/μL).
  3. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando un bioanalizzatore. Assicurarsi che l'RNA non mostri degradazione (bande taglienti per l'rRNA 18S e 28S) e abbia un numero di integrità dell'RNA (RIN) superiore a 7.
  4. Preparare una miscela di reazione da 20 μl con 1 μg di RNA, tampone di trascrizione inversa, oligo-dT, dNTP, inibitore della RNasi e trascrittasi inversa.
  5. Incubare a 42 °C per 60 minuti per sintetizzare il cDNA. Riscaldare a 85 °C per 5 minuti per inattivare la trascrittasi inversa.
  6. Combinare cDNA, master mix, primer diretto, primer inverso (Tabella 1) e acqua priva di nucleasi in una piastra PCR a 96 pozzetti. Utilizzare 2 μL di cDNA per 20 μL di reazione e garantire una concentrazione finale del primer di 200 nM. Sigillare la piastra con una pellicola adesiva ottica per evitare l'evaporazione.
GeneSequenza di innesco (5'-3', avanti/indietro)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tabella 1: primer di sequenza qPCR.

  1. Posizionare la piastra di reazione in uno strumento PCR in tempo reale e programmare il termociclatore. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 30 s.
  2. Normalizzare l'espressione dei geni bersaglio in GAPDH. Calcola i livelli di espressione relativi utilizzando il metodo ΔΔCt e presenta i dati come variazioni di piega rispetto al gruppo di controllo.

7. Analisi del sequenziamento dell'RNA

  1. Anestetizzare e sopprimere il topo seguendo i protocolli istituzionali di cura degli animali. Perfondere immediatamente con PBS freddo per rimuovere il sangue circolante.
  2. Sezionare il cervello sul ghiaccio. Isolare la corteccia cerebrale utilizzando strumenti di dissezione sterili. Ridurre al minimo il tempo di dissezione per preservare l'integrità dell'RNA.
  3. Congelare il tessuto corticale in azoto liquido. Conservare a -80 °C se l'estrazione dell'RNA non viene eseguita immediatamente.
  4. Omogeneizzare la corteccia congelata (30-50 mg) in 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA utilizzando un omogeneizzatore motorizzato fino a quando non rimangono frammenti visibili.
  5. Eseguire la separazione della fase del cloroformio. Aggiungere 200 μl di cloroformio, agitare energicamente per 15 s, incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  6. Trasferire lo strato superiore in una nuova provetta, aggiungere un volume uguale di etanolo al 70% e procedere con la purificazione dell'RNA utilizzando un kit a base di colonna di silice.
  7. Utilizzare la digestione DNasi su colonna per rimuovere il DNA genomico durante la purificazione dell'RNA. Raccogliere l'RNA totale in 30-50 μL e tenerlo in ghiaccio per un uso immediato.
  8. Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare la concentrazione e la purezza dell'RNA. Confermare il rapporto A260/A280 di ~2,0. Analizzare 1 μL di RNA su un bioanalizzatore. Assicurarsi che RIN sia maggiore di 8.0 per la sequenziazione.
  9. Utilizzare un protocollo di selezione poly(A) e un kit di preparazione della libreria a trefoli. Seguire il protocollo del produttore per generare librerie da 300-400 bp. Purifica le librerie con un kit commerciale.
  10. Utilizzare un bioanalizzatore per confermare le dimensioni del frammento e quantificare in modo equimolare con librerie di pool. Esegui il sequenziamento paired-end (2x, 150 bp) utilizzando una piattaforma Illumina.
  11. Taglia gli adattatori utilizzando Trim Galore, valuta la qualità con FastQC, allinea le letture al genoma del topo (GRCm39) utilizzando STAR e quantifica l'espressione genica con featureCounts. Identificare i geni differenzialmente espressi utilizzando DESeq2.
  12. Utilizzare l'output di DESeq2 e filtrare i DEG dei geni espressi in modo significativamente differenziale (valore p aggiustato < 0,05 e |log2FC| > 1). Eseguire l'analisi dell'arricchimento del percorso GO e KEGG utilizzando Phyper in base al test ipergeometrico. Identificare i percorsi con valore P corretto ≤ 0,05 come statisticamente significativi.

8. Semplice analisi occidentale

  1. Omogeneizzare la corteccia cerebrale del topo in tampone RIPA con inibitori della proteasi e della fosfatasi, quindi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un test BCA.
  2. Denaturare i campioni di proteine mescolandoli con un tampone per campioni e incubandoli a 95°C per 5 minuti per garantire la completa denaturazione.
  3. Caricare 3 μL di campioni di proteine denaturate nei capillari Simple Western. Assicurarsi che i campioni siano caricati correttamente per evitare traboccamenti. Posizionare i capillari nello strumento Simple Western.
  4. Incubare le proteine separate con anticorpi primari diluiti 1:50, tra cui p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 e IL-17, per 30 minuti.
  5. Lavare il sistema capillare con tampone di lavaggio per tre lavaggi di 5 minuti ciascuno per rimuovere gli anticorpi primari non legati. Aggiungere l'anticorpo secondario coniugato HRP diluito nel tampone bloccante e incubare per 30 minuti.
  6. Eseguire 3 lavaggi di 5 minuti ciascuno con tampone di lavaggio per rimuovere l'eccesso di anticorpi secondari. Esegui il programma di rilevamento sul sistema Simple Western per rilevare automaticamente le proteine utilizzando la chemiluminescenza.
  7. Analizza i dati utilizzando il software Compass for Simple Western. Quantificare l'espressione proteica confrontando le aree di picco relative nell'elettroferogramma. Normalizzare i dati alla proteina GAPDH.

9. Analisi statistica

  1. Aprire GraphPad Prism 9.0.0. software. Fare clic su File > Importa dati per il caricamento dei dati. Presentare i dati come medie ± SD. Utilizzare il test t non accoppiato per confronti tra due gruppi.
  2. Valutare la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Se la normalità viene violata (p < 0,05), applicare il test U di Mann-Whitney per i confronti tra gruppi. Se la normalità è soddisfatta (p ≥ 0,05), eseguire un test t su campioni indipendenti per valutare le differenze di gruppo.
  3. Riporta i risultati con i valori p. Considera p < 0,05 come statisticamente significativo. Utilizzare la seguente notazione: n.s. per non significativo, * per p < 0,05, ** per p < 0,005, *** per p < 0,0005 e **** per p < 0,0001.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Compromissione cognitiva nei topi RBI
Dopo l'esposizione a un'irradiazione cerebrale di 30 Gy, il peso corporeo dei topi è stato monitorato su base settimanale. La funzione cognitiva è stata valutata durante la4a settimana (Figura 1A). Le misurazioni iniziali hanno indicato che il peso corporeo dei gruppi di controllo e RBI era simile. Tuttavia, tra 1 e 3 settimane dopo l'irradiazione, il gruppo RBI ha dimostrato una significati...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
Questo protocollo prevede l'induzione di RBI nei topi, seguita da valutazioni complete della neuroinfiammazione e della via di differenziazione delle cellule Th17 (Figura 6). Un passaggio critico è l'irradiazione cranica di topi C57BL/6 con una dose di 30 Gy, un modello ben consolidato per RBI1. L'accurata calibrazione della dose mediante camere di ionizzazione garantisce...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Il sostegno a questo lavoro è stato fornito dall'Istituto di Radioterapia di Pechino

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Modulo di separazione 12-230 kDa, 8 cartucce capillari da 25ProteinSimpleSM-W004per anticorpo
anti-GAPDHSimpleWesternHRP-60004anticorpo 1:500 per anticorpo
anti-GFAPSimpleWestern Abcamab7260diluizione/anticorpo per immunofluorescenza
anticorpo anti-IBA-1Abcamab178846Diluizione/anticorpo 1:2000 per l'immunofluorescenza
anti-IL-17 Anticorpo A/FThermoMA5-23748Diluizione/anticorpo 1:10 per l'anticorpo
anti-IL-1&betaCST12242Diluizione/anticorpo 1:50 per l'anticorpo
anti-IL-6SimpleWesternDiluizione/anticorpo 1:5 per
il modulodi rilevamento anti-topo SimpleWesternAnticorpo secondario ProteinSimpleDM-002per anticorpo
anti-P-STAT3 (Try705)ThermoMA5-15193Diluizione/anticorpo 1:2 per modulo di
rilevamento anti-coniglioSimpleWestern Anticorpo secondario ProteinSimpleDM-001per
anti-ROR e gamma SimpleWestern; t anticorpoThermo14-6988-82diluizione/anticorpo 1:5 per SimpleWestern
anticorpo anti-STAT3Thermo710077 diluizione/anticorpo 1:20 per SimpleWestern
anti-TGF β-1,2,3anticorpo ThermoMA5-23795diluizione/anticorpo 1:10 per SimpleWestern
BAC testThermoA55860saggi proteici
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8per SimpleWestern
capra Anti-coniglio IgG H& LAbcamab150077Diluizione/anticorpo 1:1000 per immunofluorescenza
RNeasy KitQiagen74134Estrazione dell'RNA
SuperScript IV Sistema di sintesi del primo filamentoThermo Fisher Scientific18091050Trascrizione inversa
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
reagente TRIzolInvitrogen15596026estrazione dell'RNA
Diluizione / SimpleWestern

Riferimenti

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Sequenziamento dell RNANeuroinfiammazioneDisfunzione CognitivaAttivazione della MicrogliaAttivazione degli AstrocitiMorris Water MazeSimple WesternAnalisi qPCR
Video in arrivo

Articoli correlati