Articolo metodologico

Analisi della degenerazione e della conservazione dei fotorecettori in un modello murino di retinite pigmentosa

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DOI:

10.3791/68324

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22 luglio 2025

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1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea tecniche ottimizzate per l'analisi della degenerazione e della conservazione dei fotorecettori in un modello murino di retinite pigmentosa, tra cui la somministrazione intravitreale di farmaci, il sezionamento del criostato e l'immunofluorescenza. Il metodo garantisce l'integrità della retina e fornisce dati quantitativi sull'efficacia degli interventi terapeutici.

Abstract

Le retinopatie colpiscono centinaia di milioni di persone in tutto il mondo e sono cause significative di disabilità visiva e cecità. Tra queste malattie, la retinite pigmentosa (RP) è una malattia oculare ereditaria caratterizzata da degenerazione progressiva della retina, che colpisce circa 1,5-2 milioni di persone in tutto il mondo. Gli studi proof of concept in modelli animali di distrofie retiniche ereditarie costituiscono un'importante base di evidenza per gli studi sui meccanismi fisiopatologici della malattia, sull'efficacia e sulla sicurezza del trattamento. L'iniezione intravitreale nei topi e il sezionamento del criostato sono tecniche ampiamente utilizzate per studiare gli effetti dei farmaci nei modelli di RP, in quanto consentono una somministrazione precisa di sostanze nell'umor vitreo e la preparazione di campioni istologici di alta qualità per l'analisi dettagliata delle alterazioni retiniche. Inoltre, la conta cellulare attraverso l'immunofluorescenza utilizzando anticorpi contro la recuperina, una proteina calcio-dipendente espressa nei fotorecettori retinici, è stata recentemente impiegata per studiare i cambiamenti cellulari associati alla degenerazione retinica in modelli di RP, perché questo approccio facilita la valutazione della perdita di fotorecettori e della potenziale conservazione cellulare a seguito di interventi terapeutici. L'iniezione intravitreale è stata ottimizzata per garantire l'integrità oculare e risultati affidabili, utilizzando un ago sottile per somministrare la soluzione nella camera vitreale. Dopo un periodo predefinito per valutare gli effetti del farmaco, viene eseguita l'elaborazione istologica, con campioni sezionati a uno spessore di 10 μm utilizzando un criostato, seguita da marcatura in immunofluorescenza con anticorpi di recoverina. Infine, viene eseguita la conta cellulare per valutare se il trattamento con farmaci ha esercitato un effetto protettivo, come evidenziato dalla conservazione dei fotorecettori. Sebbene queste tecniche siano state ampiamente applicate per generare dati coerenti nella ricerca sulla retinopatia, persistono sfide per ottenere una precisa qualità di manipolazione e lavorazione dei tessuti. Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato per ottimizzare ogni fase, dall'iniezione intravitreale alla preparazione delle sezioni istologiche, garantendo risultati riproducibili e di alta qualità.

Introduzione

La vista è uno dei sensi più complessi del sistema sensoriale, essenziale per catturare gli stimoli visivi ambientali e tradurli in segnali elettrochimici, che vengono elaborati nel cervello per formare immagini. Vari fattori biologici, come l'invecchiamento, i difetti genetici e le malattie, possono compromettere la vista, influenzando in modo significativo la qualità della vita e le attività quotidiane.

L'occhio umano è costituito da tre camere primarie. Lo strato esterno, formato dalla cornea e dalla sclera, fornisce supporto strutturale al bulbo oculare. Lo strato intermedio comprende l'iride, il corpo ciliare e la coroide, con quest'ultima responsabile dell'apporto di sangue ai fotorecettori. Infine, lo strato interno comprende la retina, una struttura responsabile dell'elaborazione degli stimoli luminosi e della conversione della luce in segnali elettrici inviati al cervello per la formazione dell'immagine 1,2.

La retina neurale è composta da diversi strati cellulari, tra cui cellule specializzate come fotorecettori, cellule bipolari, cellule orizzontali, cellule amacrine e cellule ganglionari. Inoltre, la retina contiene cellule gliali come microglia, astrociti e cellule di Müller, nonché cellule epiteliali pigmentate. Quest'ultimo, situato nella porzione non neurale della retina, svolge un ruolo fondamentale nel mantenere l'integrità strutturale, la protezione e il supporto ai fotorecettori 3,4. La porzione neurale ospita cellule sensoriali e neuronali direttamente coinvolte nella cattura e nell'elaborazione della luce 5,6,7.

Essendo essenziale per la vista, la retina è spesso colpita da patologie che possono portare alla cecità. Tra queste condizioni, la retinite pigmentosa (RP) si distingue come una delle principali retinopatie ereditarie, con più di 80 geni associati alla sua eziologia 8,9. La RP è una malattia eterogenea, ereditata prevalentemente con modalità autosomica dominante o recessiva, ma può anche manifestarsi come legata all'X o dovuta a mutazioni spontanee10.

Con una prevalenza globale stimata tra 1 su 3.000 e 1 su 7.000 individui, a seconda della popolazione e della regione geografica11,12, la RP di solito si manifesta durante l'adolescenza o la prima età adulta, con sintomi iniziali come diminuzione della visione notturna e perdita del campo visivo periferico. Con il progredire della malattia, la visione centrale diventa compromessa, portando potenzialmente alla cecità totale 9,13.

Sebbene non esista ancora una cura per la RP, varie terapie in fase di sviluppo hanno dimostrato il potenziale per rallentare o invertire la progressione della malattia. Tra questi approcci ci sono le terapie genetiche, cellulari e farmacologiche, nonché i dispositivi elettronici. Per far progredire la comprensione della RP e valutare nuovi interventi, sono stati ampiamente utilizzati modelli murini di degenerazione retinica. Questi modelli, spesso indicati come rd (degenerazione retinica), sono strumenti preziosi per studiare le basi molecolari e le terapie per la RP. Tra i vari modelli utilizzati nello studio della retinite pigmentosa, il ceppo murino Pde6βrd10/rd10 (rd10) presenta una mutazione missenso nel gene che codifica per la subunità β bastoncello specifico della fosfodiesterasi14, esibendo una lenta degenerazione dei fotorecettori simile a quanto avviene nell'uomo15.

La somministrazione intravitreale di farmaci è stata ampiamente utilizzata in vari studi 16,17,18. Questo protocollo è adatto ai ricercatori che studiano gli effetti dei farmaci sulla retina, in particolare per quanto riguarda la sopravvivenza delle cellule dei fotorecettori. In questo modo, l'obiettivo primario di questo protocollo è ottimizzare la somministrazione di farmaci tramite iniezione intravitreale in un modello murino di retinite pigmentosa (RP) e valutare la sopravvivenza dei fotorecettori utilizzando l'immunofluorescenza per la recuperina, un marcatore cellulare fotorecettore. L'iniezione intravitreale consente la somministrazione localizzata del farmaco, riducendo al minimo gli effetti collaterali sistemici, aumentando la biodisponibilità retinica e riducendo gli effetti avversi in altri organi. D'altra parte, l'immunofluorescenza per la recuperina consente un'analisi specifica della sopravvivenza dei fotorecettori, fornendo uno strumento efficace per valutare l'efficacia di questa strategia terapeutica. Tuttavia, la loro applicabilità dipende da fattori quali la selezione del modello animale, la precisione dell'iniezione e la durata del trattamento, che dovrebbero essere considerati quando si adatta questo metodo ad altri contesti sperimentali.

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Protocollo

Il progetto e tutti i protocolli realizzati al suo interno seguono le linee guida per la cura degli animali del Consiglio Nazionale per il Controllo della Sperimentazione Animale e sono stati approvati dal Comitato Etico per l'Uso degli Animali (CEUA - UFF) con il numero 1464280219.

1. Animali

  1. Utilizzare il ceppo murino rd10, che subisce la degenerazione dei fotorecettori, e il ceppo C57 Black/6 (sfondo di rd10). Mantenere queste varietà sotto un ciclo luce-buio di 12 ore/12 ore, con accesso ad libitum all'acqua e al cibo.

2. Anestesia

  1. Eseguire un'iniezione intraperitoneale con un anestetico preparato alla dose di 80 mg/kg di ketamina e 8 mg/kg di xilazina, diluito in acqua distillata. La ketamina agisce come inibitore del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA), fornendo effetti analgesici, mentre la xilazina funziona come sedativo anestetico.
  2. Per l'iniezione intraperitoneale, calcolare il volume da iniettare come 10 μL x Peso (g).
  3. Trattieni il mouse per garantire un libero accesso all'addome. Pulire il quadrante inferiore destro della cavità addominale con alcol al 70%, dove l'ago deve essere inserito con lo smusso rivolto verso l'alto.
  4. Per confermare l'assenza di un riflesso del dolore, pizzica delicatamente la coda o la zampa dell'animale. Se non c'è reazione, ciò indica che l'animale è adeguatamente anestetizzato.

3. Iniezione intravitreale

  1. Con gli animali anestetizzati, esporre gli occhi e, utilizzando un microscopio stereoscopico binoculare con un ingrandimento di 10x, identificare l'area del limbus, una banda grigia tra la cornea e la sclera, dove verrà eseguita l'iniezione.
  2. Per eseguire l'iniezione, è necessaria l'assistenza di un'altra persona. Sotto un microscopio stereoscopico binoculare, una persona deve tenere l'animale e inserire l'ago, mentre l'assistente preme lo stantuffo della siringa per introdurre la sostanza nell'occhio.
  3. Per prima cosa, utilizzare una siringa ultrasottile con ago fisso (31 G x 6 mm) per effettuare una puntura nella regione del limbus, facendo attenzione a non inserire l'ago troppo in profondità; È sufficiente inserire solo metà dello smusso.
  4. Quindi, inserire la Micro Siringa portatile pre-sterilizzata (calibro 26 S senza smusso), contenente 1 μL del liquido/farmaco di interesse, nella puntura effettuata dalla siringa da insulina.
  5. Chiedere all'assistente di premere lentamente lo stantuffo della siringa, assicurandosi che l'intero volume venga somministrato per circa 30 secondi.
  6. Ripeti il processo per l'altro occhio dello stesso animale e registra l'ora.
  7. Se c'è più di un gruppo sperimentale, segnare l'orecchio dell'animale per garantire la corretta identificazione di ciascun gruppo.
  8. Utilizzare 1 goccia di soluzione 0,01 M di PBS in ciascun occhio dell'animale per evitare che si secchi.
  9. Dopo queste procedure, mettere gli animali su un termoforo, con la temperatura impostata a 37 °C, fino al risveglio. Può richiedere 1-2 ore. Monitorare continuamente gli animali mentre sono anestetizzati e, una volta svegli, rimetterli nelle loro gabbie fino al momento dell'analisi.
  10. Effettuare una sessione di formazione iniziale utilizzando un colorante visibile, come il blu di tripano, per aiutare gli operatori a perfezionare la loro tecnica di iniezione intravitreale nei topi.
    NOTA: Il colorante facilita la visualizzazione del percorso dell'ago, consentendo regolazioni precise della profondità e dell'angolo dell'iniezione, riducendo il rischio di danni alla struttura oculare e aumentando la sicurezza della procedura.

4. Eutanasia e preparazione degli occhi

  1. Dopo una determinata durata del trattamento dopo l'iniezione, sopprimere gli animali mediante inalazione di un sovradosaggio di isoflurano al 5%. Continuare l'esposizione fino ad almeno 1 minuto dopo la cessazione della respirazione. Per garantire la morte, tenere l'animale per la parte posteriore del collo e applicare una trazione decisa sulla coda fino a raggiungere la lussazione cervicale.
  2. Prima di rimuovere gli occhi, segnare il polo temporale. Applicare con cura il pennarello o l'ago/spillo caldo sulla regione temporale della sclera, assicurandosi che la marcatura sia visibile e precisa. Questo passaggio servirà come punto di riferimento per l'orientamento durante il processo di sezionamento.
  3. Successivamente, esporre gli occhi e, con un bisturi sterile e forbici per iridectomia, tagliare il tessuto circostante per separare i tessuti connettivi e muscolari ed esporre il bulbo oculare. Nei topi, sezionare attentamente i muscoli oculari, poiché ciò può essere impegnativo. Per facilitare la procedura, praticare un'incisione laterale con un bisturi sterile su entrambi gli angoli della pelle dell'occhio.
  4. Utilizzando una pinza curva a punta media, rimuovere delicatamente gli occhi dall'orbita tenendoli per il nervo ottico e fissare immediatamente il tessuto per 5 minuti in una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) a temperatura ambiente (RT).
  5. Dopo il fissaggio in soluzione di PFA, trasferire gli occhi su una lastra di vetro, utilizzando una pinza curva a punta media. Questa piastra funge da piattaforma di dissezione e garantisce che contenga un tampone fosfato a una concentrazione di 0,1 M pH 7,4.
  6. Successivamente, posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico binoculare con un ingrandimento di 10x e praticare una piccola incisione appena sopra il limbus (bordo corneale) utilizzando un bisturi. Successivamente, eseguire un taglio circonferenziale seguendo il limbus con forbici per microiridectomia per separare la cornea.
  7. Rimuovere la cornea, insieme all'iride e al cristallino, utilizzando la pinza Dumont #5. Infine, fissare nuovamente gli occhi nella soluzione di PFA al 4% per 55 minuti. Successivamente, lavare gli occhi tre volte con tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.

5. Crioconservazione e congelamento

NOTA: Il sezionamento del criostato del tessuto retinico è stato eseguito come descritto in precedenza con alcuni aggiustamenti19.

  1. Crioconservare gli occhi con un gradiente di saccarosio del 10%, 20% e 30%, diluito in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4. Immergere gli occhi in sequenza nelle soluzioni di saccarosio, iniziando con la concentrazione più bassa (10%) e aumentando gradualmente fino a quella più alta (30%). Ogni passaggio dura per il tempo necessario fino a quando gli occhi non si posano sul fondo del contenitore, indicando che è possibile utilizzare la concentrazione successiva. Nella concentrazione finale, conservare gli occhi a 4 °C per circa 12 ore.
  2. Il giorno seguente, rimuovere l'eccesso di saccarosio al 30% e riporre gli occhi in un contenitore rotondo di alluminio di 2 cm di diametro, disposto secondo i gruppi sperimentali.
    NOTA: Realizzare un contenitore di alluminio della dimensione appropriata in base al numero di gruppi sperimentali.
  3. Sotto un microscopio stereoscopico binoculare con un ingrandimento di 10x, rimuovere il saccarosio in eccesso dall'interno e intorno al bulbo oculare utilizzando una pipetta o carta da filtro, prestando la necessaria attenzione a non danneggiare la struttura del tessuto.
  4. Immergere gli occhi in un mezzo di congelamento a temperatura ottimale di taglio (OCT), facendo attenzione ad evitare la formazione di bolle all'interno o intorno agli occhi, e lasciarli per 1 ora a RT.
  5. Dopo 1 ora in OCT, posizionare gli occhi con il punto di riferimento precedentemente contrassegnato rivolto verso l'alto. Posizionare il contenitore di alluminio su una piastra di alluminio adatta all'interno di una piccola scatola di polistirolo per il congelamento.
  6. Versare con cautela l'azoto liquido sulla piastra di alluminio, attorno al contenitore di alluminio. Assicurarsi che l'azoto si diffonda uniformemente su tutta la superficie. Questo favorisce il congelamento uniforme dei tessuti. Assicurarsi che l'azoto liquido non entri in contatto diretto con gli occhi all'interno del contenitore di alluminio. Quindi, procedere con il sezionamento degli occhi utilizzando un criostato.

6. Preparazione dei vetrini

  1. Stendere la poli-L-lisina (200 μg/mL) sui vetrini con bordo smerigliato.
  2. Attendere 12 ore affinché i vetrini si asciughino e siano pronti per l'uso.

7. Sezionamento del criostato

  1. Su un criostato, posizionare il blocco congelato sulla piattaforma.
  2. Ruotare il volantino per realizzare sezioni con uno spessore di 10 μm.
  3. Regolare la posizione del blocco per assicurarsi che tutti gli occhi siano ugualmente presenti nel taglio.
  4. Continuare a tagliare fino a identificare il nervo ottico, utilizzando un microscopio a campo chiaro.
  5. Raccogliere le sezioni sui vetrini pretrattati in poli-L-lisina.
  6. Conservare i vetrini a -20 °C fino all'analisi.

8. Immunofluorescenza

NOTA: L'immunofluorescenza è stata eseguita come descritto in precedenza con alcuni aggiustamenti19,20.

  1. Incubare i vetrini ottenuti dalla sezione nel criostato con 100 μL di Triton X-100 allo 0,5% in PBS 0,01 M per 15 minuti a RT per permeabilizzare la membrana plasmatica cellulare.
  2. Lavare i vetrini due volte con 0,01 M PBS per 5 minuti ciascuno a RT per rimuovere l'eccesso di Triton X-100.
  3. Incubare con 100 μl di albumina sierica bovina (BSA) all'1% in 0,01 M PBS per 30 minuti a RT per bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici.
  4. Dopo il blocco, incubare le sezioni con 100 μL di anti-recoverina a una concentrazione di 1:1500 diluito in BSA 1% per marcare le cellule fotorecettoriali, per una notte a 4 °C (frigorifero).
  5. Il giorno successivo, incubare le sezioni con 100 μL di anticorpo secondario policlonale anti-coniglio 488 o anticorpo secondario policlonale anti-coniglio 568 1:500 diluito in BSA 1% per 2 ore a RT.
  6. Lavare le diapositive due volte con 0,01 M PBS per 5 minuti ciascuna a RT.
  7. Incubare le sezioni con 100 μL di DAPI 1 mg/mL (4',6-diamidino-2-fenilidolo) per 2-3 minuti a RT.
  8. Lavare il vetrino una volta con 0,01 M PBS per 5 minuti a RT.
  9. Infine, trattare le sezioni con un terreno di montaggio contenente 2,5 g di n-propil gallato in 40 mL di glicerolo in tampone fosfato 0,1 M pH 7,4. Fungeranno da reagente anti-sbiadimento e da mezzo di montaggio, preservando i campioni. Posizionare un vetrino coprioggetti (24 mm 50 mm) sopra i vetrini, quindi sigillare le sezioni con lo smalto per unghie. Successivamente, procedere con la visualizzazione dei campioni al microscopio.

9. Fotomicrografia al microscopio a fluorescenza

  1. Per acquisire le immagini delle cellule marcate con la tecnica dell'immunoistochimica, utilizzare un microscopio ottico a fluorescenza dotato di filtri blu, verdi e rossi. Inoltre, collegare una fotocamera per la fotomicrografia dei vetrini. Per ottenere le fotomicrografie, utilizzare un computer con il software LAS V3.7 (Leica) (software di imaging), che deve essere aperto per la visualizzazione simultanea con il microscopio.
  2. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Inizialmente, utilizzare l'obiettivo a più basso ingrandimento e il filtro blu.
  3. Regolare la messa a fuoco utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolana e fine fino a visualizzare chiaramente la retina con le cellule marcate in blu (nuclei cellulari).
  4. Selezionare l'area desiderata della retina per l'imaging. Aumentare gradualmente l'ingrandimento fino all'obiettivo 40x, regolando la messa a fuoco secondo necessità.
  5. Dopo aver regolato la messa a fuoco, tirare il perno di bypass per trasferire l'immagine del microscopio al software di imaging. Selezionare i filtri desiderati (A4 (blu), L5 (verde) e TX2 (rosso)). Regolare i seguenti parametri: Esposizione, Guadagno e Gamma, per garantire che l'immagine sia chiara e il più vicino possibile a ciò che si osserva al microscopio.
  6. Con un ingrandimento di 400×, cattura quattro campi con un'area di 113 × 113 μm, seguendo un orientamento dalla periferia al centro della retina. Assicurarsi che due di questi campi rappresentino la regione periferica e due rappresentino la regione centrale della retina.
  7. Per ottenere micrografie fotografiche a campo periferico, acquisire immagini a circa 50 μm dai bordi dell'occhio. Per le fotomicrografie a campo centrale, selezionare le aree adiacenti situate a 50 μm dal nervo ottico e acquisire le immagini. Utilizzare sia l'occhio destro che quello sinistro per le quantificazioni, ottenendo un totale di otto campi analizzati per trattamento.
  8. Dopo aver completato tutte le fotomicrografie, procedere con la quantificazione manuale delle cellule immunomarcate.

10. Quantificazione cellulare

  1. Aprire il programma ImageJ v.1.54g. All'interno del programma, fare clic su File, quindi su Apri e selezionare l'immagine salvata sul computer.
  2. Con l'immagine già aperta, clicca su Multi-point. Utilizzare questo strumento per quantificare le celle facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su ciascuna cella da contare.
  3. Quantificare le cellule colocalizzate, cioè positive per la recuperina e il DAPI, nello strato nucleare esterno (ONL).
  4. Al termine del conteggio, fare doppio clic con il pulsante sinistro del mouse per visualizzare il numero totale di celle contrassegnate.
  5. Dopo aver determinato il numero di celle positive alla recoverina, inserire il numero di celle nella tabella di quantificazione di Excel e passare alla fotomicrografia successiva.
  6. Ripetere tutti i passaggi per gli 8 campi corrispondenti a ciascun animale.
  7. Calcola la media di questi otto campi, corrispondente a un singolo punto sperimentale per l'intera retina (n= 1). Per il grafico della retina periferica, utilizzare la media dei campi periferici, per un totale di quattro campi: due dall'occhio sinistro e due dall'occhio destro. Questa media corrisponde a un punto sperimentale per la retina periferica (n= 1). Crea il centro del grafico della retina allo stesso modo del grafo periferico, modificando solo la regione.

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Risultati

La tecnica di immunofluorescenza per la marcatura dei fotorecettori, cellule rerecoverin-positive, ha permesso di osservare il pattern di degenerazione dei fotorecettori negli animali rd10 e C57Bl6, con quest'ultimo considerato sano (Figura 1). Come si può vedere, la marcatura delle cellule recettore-positive è esclusiva dello strato nucleare esterno (ONL) in cui si trovano i fotorecettori, compresa la marcatura dei segmenti interni a queste cellule, sia negl...

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Discussione

La retina è un tessuto delicato di difficile accesso; Pertanto, è necessario considerare la tecnica da utilizzare per eseguire un trattamento farmacologico mirato a questo tessuto. L'iniezione intravitreale è una tecnica consolidata e ampiamente utilizzata per la somministrazione di farmaci direttamente nella retina, in particolare nel trattamento di malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età21, la retinopatia diabetica22

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato condotto durante una borsa di ricerca sostenuta dal Consiglio Nazionale per lo Sviluppo Scientifico e Tecnologico (CNPq), dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il Sostegno alla Ricerca dello Stato di Rio de Janeiro (FAPERJ), ed è stato anche finanziato in parte dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Codice Finanziario 001.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787Soluzione per tampone di blocco
1% BSASigma-AldrichA4503Soluzione per tampone di blocco
1% BD umano Fc BloccoBD Biosciences564220Blocco Fc necessario per il tampone di blocco
Lampada LED da 150 WAmazonB07VH3CVSFSorgente luminosa LED per fotoirradiazione tissutale
1x PBS Gibco10010-023Soluzione per il blocco delle fasi di buffer e lavaggio
Contenitore di stoccaggio da 20 galloniAmazonB001B1C4G0Contenitore per processo di fotoirradiazione
Lampada LED RGBW da 40 WAmazonB08QFPJSMDSorgente luminosa RGB per fotoirradiazione tissutale
Ag85BAbcamab43019/NAAnticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAnticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Kit bloccante avidina/biotinaAbcamab64212Soluzione bloccante avidina e biotina
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714Soluzione di fissazione
BOND Dewax Soluzione di deparaffinazioneLeica BiosystemsNC0221076di deparaffinazione
BOND Soluzione per il recupero dell'epitopo 1Leica BiosystemsNC0235529Soluzione per il recupero dell'epitopo a base di citrato ( ER1)
BOND Soluzione per il recupero degli epitopi 2Leica BiosystemsNC0235530Soluzione per il recupero degli epitopi a base di EDTA a pH 9 (ER2)
BOND Research Detection System LeicaBiosystemsNC0396648Reagente di colorazione automatizzato per la ricerca
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNAPiattaforma automatizzata per la colorazione per la ricerca
BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077Tampone di lavaggio
CD15BD Biosciences347420/AB_400298Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD4 Alexa Fluor 488R& D SystemsFAB8165G/AB_2728839Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD45 Ficoeritrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAnticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Sistema di colorazione EasyDipNewcomer Supply5300KITSistema di colorazione per vetrini
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02Mezzi di montaggio
HoechstBiotium40046Colorazione nucleare per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Imaris File Converter x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsConvertitore di file gratuito
ImarisViewer software x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentsSoftware gratuito per l'elaborazione delle immagini
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000Penna barriera idrofobica
Boroidruro di litio (1 grammo)STREM Chemicals93-0397Sostanza chimica per l'inattivazione del colorante, acquistare piccole aliquote di questa sostanza chimica (1 grammo)
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Micro Cover GlassesVWR48393-241Coperture per vetrini
in vetro Pan-citocheratina Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
PELCO BioWave Pro Microwave SystemTed Pella Inc36500-230Microonde scientifico non riscaldante
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Controllo della temperatura completamente automatizzato per microonde scientifiche
SimpleITKSoftwareregistrazione ed elaborazione dei canali
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227Reagente di marcatura per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Microscopio a campo largoLeica MicrosystemsNALeica Microsystems THUNDER imager con sorgente luminosa LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Per l'imaging a fluorescenza, è stato utilizzato un filtro quad-band personalizzato con ruota portafiltri esterna (PN: 11536075) con due filtri a banda singola aggiuntivi (PN: 8118215) per visualizzare sette canali di colorante per passaggio. Le linee di eccitazione, dicroica ed emissione del filtro sono (1) cubo Quad-Band: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, senza filtri di eccitazione o di emissione; (2) ruota portafiltri esterna posizione 1: 434/32, posizione 2: 520/40, posizione 3: 585/20, posizione 4: 720/60, posizione 5: passante; (3) 1 banda singola— 585/22 eccitazione, 594 dicroica, 625/30 emissione; (4) banda singola 2— 635/20 eccitazione, 647 dicroica, 667/30 emissione.
Detergente per lenti ottiche ZeissAmazonB00GPVQVCODetergente per lenti per obiettivo per microscopio
Anticorpi
Ag85BAbcamab43019IgG policlonale di coniglio, ciclo 1
Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, ciclo 1
CD4 Alexa Fluor 488R&;D SistemiFAB8165GIgG policlonali caprine, ciclo 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B, ciclo 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, ciclo 1
Asino anticapra IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814Asino policlonale, ciclo 1
Asino antitopo IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787Asino policlonale, ciclo 1
Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794Asino policlonale, ciclo 1
HoechstBiotium40046Nuclear label, ciclo 1
CD15BD Biosciences347420MMA, ciclo 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, ciclo 2
CD45 Ficoeritrina (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, ciclo 2
Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020Polyclonal Donkey, ciclo 2
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846IgG policlonali di capra, ciclo 2
Pan-citocheratina Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, ciclo 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N/A, ciclo 2
HoechstBiotium40046ciclo 2
Solutions
Blocking Buffer (Ciclo 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870,3% in volume
BSASigma-AldrichA45031% in volume
Blocco BD Fc umanoBD Biosciences5642201% in volume
1x PBS Gibco10010-02397,7% in volume
Soluzione colorante per anticorpi primari #1 (Ciclo 1)
Tampone bloccante (Ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
Soluzione di colorazione degli anticorpi primari #2 (Ciclo 1)
Tampone bloccante (Ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo aver aggiunto gli anticorpi
CD4  AF488R& D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
Soluzione di colorazione secondaria degli anticorpi #1 (Ciclo 1)
Tampone bloccante (Ciclo 1)Vedi sopraRabboccare al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Donkey Anti-Goat AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
Asino anti-Coniglio AF Plus 555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_27628341:100
Asino anti-Topo AF Plus 647Thermo Fisher ScientificA32787/AB_27628301:50
Soluzione colorante anticorpale primaria #3 (Ciclo 1)
Tampone bloccante (Ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta anticorpi
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
BSA-free Blocking Buffer (Ciclo 2) 
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870,3% in volume
Blocco BD Fc umanoBD Biosciences5642201% in volume
1x PBS Gibco10010-02398,7% in volume
Soluzione di colorazione primaria per anticorpi #4 (Ciclo 2)
Tampone di blocco privo di BSA (Ciclo 2)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican BiotinR& D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-citocheratina AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
Soluzione di colorazione secondaria degli anticorpi #2 (Ciclo 2)
Tampone di blocco senza BSA (ciclo 2)Vedere sopraRabboccare al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Donkey anti-Mouse IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200
Soluzione open source Software di

Riferimenti

  1. Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
  4. Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
  5. Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  6. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
  7. Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  8. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  9. Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
  10. Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
  11. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
  12. O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  13. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
  14. Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
  15. Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
  16. Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
  17. Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
  18. Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
  19. Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
  20. Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  21. Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
  22. Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
  23. Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
  24. Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
  25. Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
  26. Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
  27. Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
  28. Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
  29. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
  30. Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
  31. Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
  32. Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
  33. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  34. Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
  35. Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
  36. Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).

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