Articolo metodologico

Difetti di transito intestinale in modelli di Drosophila di malattia di Parkinson monogenica utilizzando un test di costipazione

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DOI:

10.3791/68325

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11 luglio 2025

 ,  , 
1Institute of Neurogenetics, University of Luebeck and University Hospital Schleswig-Holstein

In questo articolo

Sommario

La stitichezza è una caratteristica prodromica comune della malattia di Parkinson (PD), che spesso si manifesta anni prima della diagnosi. Questo studio ha convalidato un metodo proposto per misurare la stitichezza in Drosophila melanogaster e sono stati confermati i deficit in diversi modelli di mosca di PD monogenico.

Abstract

La malattia di Parkinson (PD) è una comune malattia motoria neurodegenerativa ed è spesso accompagnata da diversi sintomi non motori. Tra questi ultimi, i problemi gastrointestinali, tra cui la stitichezza, spesso emergono anni prima della manifestazione delle difficoltà di locomozione e prima che venga stabilita una diagnosi di PD. Uno studio recente ha proposto un metodo per misurare la stitichezza in un modello di mosca PD che esprime l'alfa-sinucleina umana wild-type. In questo studio, abbiamo esaminato la fattibilità di questo metodo e testato se altri modelli genetici di PD del moscerino provocano ugualmente stitichezza. Le linee di mosca disponibili sono state utilizzate per misurare il livello di stitichezza in modelli di PD autosomici dominanti e recessivi, tra cui tre diverse linee di Drosophila che esprimono alfa-sinucleina umana mutante e mosche carenti di Pink1 e Parkin. Queste mosche e i loro controlli corrispondenti sono stati posizionati su cibo di colore blu un giorno prima dell'esperimento per indurre macchie fecali blu. Il giorno dell'esperimento, queste mosche sono state trasferite alla farina di mais standard. La percentuale di macchie fecali blu rispetto alle macchie fecali totali è stata registrata e calcolata ogni 90 minuti. I diversi modelli di mosca PD mostrano un'espulsione più lenta o incompleta del cibo di colore blu rispetto alle rispettive mosche di controllo. Pertanto, un metodo precedentemente proposto per misurare la stitichezza è stato convalidato e applicato a vari modelli di mosca di diverse forme di PD genetica.

Introduzione

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata principalmente da disfunzione motoria, inclusi i segni diagnostici cardinali di bradicinesia, rigidità e tremore. Sebbene la malattia di Parkinson sia meglio conosciuta per i suoi segni motori, i sintomi non motori sono comuni, tra cui depressione, dolore, disturbi del sonno e costipazione 1,2. Spesso, questi sintomi non motori emergono precocemente nel decorso della malattia e possono precedere i sintomi motori di diversi anni3. Riconoscere queste caratteristiche non motorie nella fase iniziale della malattia può essere fondamentale nella diagnosi precoce del PD, facilitando potenzialmente un intervento più tempestivo e la gestione della malattia.

La stitichezza e le alterazioni della motilità intestinale sono sintomi non motori comunemente riportati nella malattia di Parkinson e sono spesso presenti molto prima dell'insorgenza dei sintomi motori 3,4. Inoltre, la loro gravità e frequenza aumentano con la progressione della PD5. Tuttavia, la nostra comprensione dei modelli e dei meccanismi della stitichezza rimane limitata. Pertanto, l'identificazione precoce della stitichezza legata al PD potrebbe aiutare a diagnosticare il PD in una fase in cui gli interventi terapeutici possono essere più efficaci nel rallentare la progressione della malattia. Nonostante la sua importanza, la comprensione dei meccanismi sottostanti alla stipsi nella PD rimane limitata, in parte a causa della mancanza di modelli sperimentali e disegni appropriati. I recenti progressi nello studio della stitichezza in Drosophila melanogaster utilizzando la sovraespressione dell'alfa-sinucleina umana wild-type forniscono uno strumento prezioso per studiare i meccanismi alla base di questo sintomo precoce non motorio6.

SNCA, che codifica per l'alfa-sinucleina, rappresenta la prima causa identificata di PD7. Sia la moltiplicazione genica (duplicazione e triplicazione) che le mutazioni puntiformi nella SNCA portano alla trasmissione autosomica dominante della PD8. In particolare, la stitichezza colpisce fino al 90% dei pazienti portatori di mutazioni SNCA 5. Inoltre, sono stati identificati diversi altri geni che causano la malattia di Parkinson quando mutati, tra cui VPS35, che causa anche forme autosomiche dominanti di PD8. Altri geni, come PINK1 e Parkin, causano la malattia di Parkinson autosomica recessiva quando mutati9. I sintomi non motori si verificano anche in queste altre forme genetiche di PD; Tuttavia, i dati riportati sono scarsi e, quindi, è difficile concludere o indagare i meccanismi sottostanti 10,11.

Diversi modelli animali sono stati creati per la PD, tra cui Drosophila melanogaster12. Sebbene la Drosophila non contenga il gene SNCA , la sovraespressione delle forme wild-type e mutanti del gene induce fenotipi parkinsoniani13. Inoltre, i mutanti vps35, pink1 e parkin flys, legati al PD, sono modelli consolidati per lo studio dell'effetto dei rispettivi geni mutanti in relazione al PD12. Inoltre, la capacità di misurare la stipsi in diversi modelli di PD di Drosophila , comprese le forme dominanti e recessive, consente un'analisi più approfondita della disfunzione gastrointestinale e, quindi, una migliore comprensione delle vie coinvolte nella stipsi correlata alla PD.

Qui, la fattibilità del metodo recentemente proposto per misurare la stitichezza è stata valutata e convalidata6 utilizzando diversi modelli genetici di PD. Espandendo l'applicazione di questo metodo ad altri modelli genetici di PD e apportando aggiustamenti, confermiamo la fattibilità di questo metodo come test generale per misurare la stitichezza o l'alterazione della motilità intestinale e approviamo la possibilità di eseguire screening modificatori per ottenere informazioni sui meccanismi molecolari alla base della stitichezza del PD.

Protocollo

In questo test sono state utilizzate mosche maschi di dieci giorni. Per la sovraespressione di SNCA, è stato utilizzato l'onnipresente driver DaughterlessGal4 .

Mosche utilizzate in questo test:

w1118;; SNCA p.A53T/DaGal4 e il suo controllo w1118;; SNCA p.A53T
w1118;; SNCA p.A30P/DaGal4 e il suo controllo w1118;; SNCA p.A30P
w1118;; SNCA p.V15A/DaGal4 e il suo controllo w1118;; SNCA p.V15A
w1118;; Vps35D650N/DaGal4 e il suo controllo w1118;; vps35D650N
w rosa1B9;; e il loro controllo w rosa1RV;;
w1118;; parcoD1/D21 e il loro controllo w1118;; parcocamper

SNCA p.A53T, SNCA p.A30P, w*;; P(EP)parco1, w*;; parkΔ21, Vps35D650N e DaGal4 sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). w pink1B9 null mutanants and controls (w pink1RV) sono stati gentilmente forniti da Jeehye Park e Jongkyeong Chung (Korea Advanced Institute of Science and Technology)14. Le mosche SNCA p.V15A sono state create in precedenza15. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del cibo blu

  1. Prepara la farina di mais standard fresca e mantienila calda e liquida.
    NOTA: È possibile utilizzare un substrato da mosca pre-preparato, ma deve essere riscaldato per rendere il substrato liquido. La farina di mais standard è composta da 50 g di farina di mais, 7 g di lievito, 7 g di agar, 13,5 g di destrosio, 10 ml di etanolo (100%), 1,1 g di metil-4-idrossibenzoato, 55 g di melassa e 4,8 ml di acido propionico per 1 litro di terreno di coltura.
  2. Mescolare il colorante alimentare blu con acqua distillata in un rapporto 1:1 (v/v).
  3. Aggiungere la miscela di alimenti blu al terreno di farina di mais standard per saturarlo con il cibo blu e ottenere un colore blu uniforme.
    NOTA: In questo studio è stato utilizzato un rapporto 1:100.
  4. Erogare il cibo blu in grandi fiale di cibo utilizzando una pipetta Pasteur in modo che il fondo sia coperto e lasciarle asciugare all'aria per solidificarsi.
  5. Preparare lo stesso numero di fiale di cibo con un normale terreno di farina di mais.
  6. Coprire le fiale di cibo con un tovagliolo di carta sottile durante l'asciugatura per evitare l'accumulo di umidità e contaminazione.

2. Preparazione del test

  1. Metti una carta Whatman bagnata in fiale di cibo vuote.
    NOTA: Assicurarsi di immergere la carta Whatman in modo che aderisca al fondo quando le mosche vengono trasferite nelle fiale con il mezzo blu.
  2. Aggiungere 15-20 mosche a ogni fiala e lasciarle per 1 ora.
    NOTA: L'anestetizzazione delle mosche ha permesso di selezionare le mosche con il genotipo corretto. Successivamente, le mosche sono state fatte scorrere in una fiala con un pennello e invecchiate per dieci giorni. Il trasferimento delle mosche viene eseguito lanciando con cautela le mosche da una fiala all'altra e utilizzando tappi per evitare che le mosche fuoriescano.
  3. Trasferire le mosche nelle fiale contenenti il terreno blu e lasciarle per una notte in un'incubatrice a 25 °C.

3. Esecuzione del test della stitichezza

  1. La mattina seguente, trasferire le mosche nelle fiale con farina di mais standard e rimetterle nell'incubatrice per 90 minuti.
    NOTA: Si può controllare se le pance di tutte le mosche nelle fiale sono blu mettendole sotto un microscopio.
  2. Dopo 90 minuti, contare il numero di punti blu e incolori e opachi, contrassegnarli con un pennarello colorato, registrarli e rimettere le mosche nell'incubatrice (Figura 1).
    NOTA: Contrassegnare i punti già contati evita di ripetere il conteggio. Inoltre, i punti sul cibo o sul tappo della fiala venivano ignorati.
  3. Ripetere il passaggio 4.2 altre quattro volte con le stesse mosche per ottenere un andamento temporale dei punti fecali. Ogni volta, è stato utilizzato un pennarello di colore diverso per evitare di ripetere il conteggio dei round precedenti.

4. Analisi

  1. Calcola le percentuali di punti blu rispetto al numero totale di punti (punti blu e opachi) per ogni punto temporale.
  2. Traccia i dati in un grafico utilizzando la percentuale di punti blu nei diversi punti temporali e, tramite l'analisi dell'area sotto la curva, in GraphPad, l'area sotto la curva è stata calcolata e tracciata.
  3. Analizza i dati in GraphPad Prism per eseguire un t-test non accoppiato con la correzione di Welch16.
    NOTA: La correzione di Welch è stata inclusa in quanto non è stato possibile testare deviazioni standard uguali in tutte le popolazioni.

Risultati

Sono stati apportati piccoli aggiustamenti a un metodo precedentemente presentato per misurare la stitichezza nei moscerini7 e per testare la funzione intestinale in diversi modelli genetici di moscerini correlati al PD. L'incubazione notturna delle mosche sul terreno di colore blu ha provocato ventri di mosca che apparivano blu (Figura 2) e materia fecale che lasciava macchie blu sulla fiala di cibo per mosche (Figura 2). Nel corso del tempo, i ventri blu sono tornati ai normali ventri di colore giallastro (Figura 2). Inoltre, le macchie fecali blu sono diminuite e sono state osservate macchie gialle opache in aumento (Figura 2). Questo passaggio dalle macchie blu a quelle gialle dà un'idea del livello di motilità intestinale o stitichezza. La transizione è stata completa nei moscerini di controllo dopo 7 ore e 30 minuti, mentre nei moscerini correlati alla PD, questa rimozione del terreno di colore blu è avvenuta a un ritmo più lento (Figura 2).

In precedenza, la clearance ritardata del medium blu è stata descritta in moscerini di 10 giorni che esprimevano alfa-sinucleina7 wild-type, suggerendo un livello di stitichezza o clearance ritardata a causa di alterazioni della motilità intestinale presenti in questi moscerini rispetto ai moscerini di controllo. Oltre alle duplicazioni o triplicazioni di SNCA, sono state identificate diverse varianti patogene missenso nella SNCA legate alla PD e sono state testate tre varianti patogene comuni della SNCA. L'espressione dell'alfa-sinucleina mutante (p.A30P, p.A53T e p.V15A) ha portato a una clearance incompleta del terreno blu entro 7 ore e 30 minuti, suggerendo la presenza di stitichezza in questi moscerini rispetto ai moscerini di controllo (Figura 3).

L'alfa-sinucleina è legata alle forme autosomiche dominanti di PD. È interessante notare che l'espressione dell'alfa-sinucleina riduce i livelli della proteina VPS3517. VPS35 è una subunità del retromero e, quando mutata, causa PD 9,18,19. Un aumento della stitichezza è stato osservato nei moscerini mutanti che esprimono vps35 rispetto ai moscerini di controllo (Figura 4).

Le mosche carenti di Pink1 e Parkin mostrano una clearance ritardata del mezzo blu; tuttavia, dopo 7 ore e 30 minuti, non sono state più rilevate macchie fecali blu in questi moscerini mutanti (Figura 5).

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Figura 1: Rappresentazione schematica del processo di conteggio con marcatori colorati. Dopo 90 minuti, le macchie fecali sono state contate e indicate con un pennarello colorato per evitare che venissero ricontate nel turno successivo. Un altro colore è stato utilizzato per indicare le macchie fecali aggiuntive durante il successivo giro di conteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Il blu medio provoca ventre blu e macchie fecali blu. (A) Le immagini del ventre delle mosche di controllo (pink1RV) e delle mosche mutanti pink1 nei punti temporali 0 h, 4 h 30 min e 7 h 30 min mostrano lo sbiadimento del colore blu. (B) Le macchie fecali blu e gialle opache sulla fiala di cibo per mosche sono indicate con frecce rosse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: L'espressione dell'alfa-sinucleina mutante provoca stitichezza. Percentuale di macchie fecali blu nel tempo nei moscerini che sovraesprimono SNCA p.A30P (A), SNCA p.A53T (C) e SNCA p.V15A (E) e i rispettivi controlli. Viene presentata l'area associata sotto la curva (B,D,F). I dati sono la media e la deviazione standard. n ≥ 3 fiale con 15-20 mosche per fiala. È stato eseguito il test T di Welch; *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: L'espressione del mutante vps35 provoca stitichezza. (A) Percentuale di macchie fecali blu nel tempo nei moscerini che sovraesprimono il mutante vps35D650N legato al PD e il suo controllo. (B) Viene presentata l'area sotto la curva. I dati sono la media e la deviazione standard. n = 3 fiale con 15-20 mosche per fiala. È stato eseguito il test T di Welch; : p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Il deficit di Pink1 e Parkin induce una clearance fecale ritardata. Percentuale di macchie fecali blu nel tempo in Pink1- (A) e Parkin-deficient (C) e le rispettive mosche di controllo. Viene presentata l'area associata sotto la curva (B,D). I dati sono la media con la deviazione standard. n ≥ 3 fiale con 15-20 mosche per fiala. È stato eseguito il test T di Welch; *: p < 0,05; : p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Recentemente, è stato proposto un metodo per misurare la stitichezza in Drosophila melanogaster . Con l'applicazione di questo metodo, è stata osservata stipsi o alterata motilità intestinale nei moscerini che esprimono alfa-sinucleina7 wild-type. Questo metodo è stato convalidato con diverse alterazioni ed è stata identificata la stitichezza in tutti i modelli genetici di PD testati.

Rispetto alla descrizione originale del metodo, sono state incorporate diverse modifiche per aumentare la fattibilità e la robustezza. Per evitare alterazioni nella saturazione del medio blu, è stato preparato un lotto di medio blu e diviso nel numero richiesto di fiale di cibo. Inoltre, prima di aggiungere le mosche al medium blu, sono state brevemente private del cibo, fornendo solo l'accesso all'acqua. Questo passaggio è stato aggiunto per stimolare l'assorbimento del mezzo blu. Senza questo passaggio aggiuntivo, non tutte le mosche mostravano un ventre azzurro chiaro, un punto di partenza fondamentale per ottenere risultati rappresentativi. Infine, diversi modelli di mosca PD mostrano un livello di sensibilità al botto 13,14,20. Pertanto, le mosche non sono state trasferite durante ogni fase di conteggio per evitare qualsiasi influenza di questa sensibilità sull'uscita fecale. Tuttavia, sono stati utilizzati pennarelli di colore diverso per indicare le macchie per evitare il doppio conteggio.

Analogamente alla descrizione originale, è stato anche osservato che le mosche defecano meno frequentemente nel pomeriggio. Tuttavia, poiché questo è il caso sia per i moscerini di controllo che per quelli mutanti, ciò non ha portato ad anomalie nella registrazione delle macchie. Inoltre, avere abbastanza macchie fecali da contare in ogni momento è la chiave per ottenere risultati solidi. Pertanto, si consiglia un minimo di quindici mosche per fiala7.

Nel manoscritto originale, la stitichezza è stata osservata nelle mosche di 10 giorni, ma non nelle mosche di 1 giorno. Pertanto, in questo test, il test della stitichezza è stato eseguito in mosche di dieci giorni e la stitichezza o l'alterazione della motilità intestinale sono state osservate in tutti i modelli di mosca PD testati. Precedenti studi di locomozione hanno rivelato che la stitichezza precede la disfunzione motoria nei moscerini che esprimono alfa-sinucleina, con menomazioni di volo che diventano evidenti solo a tre settimane di età di16 anni. Questa sequenza temporale dei sintomi rispecchia la progressione osservata nei pazienti con PD, dove i problemi gastrointestinali spesso si manifestano prima dei deficit motori. A differenza dei modelli di alfa-sinucleina, i moscerini pink1 o parkin-mutant mostrano menomazioni già dal primo giorno dopo l'eclosion21. Pertanto, indagare se i difetti del transito intestinale si manifestano in questo punto temporale precoce fornirebbe preziose informazioni sulla progressione dei sintomi non motori in questi modelli genetici. Pertanto, dovrebbero essere eseguiti esperimenti più approfonditi per comprendere ulteriormente la biologia sottostante.

Il test qui descritto facilita la valutazione quantitativa della motilità gastrointestinale e dei fenotipi di stitichezza, ma non può valutare parametri come la consistenza fecale, il contenuto, la colorazione o la morfologia. In precedenza, veniva misurata la produzione fecale, in cui il colore e la morfologia venivano valutati utilizzando metodologie consolidate nei modelli di Drosophila 22,23,24. Tuttavia, questo test richiede apparecchiature specializzate (ad esempio, scanner per la trasparenza) e software analitici dedicati, introducendo considerazioni tecniche e di risorse distinte rispetto al protocollo qui descritto. Tuttavia, questo test mostra difetti gastrointestinali nei moscerini carenti di Pink122,23.

Le disfunzioni gastrointestinali sono riconosciute come manifestazioni in comorbidità in molteplici disturbi neurologici e neurodegenerativi, tra cui il disturbo dello spettro autistico, il morbo di Alzheimer e la sclerosi multipla 25,26,27,28, per i quali Drosophila melanogaster funge da organismo modello trattabile per studiare le basi meccanicistiche. Il quadro metodologico stabilito per lo studio della motilità intestinale e della stitichezza in Drosophila può essere estrapolato a queste malattie.

In conclusione, questo studio ha confermato un metodo fattibile e robusto precedentemente presentato per misurare la stitichezza nei moscerini. Questo test mostra che la stitichezza è presente in più modelli genetici di Drosophila PD che sono particolarmente adatti allo studio della stitichezza, in quanto offrono l'opportunità di studiare mosche a rischio geneticamente definite prima che appaia la manifestazione delle caratteristiche motorie. Inoltre, altri modelli di malattia in Drosophila che manifestano irregolarità della motilità intestinale possono essere valutati con questo e con lo screening farmacologico.

Dichiarazioni

C. K è stato consulente per Centogene, Takeda, Biogen e la Lundbeck Foundation, ha ricevuto onorari di relatori da Bial e finanziamenti per la ricerca da DFG, MJFF e ASAP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bacto AgarBecton, Dickinson and company214010
Tappi CeapranGreiner Bio-One330070
Farina di maisDr. Oetker GmbH
DestrosioSigma-AldrichD9434-1KG
Contenitore per drosophilaGreiner Bio-One217101
etanolo (100%)J.T. BakerBAK8025 2500
Filterpapier Cellulose, Whatman (Grado 3)Sigma-AldrichWHA1003185
GraphPad Prism GraphPad
Methyl-4-hydroxybenzoatSigma-AldrichH5501-100G
MolassesRapunzel Naturkost GmbH
pennarello colorato permanenteStadtler11-348
Acido propionicoThermo Fisher Scientific Inc.
Royal Blue Azul vero colore glassaWilton Lebensmittelfarben
StereomicroscopioNikon
LievitoAlgist Bruggeman1278
Drosophila stocks
DaGal4Bloomington Stock Center95282
parco< sup>D1/D21 Jeehye Park e Jongkyeong Chung
parkRVJeehye Park e Jongkyeong Chung
SNCA p.A53TBloomington Stock Center8148
SNCA p.A30PBloomington Stock Center8147
SNCA p.V15Aprecedentemente creato in laboratorio
Vps35D650NBloomington Stock Center91646
w pink1B9 Jeehye Park e Jongkyeong Chung
w pink1RVJeehye Park e Jongkyeong Chung
w1118Bloomington Stock Center3605
149300010

Riferimenti

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