Articolo metodologico

In vivo Imaging dell'attività neurale nelle mosche adulte di Drosophila non anestetizzate

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DOI:

10.3791/68332

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20 giugno 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

In questo articolo

Sommario

Un ostacolo significativo allo studio dell'attività cellulare durante i processi cognitivi come l'apprendimento e la memoria è l'uso di anestetici per la preparazione dell'imaging in vivo . L'anestesia compromette la memoria a breve termine e la cognizione in più modelli, tra cui la Drosophila. Questo studio presenta un metodo unico per preparare la Drosophila adulta per l'imaging in vivo senza anestesia.

Abstract

L'imaging in vivo è fondamentale per lo studio della neurobiologia in Drosophila in quanto consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale, dello sviluppo e della plasticità all'interno del moscerino intatto che si comporta. Questa tecnica fornisce informazioni preziose sui processi dinamici, come la funzione sinaptica e la connettività dei circuiti, che non possono essere catturati con precisione in preparazioni fisse o ex vivo . La maggior parte delle tecniche per la preparazione delle mosche per l'imaging in vivo prevede l'anestetizzazione delle mosche poco prima dell'imaging funzionale. Tuttavia, ampie prove dimostrano che l'anestesia influisce su diversi processi cognitivi e fisiologici. Per questo motivo, l'imaging in vivo di Drosophila melanogaster adulta senza l'uso di anestetici durante la preparazione animale è un approccio impegnativo ma altamente desiderabile. Il protocollo qui presentato prevede l'immobilizzazione della testa delle mosche sveglie aspirando la proboscide in un piccolo tubo metallico collegato a un sistema a vuoto. Mentre la testa è fissa, la mosca viene preparata per l'imaging funzionale senza necessità di anestesia. Questo protocollo è rapido e riproducibile, garantendo l'assenza di danni alla mosca. Il vantaggio principale di questo metodo risiede nell'evitare l'uso di anestetici, tenendo così conto dei potenziali effetti complessi dell'anestesia sull'attività neurale. Questo metodo è conveniente e altamente adattabile, utilizzando strumenti economici e personalizzabili. Consente l'imaging di successo di mosche vive, catturando rapidi cambiamenti nell'attività neurale associati ai processi cognitivi dinamici.

Introduzione

I recenti progressi nei reporter di attività geneticamente codificati hanno rivoluzionato le neuroscienze fornendo approfondimenti altamente specifici in tempo reale sull'attività neuronale. Questi reporter, come i sensori di calcio o di tensione 1,2,3,4,5,6,7,8,9, consentono ai ricercatori di tracciare i segnali elettrici e chimici all'interno dei neuroni con una precisione temporale e una risoluzione spaziale senza precedenti. Consentendo il monitoraggio di singoli neuroni specifici per reti neurali in diverse regioni del cervello, questi strumenti hanno approfondito la nostra comprensione di come i modelli di attivazione neuronale si relazionano a processi cognitivi come l'apprendimento, la memoria o il processo decisionale 10,11,12,13,14.

Per sfruttare questi indicatori geneticamente codificati, i ricercatori hanno sviluppato metodi avanzati per preparare il loro organismo modello per l'imaging in vivo. Il primo rapporto di plasticità neuronale mediante imaging funzionale in vivo, spesso indicato come "traccia di memoria", è stato scoperto nel lobo antennale delle api mellifere in seguito a condizionamento olfattivo appetitivo15. Questa scoperta ha ispirato la ricerca sull'organismo modello geneticamente versatile, Drosophila melanogaster, che ha portato allo sviluppo di tecniche innovative di imaging in vivo 10,16,17,18.

La Drosophila funge da modello eccellente per comprendere l'apprendimento e la memoria grazie alla sua robusta capacità di formare ricordi olfattivi attraverso il condizionamento classico, in cui un odore (lo stimolo condizionato-CS) viene associato a uno stimolo avversivo o gratificante (lo stimolo incondizionato-US)19,20,21,22. In Drosophila, gli odori sono scarsamente rappresentati nel corpo del fungo (MB)23, una regione cerebrale critica per la memoria associativa che consiste di circa 2.000 neuroni a cellule di Kenyon (KC) per emisfero24. Le informazioni olfattive vengono trasmesse dal calice ai lobi MB tramite assoni KC, che si raggruppano per formare i lobi. Durante il condizionamento olfattivo, l'ecografia, come una scossa elettrica o una ricompensa di zucchero, viene veicolata ai lobi MB attraverso neuroni dopaminergici distinti (DAN): neuroni PPL1 per stimoli avversivi e neuroni PAM per stimoli gratificanti 25,26,27,28,29,30. Si ritiene che l'acquisizione della memoria coinvolga l'attivazione simultanea delle vie CS e US, con conseguente aumento sinergico dell'AMP ciclico (cAMP), che codifica la memoria31,32. Questo processo induce plasticità alle sinapsi KC→MBON, modificandone il peso sinaptico 11,12,13,33,34,35,36,37. La plasticità mediata da DAN alla fine spinge i neuroni di output del corpo a fungo (MBON) a suscitare un comportamento di approccio o di evitamento verso l'odore appreso34. Il modello attuale suggerisce che il flusso di informazioni dai KC agli MBON trasforma la rappresentazione dell'odore dall'identità dell'odore nei KC a informazioni più astratte negli MBON, come la valenza di un odore basata sull'esperienza precedente34,38. A differenza dei KC, gli MBON hanno risposte agli odori ampiamente sintonizzate; qualsiasi odore dato provoca una risposta alla maggior parte degli MBON39. La regolazione degli odori degli MBON è modificata dalla plasticità sinaptica e varia in modo significativo tra i singoli moscerini, suggerendo che gli MBON cambiano la loro risposta agli odori in base all'esperienza. Ci sono 34 MBON, con la maggior parte della rete MBON apparentemente divisa in due classi reciprocamente antagoniste che guidano entrambi gli approcci del comportamento di evitamento34. Per questo motivo, l'utilizzo dell'imaging in vivo per studiare il recupero della memoria registrando in diversi MBON è stato ampiamente utilizzato.

I primi metodi per l'imaging funzionale in vivo includono l'esecuzione di interventi chirurgici per rimuovere una sezione della cuticola dalla parte superiore della capsula della testa, che è stata poi coperta con un piccolo pezzo di pellicola trasparente18. Sebbene questo abbia segnato l'inizio dell'imaging in vivo in Drosophila, da allora ci sono stati progressi significativi nelle tecniche di preparazione delle mosche e nella somministrazione di stimoli al microscopio per studiare processi come l'apprendimento e la memoria. Tuttavia, ancora oggi, la maggior parte delle tecniche per la preparazione delle mosche per l'imaging in vivo prevede l'anestetizzazione delle mosche. Questa pratica presenta delle sfide, poiché esistono numerose prove - e un intero campo di ricerca - che dimostrano come l'anestesia influisca sulla memoria, così come su altri processi cognitivi e fisiologici. Ad esempio, è stato condotto uno studio per comprendere gli effetti di diversi anestetici molto comunemente usati in laboratorio (anidride carbonica, isoflurano, sevoflurano e shock da freddo). Hanno scoperto che più lunga è l'esposizione all'anestesia, c'è stato un aumento del tempo di recupero, cambiamenti nell'attività locomotoria, minore fecondità e può avere un impatto sulle riserve di acqua e lipidi40. Inoltre, è stato riportato che somministrare l'anestesia da shock freddo subito dopo l'allenamento può interrompere completamente la memoria a breve termine21. Da questo studio iniziale, è ora noto che in Drosophila esiste una memoria non consolidata (memoria sensibile all'anestesia) che decade entro 6-8 ore e una forma di memoria consolidata (memoria resistente all'anestesia) che si forma gradualmente dopo l'apprendimento e può durare circa 24 ore e41. Sulla base di ciò, l'anestesia può influenzare l'elaborazione cognitiva e l'attività dei neuroni, che alla fine consente una corretta espressione della memoria.

Gli effetti dell'anestesia sulla memoria non sono limitati alla Drosophila. Numerosi studi sull'uomo e su altri mammiferi hanno dimostrato risultati simili. Ad esempio, uno studio trasversale condotto in un ospedale universitario ha rilevato che la memoria a breve termine era significativamente ridotta nei pazienti 24 ore dopo l'anestesia generale42. Un altro studio condotto sui topi ha scoperto che l'anestesia generale ha ridotto fortemente le dinamiche di picking, gli insiemi cellulari decorcorrelati e alterato le dinamiche della colonna vertebrale nella regione CA1 dell'ippocampo, un'importante area cerebrale coinvolta nell'apprendimento e nella memoria nei mammiferi43. Per superare queste difficoltà, l'obiettivo di questo studio è fornire un nuovo protocollo che elimini l'uso dell'anestesia durante la preparazione del moscerino per l'imaging in vivo , lasciando il corpo del moscerino completamente libero. Questo approccio consente registrazioni più accurate dell'attività neuronale, migliora la salute dei moscerini per registrazioni più lunghe ed elimina i possibili effetti confondenti dell'anestesia rispetto ad altri approcci. Questo protocollo è progettato per registrare l'attività dei neuroni in Drosophila, osservando in particolare come i neuroni mostrano plasticità durante e dopo l'esperienza di apprendimento. Tuttavia, il protocollo di dissezione è versatile e può essere adattato a varie applicazioni nella ricerca di imaging dal vivo.

Protocollo

I dettagli dell'attrezzatura e dei reagenti utilizzati per questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Moscerini della frutta transgenici, Drosophila melanogaster

  1. Incrociare mosche femmine vergini e maschi (allevate a 25 °C al 60% di umidità relativa su un ciclo luce/buio di 12 ore) che trasportano rispettivamente i costrutti Gal4 e UAS desiderati per produrre mosche in cui specifici neuroni di interesse esprimono il reporter di attività geneticamente codificato desiderato.
  2. Invecchiare la progenie dell'incrocio di cui sopra fino a quando non si trova nell'intervallo di 2-5 giorni dopo l'eclosione. Possono essere utilizzati sia maschi che femmine, poiché le camere di imaging sono realizzate su misura per adattarsi a entrambi i sessi.

2. Costruzione di un aspiratore (flusso di lavoro di 5 minuti)

  1. Taglia un tubo di silicone da 6 mm a circa 8 pollici di lunghezza usando una lama di rasoio. Prendi un puntale per pipetta p200 e tagliane circa la metà usando una lama di rasoio per il boccaglio (Figura 1A). Inserire la punta tagliata nel tubo. Tagliare la punta di una pipetta p1000 in modo che una mosca possa attraversarla.
  2. Prendi un piccolo pezzo di cotone e copri il tubo in silicone. Questo per evitare che la mosca aspiri nella bocca dello sperimentatore. Posizionare la punta p1000 tagliata sul tubo rivestito in cotone.
  3. Coprire il puntale della pipetta p1000 con un nuovo puntale della pipetta p200. Per determinare la lunghezza appropriata per il taglio del puntale della pipetta p200, rimuovere innanzitutto il puntale della pipetta p200 e aspirare una mosca nel puntale della pipetta p1000. Riattaccare la punta p200. Soffia delicatamente e picchietta la mosca per spostarla il più possibile nella punta p200.
    1. Una volta che non può più avanzare ulteriormente, usa un microscopio da dissezione per segnare il punto in cui finisce la testa della mosca e inizia il torace, usando una lama di rasoio. Aspirare nuovamente la patta nel puntale della pipetta p1000 e tagliare il puntale della pipetta p200 nella posizione contrassegnata.

3. Costruzione dell'aspiratore a proboscide in tubi metallici (flusso di lavoro da 5 a 10 minuti)

  1. Tagliare il tubo metallico ipodermico calibro 22X alla dimensione desiderata (~10 cm) utilizzando gli strumenti Dremel e una lama diamantata. Lucidare le estremità dei tubi metallici con un disco da taglio Dremel 420 per creare un'apertura liscia e pulita. Questa apertura ospiterà la proboscide della mosca.
  2. Avvolgere il tubo attorno a una provetta da centrifuga da 15 ml per ottenere la forma curva desiderata (Figura 1A). La curva dovrebbe creare una forma simile a un uncino che permetta al corpo della mosca di essere in linea con la camera.
  3. Tagliare un pezzo (~7 cm di lunghezza) del tubo metallico ipodermico calibro 12TW utilizzando gli strumenti Dremel (questo tubo deve essere inserito in un puntale per pipetta da 2 μl). Prendi un puntale per pipetta da 2 μl e taglia l'estremità usando una lama di rasoio per adattarla al tubo metallico calibro 22X. Inserire il tubo metallico più grande nell'altra estremità del puntale della pipetta da 2 μl.
  4. Mescola insieme una piccola quantità di resina e un indurente di colla epossidica. Applicare la miscela nel punto in cui il piccolo tubo metallico incontra il puntale della pipetta e nel punto in cui il tubo metallico più grande si collega al puntale della pipetta. Lasciare che l'adesivo si indurisca completamente durante la notte prima di collegare il gruppo a un supporto su un micromanipolatore. Regolare l'angolazione secondo necessità.

4. Costruzione di una pipetta per l'erogazione di urti e odori per esperimenti di apprendimento e memoria al microscopio (flusso di lavoro di 10 minuti)

  1. Utilizzando un utensile diamantato Dremel, tagliare 1 mL in una pipetta di vetro 1/100 alla tacca di 3 mL. Taglia un piccolo pezzo rettangolare di lastra acrilica con dimensioni 24,5 mm x 8 mm e uno spessore di 1/8 di pollice.
    NOTA: In alternativa, questo pezzo può essere stampato in 3D per adattarsi meglio alla griglia antiurto (i file stl e obj possono essere trovati nel file supplementare 1 e nel file supplementare 2).
  2. Tagliare la griglia antiurto in rame per adattarla al pezzo acrilico rettangolare del passaggio precedente. Saldare due fili elettrici alle estremità opposte della griglia di rame. Posiziona la griglia di rame nel pezzo rettangolare in acrilico e curvala in modo che l'addome e le zampe della mosca si adattino alla griglia antiurto (Figura 1I).
  3. Fissare la griglia di rame alla plastica rettangolare usando un pezzo di nastro isolante. Utilizzando una pistola per colla a caldo, fissare saldamente la pipetta di vetro alla griglia antiurto, assicurandosi che sia diritta e correttamente centrata. Utilizzando un multimetro digitale, verifica che la griglia di rame stia funzionando per erogare efficacemente una scossa alle zampe della mosca.

5. Assemblaggio della resistenza al platino per la fusione della colla (acido miristico) (flusso di lavoro di 20 minuti)

  1. Utilizzando gli spelafili, tagliare 200 mm di fili alla lunghezza desiderata e spellare un'estremità di entrambi i fili. Tagliate circa 60 mm di filo di platino (questa lunghezza dovrebbe essere sufficiente per creare un anello che servirà per sciogliere la colla).
  2. Utilizzando una pistola saldante, saldare un'estremità del filo di platino al cavo elettrico. Far passare una guaina termorestringente attraverso il cavo elettrico e utilizzare un bruciatore Bunsen per restringere la guaina sul filo per coprire le parti saldate.
  3. Tagliare due pezzi da 20 mm del tubo di gomma con diametro interno da 2,55 mm e farli passare attraverso il filo di platino (mantenere il filo di platino dritto per facilitare questo processo). Utilizzare la pistola di saldatura per saldare l'altra estremità del filo di platino all'altro filo elettrico. Utilizzare una nuova guaina termorestringente per coprire questa nuova parte saldata.
  4. Rimuovere lo stantuffo di una siringa BD tb da 1 ml e far passare i fili dei passaggi precedenti attraverso il cilindro. Il platino dovrebbe sporgere dall'estremità del cilindro della siringa. Non dovrebbero esserci fili scoperti e il piccolo tubo di gomma dovrebbe coprire il filo di platino tranne che fino all'estremità.
  5. Usando una spelafili, spellare una piccola quantità di entrambe le altre estremità dei cavi elettrici. Usando una pistola saldante, saldare ogni filo a una spina a banana finché non è collegato saldamente.
  6. Utilizzare la colla epossidica per incollare la parte superiore e la base del cilindro della siringa per incollare insieme i fili e il cilindro; Ciò eviterà la tensione ai fili all'interno della siringa e garantirà una maggiore durata del resistore. Lascia che la colla si indurisca durante la notte.
  7. Collegare il resistore finito all'alimentazione CC.

6. Costruzione della camera di registrazione - (flusso di lavoro di 2 giorni)

  1. Dopo il file supplementare 3, è stato tagliato al laser un foglio di spessore nero (spessore 0,0125 pollici). La dimensione dell'apertura al centro della camera può essere modificata per adattarsi alle dimensioni delle mosche (la dimensione nella lima generalmente si adatta a femmine e maschi).
  2. Prendi un vetrino da microscopio in vetro che servirà come base della camera. Mescolare resina ed epossidica insieme. Prendi la camera in acrilico nero e, utilizzando la colla epossidica, attacca i magneti di neodimio 3 mm x 2 mm su tutti e quattro gli angoli. Si consiglia di incollare un magnete alla volta e di tenerlo premuto mentre la colla si asciuga con una graffetta.
  3. Posiziona due nuovi magneti su ciascuno dei magneti precedentemente incollati sulla camera. Usando la resina epossidica, incolla l'ultimo magnete attaccato a un vetrino e usa le graffette per tenerlo in posizione durante la cura.
    NOTA: Dopo che la colla è stata polimerizzata, la camera è completa ed è possibile aggiungere altri magneti per regolare l'altezza della camera per gli esperimenti. Il file supplementare 4, il file supplementare 5 e il file supplementare 6 mostrano la camera di registrazione assemblata.

7. Protocollo di dissezione in vivo senza anestesia - (flusso di lavoro da 5 a 7 minuti)

  1. Rimuovere il puntale della pipetta p200 dall'aspiratore. Inserire l'aspiratore nella fiala e aspirare una singola mosca nel puntale della pipetta p1000. Riposizionare il puntale della pipetta p200 sull'aspiratore. Soffiare delicatamente e muovere l'aspiratore in modo che la mosca sia immobilizzata nella parte superiore del puntale della pipetta p200, a testa in giù.
  2. Posizionare la camera di dissezione sul supporto del manipolatore. Collegare il vuoto al tubo portamosche e regolare il livello di flusso secondo necessità (~500 mL/min). Utilizzare un connettore rapido per collegare-scollegare facilmente e rapidamente l'aspirapolvere (Figura 1A).
  3. Spostare il tubo metallico a vuoto per centrarlo nel campo visivo quando si guarda attraverso il microscopio. Verificare che la camera sia posizionata correttamente in modo che vada direttamente sopra il tubo metallico quando è pronta per incollare la mosca. Aspirare delicatamente la proboscide della mosca nel supporto del vuoto (Figura 1A).
  4. Una volta che la mosca è nella posizione corretta, spostare il manipolatore in modo che la testa della mosca sia allineata con l'apertura della camera.
  5. Accendere l'alimentazione CC. La corrente deve essere impostata in modo da essere compresa tra 0,40 e 0,50 Ampere. Correnti più elevate possono causare la fusione dell'acido miristico fino al punto in cui la sua viscosità diventa troppo bassa, aumentando il rischio che la colla si diffonda sulla testa della mosca.
  6. Usando la resistenza al platino, incollare i lati degli occhi e del torace alla camera usando acido miristico fuso (Figura 1B). Per evitare di sporcare la cuticola della testa, utilizzare meno colla possibile, soprattutto quando si incollano i lati degli occhi.
  7. Una volta incollati gli occhi e il torace, scollegare il tubo del vuoto e utilizzare il manipolatore per rimuovere la camera di registrazione dal tubo del vuoto. Capovolgere la camera e utilizzare la resistenza al platino per incollare la proboscide dal basso (Figura 1C). Incollare gli occhi dal basso è facoltativo e può aiutare a mantenere la mosca in posizione durante la dissezione, ma non è necessario.
  8. Una volta incollato tutto, spegnere l'alimentazione CC, capovolgere la camera in posizione verticale e fissarla alla base laterale in vetro. Taglia un piccolo pezzo di nastro adesivo usando le forbici e applicalo proprio davanti e dietro la testa della mosca (Figura 1D).
  9. Ruotare la camera in modo che la testa sia rivolta verso lo sperimentatore a 90. Utilizzando un ago da dissezione, praticare un taglio verticale lungo i lati degli occhi (Figura 1E). Ruotare la camera in modo che sia posizionata orizzontalmente. Usando l'ago da dissezione, tagliare trasversalmente la cuticola (Figura 1E).
    NOTA: Assicurarsi che la "finestra" della cuticola appena creata possa essere sollevata utilizzando l'ago da dissezione. Se si solleva senza alcuna resistenza, riposizionare l'ago da dissezione sul suo coperchio. La soluzione salina non viene utilizzata nei passaggi 13 e 14 per prevenire la rifrazione della luce, che potrebbe ostruire una visione chiara durante i tagli.
  10. Aggiungere 100 μL di soluzione fisiologica alla parte superiore della testa della mosca (Figura 1F). Utilizzando una pinza affilata, rimuovere con cautela la finestra (Figura 1G). Usando le pinze affilate, rimuovere con cura il grasso o la trachea rimanenti. Il cervello dovrebbe essere pronto per l'imaging ora (Figura 1H-1J).

8. Visualizzazione della plasticità indotta dall'apprendimento attraverso il condizionamento olfattivo avversivo (flusso di lavoro di 20 minuti)

  1. Utilizzando un microscopio confocale dotato di un laser e di un obiettivo a immersione in acqua, posizionare la mosca preparata sul tavolino del microscopio. Facoltativamente, usa una fotocamera con un obiettivo macro per mettere a fuoco la mosca, assicurandoti che la mosca sia sana e in movimento.
  2. Regolare la posizione della griglia d'urto/pipetta per odori utilizzando un micromanipolatore in modo che la mosca sia posizionata sulla griglia d'urto.
    NOTA: La mosca dovrebbe essere ancora in grado di muoversi liberamente poiché la griglia d'urto tocca appena le gambe e leggermente l'addome (la mosca dovrebbe essere in grado di rimuovere le zampe e l'addome dalla griglia se retratta). La pipetta per l'erogazione degli odori deve essere diretta verso le antenne della mosca.
  3. Utilizzando la manopola di regolazione Z grossolana, eseguire la scansione attraverso l'asse Z del cervello e individuare la regione cerebrale di interesse. Regola le dimensioni della cornice a 512 x 512 px. La frequenza di scansione deve essere regolata alla velocità desiderata, con un minimo di 2 Hz. Infine, imposta la durata della registrazione.
  4. Iniziare a registrare il neurone di interesse utilizzando un sistema di erogazione degli odori su misura o commerciale e avviare contemporaneamente un'erogazione di odori "pre-addestramento" (Figura 2C). Impostare la registrazione su 2 min. La presentazione degli odori pre-allenamento inizia registrando le risposte a un primo impulso di odore (CS-) di 5 secondi seguito da un secondo impulso di odore di 5 s (CS+) con un intervallo interstimoli di 30 secondi.
  5. Dopo aver raccolto le risposte pre-allenamento, attendere 5 minuti prima di avviare un protocollo di allenamento nel sistema di erogazione degli odori. Per questo esempio, durante la formazione è stato presentato solo il CS+. L'odore CS+ viene presentato per 1 minuto, iniziato a 30 s dopo l'attivazione del sistema di erogazione dell'odore. Lo stimolatore d'urto è programmato per erogare contemporaneamente scariche da 12, 90 V mentre viene presentato l'odore.
  6. Dopo l'allenamento, attendere 5 minuti o 15 minuti prima di ottenere risposte post-allenamento. Registra le risposte post-allenamento nello stesso modo in cui sono state registrate le risposte pre-allenamento nel passaggio 6. Salvare tutti i file nel formato appropriato per la successiva analisi dell'immagine.

9. Analisi delle immagini

  1. Per analizzare le registrazioni, disegna una regione di interesse (ROI) attorno all'area del neurone. Questo dovrebbe essere il più preciso possibile per limitare l'influenza della fluorescenza di fondo.
  2. Utilizza lo strumento di misurazione per estrarre i dati sull'intensità media della fluorescenza all'interno del ROI per ogni fotogramma della registrazione. Esporta questi dati come file CSV.
  3. Apri i dati in MATLAB o in qualsiasi programma di analisi dei dati per calcolare i valori ΔF/Fo per ogni traccia di odore. Combina i dati per ottenere le registrazioni medie ΔF/Fo complessive delle singole mosche e crea un grafico delle tracce medie di risposta agli odori prima e dopo l'addestramento (Figura 2E, F).

Risultati

Qui, l'imaging in vivo di Drosophila adulta senza anestesia viene utilizzato per studiare il condizionamento olfattivo avversivo che induce plasticità in un neurone di uscita del corpo a fungo ben caratterizzato (MBON γ2α'1)12. L'indicatore di calcio GCaMP6f2, insieme alla proteina fluorescente rossa TdTom, sono espressi in un neurone di uscita MB, i cui dendriti innervano il compartimento del γ MB e dei lobi di α ed è geneticamente mirato al MBON γ2α'1 utilizzando la linea split-Gal4 MB077C34 (Figura 2A, B).

Per osservare la plasticità dopo il condizionamento olfattivo avversivo, la mosca viene posta sotto il microscopio confocale, con l'addome e le zampe allineati al centro della griglia d'urto e la pipetta per l'erogazione degli odori puntata verso l'antenna della mosca. In primo luogo, le risposte all'odore di calcio sono state registrate a un impulso di 5 s di 4-metilcicloesanolo (MCH) seguito da un impulso di 5 s di 3-ottanolo (OCT), separato da un intervallo interstimolo di 30 s. Cinque minuti dopo, i moscerini sono stati addestrati con la presentazione simultanea di un impulso OCT (CS+) di 1 minuto insieme a 12 scosse da 90 V. Questo programma di condizionamento associativo produce una robusta memoria avversa comportamentale. Infine, 5 minuti e 15 minuti dopo il condizionamento, le risposte del calcio a MCH e OCT sono state registrate come prima dell'allenamento. MBON γ2α'1 risponde in modo robusto con transitori di calcio sia a MCH che a OCT prima del condizionamento (Figura 2D-F). Tuttavia, in corrispondenza dei risultati precedenti12, le risposte di calcio post-condizionamento di 5 minuti a CS+ (OCT) sono completamente depresse (Figura 2D-F). Inoltre, le risposte al CS- (MCH) sono state significativamente potenziate. Quindici minuti dopo l'allenamento hanno mostrato risultati simili, poiché la risposta del calcio al CS+ era significativamente depressa e il CS- era potenziato. Questi risultati indicano che la traccia di memoria osservata in entrambi gli odori dura almeno 15 minuti (Figura 2D-F). Queste risposte sono state quantificate utilizzando la risposta media all'odore durante l'impulso di 5 s e confrontate all'interno del moscerino. Questi cambiamenti nelle risposte agli odori possono anche essere visualizzati da una rappresentazione pseudo-cromatica del cambiamento nella fluorescenza GCaMP6 pre e post-allenamento avversivo (Figura 2E). Al contrario, l'anestetizzazione della mosca durante la preparazione mostra una ridotta plasticità sia per CS+ che per CS-. Negli animali anestetizzati si osserva solo una depressione parziale a CS+, poiché le risposte post-allenamento sono ancora presenti. Inoltre, le risposte CS- non sono significativamente diverse dopo l'addestramento (Figura 2G, H). Per osservare meglio ciò, abbiamo calcolato la plasticità indotta come il rapporto tra CS+/CS- e abbiamo dimostrato che i moscerini non anestetizzati mostrano una plasticità significativamente maggiore rispetto agli animali anestetizzati (Figura 2I). Questi risultati rappresentativi indicano che questo protocollo è adatto per studiare l'apprendimento e la memoria al microscopio e garantisce la salute della mosca durante l'imaging dai neuroni per un lungo periodo di tempo. Questo protocollo è abbastanza versatile e può essere applicato ad altri tipi di imaging in vivo e ad altri neuroni di interesse.

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Figura 1: Preparazione per l'imaging in vivo di Drosophila senza l'uso di anestesia. (A) Pannello superiore: Diagramma che illustra le fasi coinvolte nella preparazione dell'aspiratore. Pannello inferiore: Diagramma che mostra la camera contenuta in un micromanipolatore durante il posizionamento al volo. La proboscide della mosca viene posta all'apertura di un tubo metallico collegato a un vuoto a 500 mL/min tramite un aspiratore. La camera viene successivamente posizionata sopra la mosca. (B) I lati degli occhi e del torace sono incollati con acido miristico utilizzando un resistore al platino su misura. (C) La proboscide della mosca viene rimossa dal tubo metallico e la camera viene invertita per consentire l'incollaggio della proboscide in posizione, riducendo così al minimo il movimento durante le registrazioni. (D) La camera è fissata a una base di vetrini. Il nastro adesivo viene applicato sulla parte superiore della camera, coprendo le antenne, e sul lato posteriore per evitare perdite di soluzione salina. (E) Due tagli verticali vengono eseguiti lungo la cuticola vicino agli occhi composti, seguiti da un terzo taglio attraverso la cuticola vicino al torace, creando una "finestra" sul cervello. (F) Tra 100-200 μl di soluzione salina vengono aggiunti alla testa della mosca nel sito dei tagli. (G) La finestra della cuticola viene sollevata, tirata e staccata utilizzando una pinza affilata e sottile per esporre il cervello. (H) Il grasso e il tessuto tracheale vengono rimossi per consentire una chiara visualizzazione delle cellule cerebrali al microscopio. (I) La mosca preparata viene posta al microscopio e posizionata con il corpo allineato sopra la griglia d'urto. (J) Immagine pseudo-colore che mostra il modello di espressione di MBON γ2α′1. La regione di interesse è delineata da una linea tratteggiata che circonda il pergolato dendritico. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Plasticità indotta dall'apprendimento in MBON γ2α′1 dopo condizionamento olfattivo avversivo. (A) Pattern di espressione del driver MB077C-splitGal4 che esprime GCaMP. I cervelli sono stati sezionati e colorati con anti-GFP e controcolorati con anti-nc82. Barra della scala: 50 μm. (B) Immagine pseudo-colore di MBON γ2α′1 che evidenzia il corpo cellulare, il processo di estensione e l'albero dendritico. La regione dendritica rappresenta l'area da cui sono state raccolte le risposte al calcio. Barra della scala: 50 μm. (C) Schema del protocollo di allenamento avversivo. I moscerini sono stati esposti a impulsi di 5 secondi di MCH e OCT con 30 secondi di aria pulita in mezzo. Dopo un intervallo di 5 minuti, i moscerini sono stati addestrati ad associare l'OCT a dodici scosse elettriche da 90 V. Le registrazioni delle risposte del calcio a MCH e OCT sono state eseguite 5 minuti e 15 minuti dopo l'allenamento. (D) Le tracce di risposta agli odori a MCH (pannello superiore) e OCT (pannello inferiore) vengono mostrate per il pre-allenamento e a 5 minuti e 15 minuti dopo l'allenamento. Spesse barre nere indicano i tempi di presentazione degli odori. (E) Immagini pseudo-a colori dell'albero dendritico di MBON γ2α′1 prima dell'allenamento e 5 minuti e 15 minuti dopo l'allenamento, in risposta sia a MCH che a OCT. Il potenziamento della fluorescenza è osservato per il CS- (MCH), mentre la fluorescenza è abolita per il CS+ (OCT). Barra della scala: 20 μm. (F) La risposta media dell'odore all'MCH è significativamente potenziata a 5 minuti e 15 minuti dopo l'allenamento, mentre le risposte all'OCT (CS+) sono significativamente soppresse. Test accoppiato di Wilcoxon non parametrico, N = 12. (G) Le tracce di risposta agli odori a MCH (pannello superiore) e OCT (pannello inferiore) sono mostrate per i moscerini anestetizzati prima e 5 minuti dopo l'allenamento. Le spesse barre nere indicano l'erogazione degli odori. (H) Negli animali anestetizzati, le risposte medie agli odori all'MCH non mostrano un potenziamento significativo dopo l'addestramento e le risposte all'OCT mostrano solo una soppressione parziale rispetto agli animali non anestetizzati. (I) La plasticità indotta dall'allenamento, calcolata come rapporto CS+/CS-, è significativamente più bassa nei moscerini anestetizzati rispetto a quelli preparati senza anestesia. Test accoppiato di Wilcoxon non parametrico, N = 8-12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo supplementare 1: Grid_holder (STL). File STL del componente progettato su misura utilizzato per sostenere la rete elettrica. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: Grid_holder (OBJ). File OBJ del componente progettato su misura utilizzato per sostenere la rete elettrica. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 3: Chamber_LaserCut. File Adobe Illustrator utilizzato per il taglio laser del componente superiore delle camere di registrazione sia per i moscerini maschi che per quelli femmine. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 4: Recording_chamber (STL). File STL della camera di registrazione progettata su misura. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 5: Recording_chamber (OBJ). File OBJ della camera di registrazione progettata su misura. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 6: Recording_chamber_animation. Video MP4 che mostra un'animazione della camera di registrazione assemblata. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Comprendere i circuiti neurali alla base dell'apprendimento e della memoria è un obiettivo centrale nel campo delle neuroscienze. Il kit di strumenti genetici disponibili in Drosophila, combinato con la semplicità e la versatilità dei test comportamentali, lo rende un organismo modello ideale per lo studio di questi processi. Studi pubblicati da vari laboratori hanno descritto diversi protocolli per la preparazione dei moscerini per l'imaging funzionale senza l'uso di anestesia44,45. Tuttavia, questi protocolli variano notevolmente e spesso si basano su strumenti altamente specializzati e personalizzati con indicazioni limitate su come costruirli o utilizzarli. In questo protocollo, viene presentato un metodo per eseguire l'imaging funzionale in vivo nei moscerini che evita gli effetti confondenti dell'anestesia generale. Inoltre, questo approccio consente di catturare l'attività neuronale in tempo reale all'interno della stessa mosca, consentendo confronti diretti delle risposte neurali prima e dopo l'esposizione a vari stimoli.

Quando si completa questo protocollo, i passaggi critici includono assicurarsi che la proboscide della mosca sia posizionata correttamente nel tubo del vuoto. Questo passaggio garantisce che l'incollaggio successivo avvenga nei punti giusti e assicura che la testa sia all'angolazione corretta per visualizzare i neuroni di interesse. L'applicazione minima di colla è essenziale per mantenere la salute della mosca; L'ideale è utilizzare la quantità minima necessaria per fissare la mosca in posizione. Questo protocollo consente anche alcune modifiche per soddisfare esigenze specifiche, come incollare solo i lati degli occhi in modo che l'intero corpo sia libero. Allo stesso modo, una camera di perfusione può essere fissata alla parte superiore della camera di registrazione per facilitare la perfusione con suoneria o la somministrazione di farmaci. Infine, un tapis roulant flottante rotante può essere posizionato sotto la mosca come precedentemente riportato, consentendo l'analisi della direzionalità della locomozione46,47.

Questo protocollo ha alcune limitazioni, tra cui lo stress a cui sono sottoposte le mosche durante la microchirurgia per preparare le mosche all'imaging dal vivo. Maneggiare le piccole mosche, applicare la colla con parsimonia e aprire con cura la capsula della testa senza danneggiare il tessuto cerebrale o il corpo richiede una notevole esperienza, che può essere acquisita solo attraverso una pratica meticolosa e la ripetizione. Sebbene questo metodo sia particolarmente utile per lo studio dei processi cognitivi a livello cellulare, l'imaging in vivo presenta ancora alcune limitazioni rispetto alle registrazioni elettrofisiologiche. Inoltre, mentre il nostro protocollo evita l'uso dell'anestesia prima dell'imaging, il moscerino è ancora vincolato a una camera fisica, che può sempre alterare le risposte cellulari. Tuttavia, la nostra metodologia fornisce il modo più vicino per preservare la salute della mosca per un imaging ottimale in vivo . Rispetto ai metodi esistenti che utilizzano l'anestesia e limitano la mosca, il nostro metodo mira a mantenere la mosca il più liberamente possibile in movimento, pur essendo in grado di visualizzare le cellule con un movimento minimo.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institute for General Medical Science per 1R01GM147917-01A1 e dalla Brain and Behavior Research Foundation per 30442.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filo di platino da 0,102 mmSurepure Chemetals2690
0,25 OD, 0,125 ID, tubo in silicone polimerizzato al platinoVWR89068-474
0,3 mm ID Tubo in silicone Fisher Scientific11-189-14
Spine a bananaAmazon
Foglio acrilico nero per camera 0,0125 polliciPrecision Brand44250
Cloruro di calcioSigma-Aldrich746495
Griglia d'urto in rame Alimentatoresu misura
per resistore al platinoFisher ScientificS35740
Utensile Dremel 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; UAS-GCAMP6F;BDSC42747Questa linea uas è stata combinata con ;; uas-td-tom per generare un ceppo contenente entrambe le inserzioni
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Colla epossidica Gorilla4200102
Misuratore di portata del gas 1,5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
Glass 1 mL pipetta sierologica Fisher Scientific50-232-9516
VetriniFisher Scientific12-550-A3
GlucosioSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Tubo ipodermico 12TWMicrogruppo316H12TW
Tubo ipodermico 22XMicrogruppo304H22X
Cloruro di magnesio esaidratoSigma-AldrichM9272
Acido MiristicoAcros Organics156961000
Magneti Neodimio 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
punte P1000Genesee Scientific 23-165RL
P200 punteGenesee Scientific 23-150RL
Connettore a spinta pneumatico 6mm OD AmazonB07ZHG8Y1Y
Cloruro di potassioSigma-AldrichP3911
Tubo in PTFE 6mm ODLame
 AmazonB08LYD6645
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761
Cloruro di sodioFisher ScientificS271-500
Fosfato di sodio bibasicoSigma-AldrichS0876
SaccarosioSigma-AldrichS9378
TrealosioSigma-AldrichT0167
CC di rasoio Amazon

Riferimenti

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