Visualizzazione a raggi X dell'infusione ablativa intraduttale a base di etanolo per la prevenzione del cancro al seno in modelli di coniglio

Sommario

Questo protocollo presenta una procedura per l'infusione guidata da immagini nel sistema dell'albero duttale della ghiandola mammaria del coniglio. Dimostriamo l'infusione controllata di una soluzione ablativa a base di etanolo contenente un agente di contrasto a raggi X in tutte le aperture dei capezzoli mediante imaging in fluoroscopia in tempo reale.

Abstract

Il cancro al seno è la seconda causa di morte correlata al cancro nelle donne. Mentre ci sono pochi interventi proattivi per le donne a rischio medio, la mastectomia profilattica è l'intervento più efficace e che riduce il rischio per le donne ad alto rischio. Tuttavia, la mastectomia profilattica è una procedura invasiva che rimuove tutte le cellule epiteliali mammarie insieme allo stroma, al tessuto adiposo e/o alla muscolatura circostanti. Il nostro obiettivo generale di ricerca è quello di sviluppare una procedura di somministrazione intraduttale (ID) non invasiva che uccida localmente le cellule epiteliali mammarie riempiendo l'intero albero duttale con una soluzione ablativa. Abbiamo precedentemente dimostrato che la somministrazione di etanolo come soluzione ablativa è efficace nei modelli di roditori (topi e ratti). Questo protocollo presenta una somministrazione ID di una soluzione di etanolo al 10-70% contenente ioesolo (90-300 mg/mL) come agente di contrasto a raggi X nel sistema ad albero multiduttale della ghiandola mammaria del coniglio. La ghiandola mammaria di un coniglio (Oryctolagus cuniculus) con un sistema multi-condotto è più simile al petto umano rispetto a quelle di altri animali di grandi dimensioni (ad esempio, mucche, pecore). Questo protocollo rabbit affronta le sfide tecniche di scalabilità, imaging in tempo reale e consegna di ID in un sistema ad albero multiduttale in un modello intermedio di grandi animali. Questo protocollo stabilisce una somministrazione di ID multi-condotto guidata dalla fluoroscopia con strumenti, materiali e reagenti che potrebbero essere applicati direttamente in clinica. L'analisi dei tessuti consente di ottimizzare la concentrazione di etanolo per la massima ablazione epiteliale e il minimo danno tissutale collaterale come punto di partenza per la futura valutazione prima nell'uomo di questa procedura ablativa per la prevenzione primaria del cancro al seno.

Introduzione

Il cancro al seno (BC) è il più comune e il secondo più alto decesso correlato al cancro per le donne negli Stati Uniti. Le proiezioni per il 2025 stimano che ci saranno 316.950 nuovi tumori al seno e 42.170 donne moriranno di BC¹. Attualmente, la mastectomia profilattica bilaterale è la procedura più efficace per prevenire la BC. Tuttavia, si tratta di una procedura altamente invasiva che comporta una rimozione completa delle cellule epiteliali, da cui origina il carcinoma mammario, e del tessuto circostante. A causa della sua invasività e dell'impatto psicologico e sociale di questa procedura, meno del 50% delle donne ad alto rischio si sottopone a mastectomia per ridurre il rischio². Noi, e altri, abbiamo sviluppato procedure di somministrazione intraduttale (ID) per la prevenzione primaria e/o il trattamento locale del cancro al seno in modelli di roditori ^2,3 come alternativa alle attuali prevenzioni e trattamenti. L'etanolo (EtOH) ha un basso profilo di tossicità e sicurezza ben consolidato e viene utilizzato in molteplici applicazioni cliniche, come agenti sclerosanti per il trattamento di malformazioni venose e come agente ablativo per il trattamento locale di alcuni tumori³. In genere, diversi millilitri di EtOH vengono infusi o erogati al 90-100% di concentrazione in queste procedure cliniche. Nel nostro lavoro precedente, la somministrazione del 70% di EtOH direttamente nel sistema dell'albero duttale di modelli murini e di ratto è stata efficace nell'ablazione chimica delle cellule epiteliali mammarie con danni limitati al tessuto normale adiacente e nel prevenire la formazione di tumori al seno 4,5,6,7. Poiché questa procedura viene estesa al sistema ad albero duttale più grande di un coniglio con un rapporto tra volume luminale e superficie delle cellule epiteliali luminali più grande, esploriamo le proprietà ablative di una soluzione con una percentuale inferiore di EtOH (dal 10% al 70%). Osservando la traduzione clinica, riteniamo che la percentuale più bassa di etanolo efficace nell'ablazione delle cellule epiteliali sarà la più ben tollerata e avrà il miglior profilo di sicurezza.

La conferma del completo riempimento dell'albero duttale è necessaria per garantire che la soluzione ablativa sia entrata in contatto diretto con le cellule epiteliali mammarie. Nei nostri studi precedenti su modelli di roditori, dopo la procedura è stata utilizzata la visualizzazione a raggi X dell'albero duttale infuso mediante imaging microCT. A causa del lasso di tempo necessario per anestetizzare, trasferire, impostare e posizionare l'animale per l'imaging, l'Omnipaque (iohexol) approvato dalla FDA o simili agenti di contrasto a diffusione rapida contenenti iodio non erano adatti per la visualizzazione dell'albero duttale nei roditori ^6,8. Abbiamo scoperto che gli agenti di contrasto basati su nanoparticelle, in particolare quelli contenenti nanocristalli di ossido di tantalio, si diffondevano più lentamente e erano più adatti per la visualizzazione dell'albero duttale nei roditori 6,7,8,9. Tuttavia, questa conferma a posteriori mediante imaging microCT non ci consente di monitorare o controllare la quantità di volume infuso e si discosta dalle procedure diagnostiche clinicamente stabilite, come la duttografia^10,11, per la visualizzazione dell'albero duttale. Pertanto, un passo fondamentale per stabilire la fattibilità tecnica della traduzione di questa procedura di identificazione nell'uomo è quello di dimostrare la visualizzazione in fluoroscopia in tempo reale dell'albero duttale infuso in un modello animale di dimensioni e complessità crescenti delle sue ghiandole mammarie. Questo protocollo estende questa procedura ablativa dai roditori ^4,5 ai modelli di coniglio. Evolutivamente, anatomicamente e fisiologicamente, le ghiandole mammarie del coniglio sono più simili ai seni umani che a quelle dei roditori o di altri modelli animali di grandi dimensioni, come mucche e pecore 12,13,14. Le femmine di coniglio hanno quattro paia di ghiandole mammarie, ciascuna contenente quattro alberi duttali, mentre i roditori hanno un solo albero duttale per ghiandola mammaria. I capezzoli di coniglio possono essere incannulati^15,16 utilizzando una procedura simile alla somministrazione ID dell'agente di contrasto nella duttografia clinica nella ricerca clinica first-in-human. Pertanto, i conigli forniscono un modello intermedio pratico e rilevante per l'applicazione traslazionale di questa procedura ablativa ID all'uomo. Questo protocollo affronta le sfide tecniche della consegna dell'ID e dell'imaging in vivo di un sistema di alberi multiduttali che non avrebbero potuto essere affrontate nei modelli di roditori. Questo protocollo utilizza strumenti, reagenti e materiali compatibili con l'attuale pratica clinica per la visualizzazione degli alberi duttali. Pertanto, la procedura descritta per l'infusione guidata dalla fluoroscopia di una soluzione ablativa a base di etanolo contenente iohexol potrebbe essere prontamente implementata e valutata nei primi studi clinici sull'uomo.

Questo metodo è stato implementato nel nostro laboratorio per incannulare e infondere in sequenza tutti e quattro gli alberi duttali di una o più ghiandole mammarie in un coniglio, in un'unica sessione, con una soluzione ablativa a base di etanolo contenente un agente di contrasto (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Questo metodo prevede l'infusione della soluzione ablativa direttamente nell'apertura del capezzolo cannulato con un ago a punta smussata da 27 G di un coniglio (vergine di 4 mesi) su un tavolo fluoroscopico. Questa procedura viene eseguita su un animale in anestesia generale (isoflurano) con trattamento antinfiammatorio peri e post-procedura (ketoprofene, farmaco antinfiammatorio non steroideo). L'imaging fluoroscopico ci consente di monitorare il riempimento dell'albero duttale in tempo reale, di controllare la velocità e la quantità di volume dispensato e/o di determinare il successo della consegna dell'ID in ogni singolo sistema ad albero (Figure 1, Figura 2, Figura 3). Questa tecnica di fluoroscopia si avvicina più da vicino all'applicazione clinica prevista per la guida per immagini del trattamento ablativo e può aiutare a limitare la dose complessiva di radiazioni imposta al paziente. Questo protocollo dimostra che l'Omnipaque (iohexol) approvato dalla FDA è un mezzo di contrasto adatto per visualizzare il riempimento iniziale dell'albero duttale del coniglio (Figura 3). Le osservazioni mediante esame macroscopico e analisi istologica mostrano che una concentrazione di etanolo del 70% provoca un rapido danno tissutale all'interno e all'esterno dell'albero duttale e si estende oltre la struttura della ghiandola mammaria (Figura 3). Una concentrazione di etanolo nell'intervallo 10-40% fornisce un'adeguata ablazione delle cellule epiteliali con un danno tissutale collaterale inferiore rispetto all'etanolo al 70% (Figura 4). Saranno necessari studi longitudinali che utilizzano questa procedura con dimensioni di gruppo adeguatamente potenziate per soluzione ablativa e raccolte di tessuti temporizzate per stabilire i parametri ottimali della soluzione ablativa per la sua valutazione clinica nei pazienti umani.

Protocollo

Tutti gli esperimenti descritti sono stati condotti secondo i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Michigan State University. I conigli (Oryctolagus cuniculus) sono stati curati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e l'USDA Animal Welfare Act in una struttura accreditata AAALAC.

NOTA: Questo metodo è stato condotto su animali bianchi neozelandesi vergini (nullipare) e riproduttori in pensione (pluripari) di età (da 4 mesi a > 1 anno) e peso (da 2,6 a 4,2 kg) acquisiti da fonti commerciali. Nella nostra esperienza, la taglia dell'animale determinata dal peso è più affidabile dell'età dell'animale per prevedere la dimensione dei capezzoli. Generalmente, gli animali che pesano più di 3,3 kg presentano capezzoli adatti per l'incannulamento. Il protocollo descritto di seguito si concentra su animali vergini di 4-5 mesi di età e un peso superiore a 3,3 kg, poiché sono più appropriati per studi a lungo termine di efficacia, guarigione delle ferite, tossicità e sicurezza.

1. Preparazione preoperatoria

1. Acclimatare gli animali nella nuova struttura per almeno 1 settimana all'arrivo, in particolare per gli animali destinati a procedure di recupero e studi a lungo termine. Durante questa prima settimana, monitora/controlla i conigli ogni giorno e fornisci bocconcini, arricchimento nutrizionale come raccomandato dalle linee guida istituzionali, per aiutare con il processo di acclimatazione.
2. Acquisisci il coniglio (~ 4 mesi New Zealand White) dalla struttura abitativa approvata. Registrare il peso corporeo prima della procedura.
   NOTA: Il peso corporeo può essere registrato il giorno prima della procedura per preparare i calcoli necessari per l'anestesia. Possono essere utilizzati anche riproduttori in pensione (> 1 anno di età, > 3,5 kg) in quanto hanno capezzoli più grandi e consentono una più facile incannulamento dei singoli dotti (Figura 3). Per questi motivi, gli allevatori in pensione possono essere utilizzati negli esperimenti iniziali per familiarizzare e ottimizzare la procedura intraduttale.
3. Iniettare 35 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina per via intramuscolare 20 minuti prima della somministrazione di isoflurano per sedare l'animale.
   NOTA: L'anestesia viene somministrata in base al peso del coniglio e gli intervalli per ciascun farmaco sono i seguenti: 15-35 mg/kg per la ketamina e 2-5 mg/kg per la xilazina. Assicurarsi che l'animale sia sedato prima di passare alla depilazione e all'intubazione. Questo è per il benessere e la sicurezza degli animali e del personale. Dopo la conferma della sedazione, il coniglio può essere posizionato dorsalmente sul tavolo operatorio/di imaging.
4. Iniettare 5 mg/kg di ketoprofene per via sottocutanea per analgesia dopo che sono stati mostrati segni clinici di sedazione (ad esempio, comportamento tranquillo e occhi parzialmente chiusi e di colore rosa).
   NOTA: L'analgesia viene somministrata in base al peso del coniglio e l'intervallo per il ketoprofene è di 2-5 mg/kg.
5. Intubare il coniglio con l'attrezzatura appropriata (ad es. tubo endotracheale o dispositivo per le vie aeree sopraglottiche) e collegarlo a una macchina per isoflurano (1-2% di isoflurano, 1,0 L/min di ossigeno) che è stata adeguatamente testata e certificata per anestetizzare il coniglio. Monitorare attentamente la respirazione dell'animale per assicurarsi che l'anestesia sia mantenuta all'1-2% di isoflurano. Monitorare il coniglio per la saturazione di ossigeno tramite SpO₂, frequenza cardiaca, frequenza respiratoria e temperatura durante tutta la procedura.
   NOTA: La dimensione del tubo di intubazione si basa sul peso e sulle dimensioni del coniglio. Tuttavia, la gamma di taglie non è sempre accurata, quindi è utile avere una varietà di taglie per vedere quale si adatta meglio a quel particolare coniglio. Una maschera a cono di muso può essere utilizzata anche al posto di un tubo endotracheale per scopi anestesiologici¹⁷, essendo consapevoli che questa maschera non fornisce protezione delle vie aeree dell'animale offerta dall'intubazione. Le coperte di circolazione dell'acqua calda (coperte riscaldanti) impostate a 37°C vengono posizionate sotto gli asciugamani per mantenere la temperatura corporea del coniglio.
6. Posizionare e fissare un catetere venoso da 25 G nella vena marginale dell'orecchio per consentire la somministrazione di emergenza del farmaco.
   NOTA: È possibile utilizzare un intervallo di calibro da 24 a 26 a seconda delle dimensioni della vena del coniglio.
7. Applicare il lubrificante oculare su entrambi gli occhi per prevenire l'irritazione oculare e la secchezza corneale.
8. Rasare il pelo intorno al secondo e terzo paio di capezzoli con un rasoio elettrico. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per stendere la crema depilatoria sulla zona della tettarella. Lasciare che la crema entri in contatto con l'area per 15 s.
   NOTA: Prestare la massima attenzione per non danneggiare le tettarelle con il rasoio. Un aspirapolvere senza fili può essere utilizzato anche per aiutare a mantenere pulita un'area procedurale.
9. Inumidire una garza con soluzione fisiologica sterile e usarla per sciacquare la crema e sciogliere il pelo dall'animale dopo 15 s di applicazione della crema depilatoria. Verificare una buona visibilità e l'accesso all'area della tettarella da cui è stata rimossa la pelliccia. Ripetere se necessario.
   NOTA: La crema deve rimanere sul coniglio per il più breve intervallo possibile, tra 10 e 30 s e deve essere rimossa completamente per evitare ustioni chimiche alla pelle.

2. Infusione intraduttale

1. Preparare una soluzione ablativa mescolando volumi appropriati da soluzioni madre in condizioni sterili in una cappa per coltura tissutale BSL2.
   NOTA: Lo ioesolo (350 mg di iodio/mL) deve essere conservato in un'area buia a causa della sensibilità alla luce. Durante questo esperimento è stato utilizzato un intervallo di concentrazioni di EtOH. Per testare altre percentuali di EtOH, diluire le soluzioni madre alla concentrazione necessaria di soluzione ablativa. Per mantenere la stessa concentrazione di iodio in soluzione ablativa con diverse percentuali di EtOH, è possibile utilizzare PBS o acqua sterile per colmare la differenza di volume.
2. Per questo esempio, preparare una soluzione ablativa fresca di 10% di EtOH, 280 mg di iodio/mL di ioesolo, 1% di colorante alimentare in una provetta da 5 mL. Per un volume finale di 5 mL, aggiungere 4 mL di stock di iohexol (350 mg di Iodio/mL), 500 μL di 100% EtOH (200 proof), 450 μL di PBS, 50 μL di colorante alimentare blu stock.
   NOTA: Ogni albero duttale può essere riempito con un massimo di 400 μl, ma in genere 250-350 μl per animali di peso inferiore a 3,5 kg. Evans Blue fino allo 0,2% può essere utilizzato al posto del colorante alimentare. Evans Blue può essere l'opzione preferita se si intende effettuare analisi dell'intera montatura o altre analisi tissutali immediatamente dopo l'infusione.
3. Rimuovere la pelle morta che copre le aperture duttali con una pinza a punta fine.
   NOTA: I conigli possono avere un tappo cheratinizzato che sporge dal capezzolo che può impedire il successo dell'incannulamento se non viene rimosso. La lidocaina topica può anche essere applicata intorno alla tettarella per ridurre al minimo l'irritazione intorno al sito di iniezione (Tabella 1).
4. Pulire il sito di infusione con garze di clorexidina.
   NOTA: La clorexidina viene utilizzata come agente detergente per disinfettare il sito di iniezione prima dell'incannulamento (Tabella 1).
5. Inserire lo smusso di un ago da 28 G (lunghezza: 12,7 mm) nel lato della tettarella e iniettare lentamente 200 μl di soluzione fisiologica allo 0,9% a una velocità di 200 μl/min. Ciò consente una migliore visualizzazione delle aperture duttali.
   NOTA: Potrebbe non essere necessario iniettare tutti i 200 μL di soluzione salina nel capezzolo; Interrompere l'iniezione quando si vede la soluzione fisiologica fuoriuscire da una o più aperture duttali.
6. Aspirare 1 mL di soluzione ablativa preparata utilizzando una siringa Luer lock da 1 mL. Collegare la siringa all'estremità femmina, "alata" della linea di estensione maschio-femmina da 12 pollici. Collegare con cautela un ago a punta smussata da 27 G (lunghezza: 12,7 mm) all'estremità maschio della linea di prolunga. Adescare la linea con la soluzione. Pulisci l'ago con una garza imbevuta di alcol. Inoltre, fai attenzione a non inclinare la siringa con la soluzione ablativa in quanto ciò potrebbe causare la formazione di bolle d'aria.
   NOTA: Si tratta di volumi raccomandati per riempire completamente l'albero o gli alberi duttali: fino a 300 μL in ciascun albero e fino a 1,2 mL per ghiandola mammaria cervicale e/o inguinale (1^{° e 4° paio}), fino a 400 μL in ciascun albero e fino a 1,6 mL per ghiandole mammarie toraciche e/o addominali (2^° e 3^° paia). Per altre applicazioni, può essere opportuno utilizzare volumi più piccoli o più grandi in base ai requisiti sperimentali e/o alla guida della fluoroscopia per evitare un riempimento eccessivo dell'albero duttale. La linea di estensione consente un maggiore controllo della portata e l'infusione simultanea e l'imaging fluoroscopico dal vivo. Per confronto, i volumi raccomandati di infusione intraduttale nei modelli murini di 9-12 settimane di età⁴ sono: fino a 30 μL nella ghiandola mammaria cervicale e inguinale e fino a 50 μL nelle ghiandole mammarie toraciche e addominali, e nei modelli di ratto⁵: fino a 100 μL nella cervicale e inguinale e fino a 300 μL nelle ghiandole mammarie toraciche e addominali.
7. Utilizzare una lampada d'ingrandimento 10x per facilitare l'individuazione delle aperture duttali. Tenere delicatamente la tettarella con le dita e incannulare l'ago nell'apertura duttale. Continuare delicatamente a inserire l'ago a punta smussata da 27 G fino a quando la punta non è completamente all'interno della tettarella. Per alloggiare l'ago nella tettarella, portare la tettarella verso l'alto invece di spingere l'ago verso il basso nella tettarella. Fare attenzione a seguire il percorso dell'apertura duttale.
   NOTA: In alcuni conigli, potresti avvertire resistenza quando provi a inserire l'ago nella/e apertura/e del capezzolo/i. Applicare con cautela una leggera pressione per sfondare lo strato superiore delle cellule epiteliali. Nella nostra esperienza, è necessario un dispositivo di ingrandimento per identificare chiaramente l'apertura duttale per l'incannulamento. Può trattarsi di una lampada d'ingrandimento, di una lente, di una lente d'ingrandimento o di un dispositivo simile.
8. Infondere lentamente 300 μl di soluzione a una velocità costante di circa 200 μl/min una volta che l'ago è completamente inserito. Attendere 30 s dopo l'infusione per rimuovere l'ago dall'albero cannulato; Ciò garantisce che il volume iniettato rimanga all'interno dell'albero duttale e riduce la probabilità di perdite.
   NOTA: In genere, c'è un ricercatore che incannula e tiene l'ago, mentre un secondo ricercatore tiene la siringa e spinge lo stantuffo alla velocità desiderata. Una pompa a siringa può essere utilizzata per avere una portata più controllata, poiché bruschi cambiamenti nella velocità di infusione possono scoppiare o danneggiare gli alberi duttali.
9. Pulisci la soluzione versata con una garza inumidita o un panno EtOH per evitare soluzioni di contrasto estranee nelle immagini.

3. Imaging fluoroscopico

1. Acquisire immagini fluoroscopiche dopo che ogni albero duttale è stato infuso. I parametri della fluoroscopia sono: 30 fps, 67 kV e 17,3 mA su uno strumento a raggi X per fluoroscopia. Tuttavia, regolarli in base all'esperimento e alle esigenze di imaging.
2. Utilizzare le immagini fluoroscopiche per determinare se è necessario un volume aggiuntivo per riempire completamente l'albero duttale.
   NOTA: L'imaging fluoroscopico può avvenire dal vivo contemporaneamente all'infusione della soluzione ablativa. È possibile utilizzare pinze in metallo o plastica per tenere il capezzolo durante l'imaging per proteggere il personale dai raggi X dannosi. Ciò consente il monitoraggio del riempimento dell'albero o degli alberi duttali. La fluoroscopia dal vivo può guidare quando interrompere l'infusione in base all'aumento del volume alle estremità degli alveoli. La fluoroscopia dopo l'infusione può confermare se l'albero duttale era completamente riempito o se c'erano perdite. Una fluoroscopia di conferma viene in genere eseguita dopo l'infusione di ciascun dotto all'interno della stessa ghiandola mammaria.

4. Cura postoperatoria e recupero

1. Interrompere il flusso di isoflurano dopo l'ultima infusione intraduttale.
2. Iniettare 0,5 mg/kg di atipamezolo per via intramuscolare.
   NOTA: Il tempo di recupero varia da animale a animale, ma il coniglio dovrebbe iniziare a mostrare segni di recupero 5-20 minuti dopo l'iniezione.
3. Fornire un supporto termico continuo all'animale su una coperta riscaldante fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Mantenere il flusso di ossigeno per un massimo di 5 minuti prima di rimuovere dall'anestesia.
   NOTA: I segni di guarigione includono movimenti della bocca come masticare, tossire, contrazioni del naso e/o movimenti degli occhi. I conigli dovrebbero avere un riflesso raddrizzante ed essere in grado di mantenersi in posizione sternale prima di essere rimessi nel portatore di recupero. L'agente di recupero viene somministrato in base al peso del coniglio con un intervallo di 0,1-1 mg/kg di atipamezolo.
4. Iniettare 5 mg/kg di ketoprofene per via sottocutanea.
5. Rimuovere il catetere endovenoso una volta che il coniglio è in grado di mantenersi in posizione sternale. Tenere una garza nel punto in cui è stato rimosso il catetere per fermare l'eventuale sanguinamento in eccesso.
   NOTA: La rimozione del catetere può avvenire quando il coniglio si trova nel trasportino.
6. Trasporta il coniglio nella struttura di stabulazione appropriata.
7. Continuare le iniezioni di 5 mg/kg di ketoprofene per via sottocutanea per almeno 3 giorni dopo la procedura.
8. Monitorare il coniglio per segni di disagio, angoscia, dolore e automutilazione una volta al giorno per almeno 3 giorni dopo la procedura. Se il coniglio mostra uno di questi segni clinici, il trattamento con ketoprofene può essere prolungato. Registrare e monitorare il peso corporeo per valutare la presenza di segni di anoressia.
   NOTA: Il ketoprofene viene somministrato in base al peso del coniglio con un intervallo di 2-5 mg/kg. Può essere somministrato ogni 24 ore per un massimo di 5 giorni dopo l'infusione intraduttale per ridurre l'infiammazione e minimizzare le cicatrici. Per ridurre al minimo gli eventi avversi di ulcerazione cutanea o altri problemi correlati alla guarigione delle ferite, applicare la lidocaina localmente sul sito di iniezione. Qualsiasi animale che mostri segni persistenti di disagio, angoscia, dolore o lesioni dopo il trattamento con ketoprofene deve essere soppresso.

5. Analisi dei tessuti

1. Somministrare una soluzione per eutanasia (pentobarbital sodico e fenitoina sodica) per via endovenosa a 100 mg/kg. Dopo i 60 secondi, verificare la presenza di segni di vita mediante pizzicamento delle dita dei piedi/orecchie, segni di respirazione o battito cardiaco, riflesso corneale e/o stimolazione della pupilla.
2. Eseguire un'autopsia per ottenere il tessuto delle ghiandole mammarie e procedere per la procedura di inclusione di paraffina di routine dopo 24-36 ore in formalina tamponata neutra al 10%¹⁸. Quindi, eseguire la colorazione standard con ematossilina ed eosina (H&E) e/o la colorazione immunoistochimica con un marcatore specifico del tipo di cellula per facilitare le letture dell'analisi desiderate¹⁸. Smaltire la carcassa attraverso il corretto protocollo di smaltimento (ad esempio, incenerimento).
3. Analizzare i tessuti della ghiandola mammaria in consultazione con un patologo. Utilizzare un programma software per computer per aiutare a quantificare il tasso di ablazione e il danno tissutale collaterale.
   NOTA: L'analisi dei tessuti è stata eseguita su conigli bianchi neozelandesi di 4 mesi entro un'ora dalle infusioni (Figura 4) con il software aperto QuPath per l'analisi delle bioimmagini (https://qupath.github.io/). Questa analisi si basa solo su tessuti colorati con H&E. QuPath o un software per computer simile, richiede l'input e la calibrazione da parte di un patologo. Alcune cellule possono essere classificate erroneamente utilizzando solo le caratteristiche morfologiche (Figura 4). L'uso di marcatori specifici per tipo di cellula come le citocheratine e l'actina muscolare α-liscia può essere utilizzato per migliorare la classificazione assistita da computer⁶. In definitiva, l'analisi della classificazione cellulare deve essere curata e convalidata da un patologo.

Risultati

Ciascuna delle 8 ghiandole mammarie di una femmina di coniglio contiene 4 alberi duttali che si aprono in corrispondenza di orifizi indipendenti per capezzoli (Figura 2). A causa della differenza di dimensioni e numero di alberi duttali per ghiandola mammaria tra i roditori (solo 1 dotto per ghiandola mammaria), i conigli sono un buon modello intermedio per la traduzione umana. Possiamo infondere fino a 400 μL di soluzione di EtOH al 10-70% per riempire l'intero albero duttale di qualsiasi ghiandola mammaria di conigli bianchi neozelandesi di 4 mesi (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 ^4,8,9). Possiamo infondere fino a 4 alberi duttali in un massimo di 8 ghiandole mammarie con la soluzione ablativa in un'unica sessione. Un tipico disegno sperimentale consiste nell'infusione di 2-3 alberi duttali all'interno di una singola ghiandola mammaria in un massimo di 4 ghiandole mammarie con una particolare soluzione ablativa contenente un mezzo di contrasto a raggi X a base di iodio (Figura 2,  Figura 3). Per la soluzione ablativa contenente ioesolo (90-300 mg di iodio/mL), la fluoroscopia viene eseguita durante e/o dopo ogni infusione per determinare il successo individuale dell'infusione di ciascun albero duttale con una quantità parziale o totale di soluzione infusa (Figura 2, Figura 3). La raccolta del tessuto della ghiandola mammaria consente di valutare in che modo i cambiamenti nella formulazione influenzino la distruzione delle cellule epiteliali mammarie (Figura 4). Queste analisi di imaging forniscono informazioni per comprendere la soluzione più adatta per ottenere la massima ablazione riducendo al minimo il danno ai tessuti circostanti. Abbiamo determinato che la soluzione di EtOH al 10% fornisce un tasso ablativo paragonabile alle soluzioni ablative contenenti una percentuale più elevata di EtOH (Figura 4).

Figura 1: Flusso di lavoro della procedura intraduttale. Vengono evidenziati i passaggi chiave della procedura di identificazione. Si prega di guardare il video per maggiori dettagli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Passaggi chiave dell'incannulamento e dell'infusione intraduttale. (A) Iniezione di soluzione fisiologica perpendicolare al capezzolo per dilatare le aperture duttali per l'incannulamento (vista del piano mediano). (B) L'incannulamento e il riempimento di un albero duttale (D1) possono essere tracciati con colorante blu nella soluzione ablativa (vista del piano mediano). (C) L'imaging fluoroscopico in tempo reale offre un monitoraggio preciso e ad alta risoluzione del riempimento dell'albero duttale (D1) con ioesolo nella soluzione ablativa (vista del piano dorsale). Le aperture dell'albero duttale sono numerate da sinistra a destra, a partire dal quadrante superiore (D1, quadrante superiore sinistro) e terminando sul quadrante inferiore (D4, quadrante inferiore destro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dimensioni del capezzolo e somministrazione riuscita della soluzione ablativa a più condotti. Presentazione tipica delle dimensioni dei capezzoli nei conigli bianchi della Nuova Zelanda. La dimensione del capezzolo varia in base al peso e all'età del coniglio. Le ghiandole mammarie sono numerate dall'alto a sinistra (L1, cervicale sinistra) al basso a destra (R8, inguinale destro). Tutte le immagini sono mostrate sul piano dorsale. (A) Coniglio vergine da 2,8 kg (in alto) con capezzoli più piccoli, difficili da incannulare, 3,5 kg di coniglio vergine (al centro) con capezzoli adatti per l'incannulamento e 4,1 kg di coniglio pluripare (in basso) con capezzoli più grandi, molto più facili da incannulare. (B) Il colorante alimentare blu nella soluzione infusa può essere utilizzato come prova in vivo di somministrazione intraduttale e riempimento dell'albero duttale. L'infusione non riuscita è indicata con un contorno rosso (erogazione di cuscinetto adiposo, in alto) e le infusioni riuscite con un contorno blu (erogazione intraduttale, al centro e in basso). Una soluzione di EtOH al 70% provoca più danni alla pelle (eritema) pochi minuti dopo l'infusione (blu scuro, pannello centrale) rispetto a una soluzione al 10% (azzurro, pannello inferiore). (C) La fluoroscopia fornisce prove in vivo di somministrazione intraduttale. Infusione non riuscita (erogazione del cuscinetto adiposo, pannello superiore). Infusione sequenziale riuscita di D1 duttale prima e D2 albero duttale secondo (pannello in basso a sinistra). La fluoroscopia dal vivo fornisce una guida per immagini per il riempimento (frecce bianche) dell'albero duttale D3 (pannello in basso a destra); Sono visibili anche la linea di estensione riempita con soluzione ablativa contenente iohexol e le pinze per tenere il capezzolo. Le barre della scala corrispondono a 1 cm nelle immagini con diversi ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi tissutale delle ghiandole mammarie nei conigli bianchi della Nuova Zelanda dopo procedura intraduttale con soluzione ablativa a base di etanolo. (A-B) Colorazione H&E rappresentativa di una ghiandola mammaria inguinale destra di un animale di 4 mesi senza trattamento ablativo rispetto a una ghiandola mammaria inguinale destra di un altro animale con trattamento ablativo EtOH al 10%. Le fette di tessuto sono tagliate lungo il piano mediano, quindi D1 e D3 (alberi duttali sinistri) sono rappresentati sulle stesse sezioni di tessuto. La vista dell'intero tessuto (A) e la vista ad alto ingrandimento (B) mostrano gli effetti morfologici e cromatici dell'ablazione di EtOH sulla colorazione H&E (pannelli superiori) e le classi di cellule epiteliali e stromali dedotte sulla base di un classificatore addestrato assistito da computer (pannelli inferiori). La barra della scala nera corrisponde a 1 mm in A e la barra della scala bianca a 100 μm in B. (C) La barra del grafico mostra la distribuzione delle classi cellulari in alberi duttali (n > 4 per gruppo) trattati con diverse concentrazioni di EtOH o non trattati. Gli asterischi indicano il valore p del t-test di Welch non accoppiato di ciascuna classe cellulare per gruppo rispetto alla sua classe cellulare corrispondente nel gruppo trattato con EtOH al 10% (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che una somministrazione di ID del 70% di EtOH abla le cellule epiteliali mammarie causando un danno minimo al tessuto circostante nei roditori ^6,7. In questa procedura, abbiamo dimostrato che un'infusione ID di una soluzione ablativa può essere scalata fino a un modello di coniglio. In particolare, dimostriamo in questo modello più grande con un sistema ad albero multiduttale che l'infusione sequenziale di tutti i dotti all'interno di una ghiandola mammaria può essere infusa con successo. Questa rappresenta la fase successiva nella traduzione di questa procedura ablativa in una valida alternativa alla mastectomia profilattica per la prevenzione primaria nei soggetti ad alto rischio.

L'agente di contrasto a raggi X a base di iodio Omnipaque (iohexol), approvato dalla FDA, ci consente di valutare il successo dell'infusione, mediante la visualizzazione in tempo reale del processo di somministrazione della soluzione attraverso l'albero duttale. L'uso della fluoroscopia per visualizzare la ghiandola mammaria infusa corrisponde strettamente a quelle che probabilmente saranno le attrezzature e gli strumenti utilizzati per portare questa procedura guidata da immagini alla clinica^10,11. Questa modalità di imaging ci permetterà di sapere quando interrompere l'infusione, rendendo così la fluoroscopia dal vivo una componente chiave dell'implementazione clinica di questa procedura ablativa. Abbiamo stabilito la scalabilità di questa procedura dagli alberi duttali dei roditori a quelli dei conigli, ma sono necessarie ulteriori ricerche per determinare la percentuale di EtOH che meglio abla le cellule epiteliali mammarie, riducendo al minimo il danno tissutale circostante in questo modello animale più grande. Questo protocollo si è concentrato sulla fattibilità dell'infusione intraduttale e dell'analisi dei tessuti subito dopo la procedura. Le strategie di risoluzione dei problemi e i suggerimenti utili sono descritti in dettaglio nella Tabella 1. Sebbene l'obiettivo principale di questo protocollo sia quello di fornire soluzioni ablative a base di etanolo, questo protocollo può essere utilizzato in altre applicazioni per fornire localmente altri reagenti di imaging, sistemi di modifica genetica come CRISPR/Cas9, vettori lentivirali, siRNA, fattori di crescita e/o agenti cancerogeni ^2,3 per studiare altri aspetti dello sviluppo della ghiandola mammaria e dell'oncogenesi nei conigli.

In conclusione, questo protocollo fornisce gli strumenti di ricerca necessari per eseguire uno studio sistematico e longitudinale degli effetti locali e sistemici di diverse soluzioni ablative. Queste informazioni determineranno la sicurezza di questa procedura e individueranno eventuali preoccupazioni relative all'ulteriore sviluppo e alla valutazione clinica nei primi studi clinici sull'uomo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lente d'ingrandimento 10X con luce e morsetto, grande collo d'oca	Amazzone	B0D982JCZ2	Per la visualizzazione delle tettarelle
Siringhe da insulina Exel International	Fisher Scientifico	14-841-31	Per iniezione periduttale di soluzione fisiologica
Ferri smussati sfusi calibro 27 lunghezza 0,5	Tecnologie di infusione SAI	B27-50 100 Alla rinfusa	Per incannulamento intraduttale
Blu Evans	Sigma	E2129-50G	Per la visualizzazione della ghiandola mammaria
Sistema di imaging a raggi X fluoroscopico	GE HealthCare	DT-C31-01	Per l'acquisizione di immagini in fluroscopia
Coperta riscaldante veterinaria HotDog	Hotdog	WC71V	Per procedura intraduttale/preparazione preoperatoria
Linee di prolunga maschio-femmina, lunghezza 12 pollici	Tecnologie di infusione SAI	EXT-12	Per la procedura intraduttale
Omnipaque 500 mL (350 mg di iodio/mL)	GE Sanità	0407-1414-72	Mezzo di contrasto per la visualizzazione a raggi X (fluoroscopia)
Colorante alimentare blu sterile	Mccormick	930641	Per la visualizzazione della ghiandola mammaria
Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher	14190250	Per la preparazione della soluzione
Siringhe	BD	309659	Per infusione intraduttale
V-gel	Docsinnovent	D30001 - 30006	Per l'intubazione (il numero di catalogo dipende dalle dimensioni del V-gel)
Ketoprofene	Covetrus	#005488	Per analgesia
ketamina	Covetrus	71069	Per analgesia
Lidocaina topica	Covertus	70859	Per analgesia
xilazina	Covetrus	80907	Per anestesia
Eutasol	Covetrus	#009444	Per l'eutanasia
lubrificante per occhi	Covetrus	75848	Per anestesia
atipamezolo	Covetrus	82124	Per anestesia
Banana Chips	Bio-Serv	#F7161	Per l'acclimatazione
Gemme della Furia	Bio-Serv	#F5136-1	Per l'acclimatazione
Gocce di yogurt	Bio-Serv	#F7200-1	Per l'acclimatazione