Articolo metodologico

Strumento di imaging epatico riutilizzabile: uno strumento riutilizzabile stampato in 3D per microscopia intravitale epatica

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo introduce uno strumento di imaging epatico riutilizzabile all'avanguardia (RHIT) per la microscopia intravitale (IVM) di topi vivi, che migliora la stabilità dei tessuti per esperimenti rapidi e acuti. Il design stampato in 3D della RHIT offre produzione, scalabilità e versatilità economiche, consentendo un'osservazione prolungata dei processi metabolici nei topi di varie dimensioni.

Abstract

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La funzione e la disfunzione epatica possono essere valutate visualizzando direttamente i processi dinamici del fegato tramite microscopia intravitale confocale (IVM). In particolare, si può ottenere un'eccellente precisione spaziale e temporale nell'estrazione sia di informazioni qualitative che quantitative. Sul piano microscopico, mantenere le condizioni fisiologiche del tessuto ottenendo stabilità e ripetibilità rimane una sfida. L'aumento del peso e del contenuto lipidico epatico ha un effetto dannoso su questo processo nei modelli animali di diabete di tipo II (T2D) e fegato adiposo non alcolico (MAFLD). Per superare questi vincoli, abbiamo creato RHIT, un design rivoluzionario di strumento di imaging che migliora l'accesso e la stabilità dei tessuti. RHIT è un dispositivo di imaging epatico riutilizzabile e scalabile, prodotto tramite stampa 3D in un metodo efficiente in un solo passaggio. Le sue dimensioni possono essere modificate per adattarsi a mouse di diverse dimensioni. In breve, il RHIT è un apparecchio stampato in 3D per posizionare e stabilizzare animali da laboratorio durante la microscopia epatica intravitale, utilizzato dopo una breve preparazione chirurgica per minimizzare la manipolazione, lo stress e la variabilità. Il suo design riutilizzabile e standardizzato è facilmente prodotto e personalizzabile, supportando una gamma di dimensioni e potenziali progetti sperimentali. I primi risultati mostrano un notevole miglioramento nella stabilità e affidabilità dell'imaging intravitale epatico, permettendo la visualizzazione dettagliata delle strutture subcellulari, come le gocce lipidiche. Questa precisione migliorata facilita studi metabolici e fisiologici con chiarezza, riproducibilità e possibilità di disegni longitudinali. Il protocollo offre un approccio standardizzato e accessibile che affronta le sfide tecniche di lunga data nella IVM epatica.

Introduzione

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La microscopia intravitale è uno strumento potente per visualizzare dinamicamente i processi biologici in vivo 1,2,3, a differenza della tradizionale istologia immunofluorescenza con imaging di tessuto fisso o cellule vive e analisi citometrica di flusso di cellule isolate. Per l'ispezione epatica, la FIV è stata utilizzata per esaminare la secrezione e il flussobiliare 4,5, la mobilizzazione delglucosio 6,7, le cellule non parenchimate 8,9,10 e le malattieepatiche 11,12. Inoltre, per quanto riguarda l'indagine sull'accumulo lipidico, la IVM consente informazioni in tempo reale sulla dinamica della formazione, crescita e degradazione delle gocce lipidiche nei tessuti vivi, come la visualizzazione e quantificazione delle gocce lipidiche ad alta risoluzione spaziale, e per la correlazione diretta dell'accumulo di gocce lipidiche con altri processi cellulari efisiologici 13. Nonostante questi vantaggi, la IVM è ancora tecnicamente impegnativa: richiede attrezzature specializzate ecompetenze, può causare danni ai tessuti, alterare il comportamento cellulare e richiedere procedure invasive. Gli studi tradizionali in vivoche si basano sull'osservazione comportamentale, il monitoraggio fisiologico e l'analisi genetica forniscono informazioni preziose ma mancano della risoluzione spaziale e temporale offerta dalla microscopia intravitale.

La prima grande sfida con la IVM è il controllo dell'instabilità degli artefatti causati dal battito cardiaco e dalla respirazione dell'animale ispezionato, il che può compromettere la qualità dell'immagine, causando immagini oscurate o distorte dei processi biologiciosservati 15. I tentativi di correggere questo problema con l'elaborazione delle immagini spesso portano alla perdita di informazioni spaziali e temporali importanti o alla necessità di attrezzature chirurgiche avanzate e manutenzione16,17. In secondo luogo, i modelli murini per studi sulle malattie epatiche, come MAFLD e T2D, sono spesso obesi e, quindi, più difficili da stabilizzare a causa dell'aumento delle dimensioni e del contenuto lipidicodei tessuti 16,18. Nei modelli topini obesi con NAFLD e T2D, l'aumento della massa corporea pone sfide meccaniche per l'imaging intravitale, superando la capacità di carico degli stadi standard del microscopio e complicando la stabilizzazione animale19. Questo peso aggiuntivo aumenta il rischio di artefatti di movimento e compressione tissutale, entrambi che compromettono la precisione dell'imaging20.

Contemporaneamente, un contenuto elevato di lipidi epatici aumenta l'opacità dei tessuti e la diffusione della luce, degradando la risoluzione e il contrasto dell'immagine. Questi effetti sono spesso aggravati da comorbidità metaboliche come perfusione alterata e infiammazione, riducendo ulteriormente la distribuzione dei coloranti e la chiarezza delsegnale 21. Infine, può essere difficile e compromettere la ripetibilità mantenere una temperatura corporea stabile durante l'imaging per sostenere la fisiologia tissutale e le attività biologiche. Inoltre, una posizione stabile del fegato sul palco del microscopio durante la FIV è cruciale per prevenire stress meccanico o danni aitessuti 7. L'esposizione del tessuto epatico è una procedura delicata che richiede precisione tecnica per prevenire sanguinamenti gravi e danni al parenchimaepatico. Per ridurre gli artefatti di movimento, la gabbia toracica del topo veniva precedentemente sollevata dal palco del microscopio usando cartone, permettendo alla gravità di trascinare il fegato lontano dal resto delcorpo 22. Sebbene questo approccio si sia dimostrato efficace nel produrre dati quantificabili, il materiale di cartone è insostenibile perché perde forma ed è difficile da pulire. Inoltre, è difficile modificare le dimensioni dell'inserto di cartone per adattarsi a modelli di topi obesi.

Negli ultimi anni sono emerse diverse tecniche avanzate di microscopia intravitale epatica, tra cui la microscopia a campo luminoso a scansione e sistemi ottici computazionalmente potenziati, che hanno dimostrato miglioramenti nella risoluzionespaziotemporale 23, nella riduzione dellafototossicità 24, nella maggiore profondità di imaging25,26 e nella soppressione degli artefattidi movimento 27. Questi sviluppi, come dimostrato da studirecenti 28, 29, 30, rappresentano importanti progressi tecnologici nel settore. Questo articolo presenta il Reutilizable Hepatic Imaging Tool (RHIT), uno strumento innovativo per la IVM del fegato murino. RHIT contribuisce a questo panorama in evoluzione offrendo uno strumento scalabile e riutilizzabile che migliora la stabilità meccanica e l'accessibilità ai tessuti attraverso diversi modelli animali, inclusi quelli con malattie metaboliche. Il suo design affronta le persistenti sfide di movimento, variabilità e complessità dell'allestimento integrando l'adattamento anatomico, la riproducibilità degli stadi e la facilità d'uso. La compatibilità di RHIT sia con le modalità di imaging convenzionali che avanzate amplia l'utilità di queste tecniche emergenti, promuovendo un'imaging epatico intravitale affidabile e fisiologicamente stabile.

Sebbene siano stati proposti vari approcci per stabilizzare il tessuto durante la IVM, come una finestra chirurgica 9,31,32,33,34,35,36 e acrilico assemblato su misura stadio 6,37, questi metodi introducono anche numerose limitazioni e complessità riguardo alla scalabilità, riproducibilità e abilità chirurgiche. Al confronto, il RHIT è funzionalmente distinto per scopo e progettazione. Non si basa sulla compressione diretta né sull'embedding a base digel 38. Invece, RHIT funge da strumento scalabile, riutilizzabile e anatomicamente sagomato che supporta l'isolamento epatico tramite il posizionamento gravitazionale, mantenendo l'orientamento fisiologico senza restringere o deformare il tessuto. In modo fondamentale, RHIT migliora la riproducibilità dei dati, la fedeltà dell'imaging e la coerenza procedurale su un'ampia gamma di dimensioni di mouse. Elimina la necessità di gel, adesivi o interfacce chirurgiche complesse, semplificando al contempo l'allineamento dei tessuti e il controllo della temperatura. Inoltre, RHIT è uno strumento specializzato che collega l'interfaccia tra l'animale e il microscopio, progettato per assistere sia nel supporto fisiologico che nella precisione dell'immagino.

RHIT affronta direttamente le sfide meccaniche e ottiche dei modelli metabolicamente compromessi attraverso la sua geometria scalabile, che consente di gestire animali di dimensioni maggiori distribuendo il peso in modo uniforme per minimizzare l'instabilità delle piattaforme. L'apertura epatica incassata stabilizza il tessuto utilizzando la gravità senza forza compressiva, consentendo un accesso costante e riducendo il movimento durante l'imaging. Il suo design riutilizzabile e chimicamente inerte garantisce compatibilità con i tessuti biologici al contempo favorendo il riutilizzo igienico. Consentendo una posizione coerente, minimizzando gli artefatti di movimento e mantenendo l'integrità dei tessuti, RHIT rappresenta un progresso fondamentale nei flussi di lavoro di microscopia intravitale. La sua adattabilità e la disponibilità open source favoriscono ulteriormente un'ampia utilità in laboratori e modelli animali, stabilendo un nuovo standard per gli strumenti di imaging che supportano sia il campione che il sistema di imaging.

Inoltre, gli stadi riscaldati commercialmente disponibili possono richiedere installazioni e manipolazioni avanzate delmicroscopio 39. Non sono scalabili al campione e generalmente sono più costosi, rendendoli meno accessibili a molti ricercatori. Pertanto, un inserto riutilizzabile e scalabile è importante per standardizzare la IVM per diversi modelli animali. La tecnologia stampata in 3D, nota anche come produzione additiva, è diventata sempre più popolare nei laboratoriscientifici 40, trasformando i protocolli dei laboratori di biochimica, fisica e biologia. Per la IVM, la tecnologia 3D è stata utilizzata per produrre finestre ottiche leggereper immagini 41,42, migliorare l'accessibilità deitessuti 43 e facilitare la riparazione e la ricostruzione deitessuti 44. Pertanto, uno strumento personalizzato per la stabilizzazione dei tessuti, che, per quanto ne sappiamo, non è stato descritto, rappresenta un'ottima opportunità per utilizzare la stampa 3D e superare alcune delle sfide della IVM epatica.

RHIT è creato utilizzando un metodo di stampa 3D in un solo passaggio e migliora sostanzialmente la stabilizzazione dei tessuti per un periodo prolungato. La RHIT è altamente accessibile e adatta per esperimenti acuti di IVM che richiedono competenze chirurgiche minime. Inoltre, il RHIT è facilmente scalabile alla dimensione animale e ha un basso costo di produzione. Infine, dimostriamo che il RHIT consente immagini a fluorescenza a tempo di riposo stabile e migliora la stabilità dei tessuti rispetto all'inserto di cartone precedentemente utilizzato. La RHIT semplifica la IVM dell'omeostasi lipidica epatica senza contatto diretto o impatto misurabile sulle condizioni fisiologiche. Di conseguenza, RHIT rappresenta un vantaggio competitivo come contributo accelerato, riutilizzabile e adattabile a IVM 34,36,45.

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Figura 1: Progetto RHIT. (A) Progettazione e dimensioni di un RHIT da 3,0 mm scalato per un topo obeso. La vista enface (a sinistra) mostra le dimensioni, la posizione e la dimensione dell'apertura del tessuto, così come l'orientamento del topo durante l'imaging (imaging). La vista laterale (a destra) include le dimensioni e indica la posizione dell'inserto della calda e della sonda termica. I parametri di scalatura per diverse dimensioni del mouse sono forniti nella Tabella 1. (B) Vista 3D enface di RHIT generata dal file STL open-source, che mostra dove il filo della sonda rettale viene inserito tramite la porta personalizzata (dimensioni dell'inserimento sonda rettale indicate in alto a destra). (C) Assemblaggio tecnico del RHIT che mostra l'integrazione del dispositivo di riscaldamento e degli inserti strutturali personalizzati per varie dimensioni RHIT, il filo viene inserito nell'inserto della sonda rettale per l'accesso alla sonda di temperatura. Abbreviazione: RHIT = Strumento di Imaging Epatico Riutilizzabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

RHIT è stato originariamente progettato come un assemblaggio monocomponente utilizzando ABS (Acrilonitrile Butadiene Stirene), un polimero termoplastico ampiamente utilizzato nella modellazione a deposizione fusa nella stampa3D 45. L'ABS offre diversi vantaggi per questa applicazione: è leggero, resistente al calore (punto di fusione ~200 °C) e ha una buona resistenzaagli urti 46,47,48. Il design di RHIT sfrutta la densità sintonizzabile dell'ABS, permettendogli di assorbire movimenti fisiologici come il battito cardiaco e la respirazione. L'aumento della densità di riempimento aumenta l'attenuazione del movimento, con maggiore stabilità dell'immagine e qualità dell'immagine.

RHIT è progettato per assorbire il movimento attraverso regolazioni della densità di un materiale chimicamente inerte come l'ABS. In questo contesto, densità si riferisce specificamente alla percentuale di riempimento interno utilizzata durante la stampa 3D, che influisce sulla rigidità e sulla capacità della piattaforma di attenuare levibrazioni 49,50,51. L'aumento della densità dell'ABS è stato osservato riducendo la trasmissione dei movimenti causati dal battito cardiaco e dalla respirazione, creando una piattaforma stabile per l'imaging e migliorando la qualità dell'immagine. Abbiamo testato costrutti RHIT con densità di riempimento interne variabili (20-100%) e osservato qualitativamente che configurazioni ad alta densità portavano a artefatti di movimento visibilmente ridotti durante l'imaging intravitale epatico nei topi. Non fu eseguita una quantificazione formale, poiché la configurazione ad alta densità si dimostrò sufficientemente robusta ed efficace su tutte le dimensioni di RHIT testate, e forniva costantemente prestazioni affidabili in condizioni di imaging di routine. Per la maggior parte degli utenti, questa densità predefinita sarà adatta senza ulteriori aggiustamenti. Tuttavia, per esperimenti che richiedono specifiche caratteristiche meccaniche, la densità di riempimento e i parametri di progettazione possono essere modificati, e sono state fornite istruzioni complete per la stampa 3D a supporto di tale personalizzazione.

Materiali alternativi possono essere utilizzati per la stampa; tuttavia, l'ABS è il materiale preferito per la fabbricazione di RHIT poiché offre diversi vantaggi chiave. È chimicamente inerte, riducendo al minimo il rischio di interazione con tessuti o fluidi corporei, e insolubile in acqua, consentendo una pulizia, conservazione e riutilizzo efficienti. Queste proprietà rendono l'ABS una scelta affidabile e duratura per l'uso sperimentale. Quando l'accesso a una stampante per modellazione a deposizione fusa è limitato, possono essere utilizzate altre tecniche e materiali di stampa 3D. La stereolitografia, la sinterizzazione laser selettiva e la fusione multi-jet sono opzioni adatte con materiali come nylon, resine fotopolimeriche o polveri composite. Il nylon offre durabilità e flessibilità, mentre le resine stereolitografiche offrono alta risoluzione per applicazioni che richiedono dettagli strutturali fini. Il design RHIT può essere facilmente adattato alle tolleranze e ai vincoli di diversi materiali, rendendolo compatibile con una gamma di piattaforme di stampa. Gli utenti dovrebbero selezionare i materiali in base alla stabilità meccanica, alla biocompatibilità, alla compatibilità con i flussi di lavoro di imaging e alle risorse di stampa disponibili.

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Protocollo

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Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti presso le strutture animali dei National Institutes of Health in conformità con le linee guida e i protocolli autorizzati dal Comitato Etico per gli Esperimenti sugli Animali (protocollo n. LCMB-037). Tutto il personale deve essere adeguatamente formato prima di procedere con i seguenti protocolli. La gestione degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali.

Il protocollo RHIT delinea la preparazione degli Strumenti di Imaging Epatico Riutilizzabili (RHIT) per l'uso in esperimenti di microscopia intravitale (IVM). Le procedure sperimentali vengono eseguite in una sala di microscopio sterilizzata, o cappa, e prevedono una serie di fasi: prima la stampa del RHIT, l'anestesia e l'etichettatura fluorescente del topo, poi la preparazione del microscopio, poi la procedura chirurgica e infine l'applicazione della IVM assistita da RHIT. La Figura 1 e la Figura 2 illustrano i componenti necessari per l'imaging dei campioni vivi utilizzando un microscopio confocale, che includono un insertometallico 5,6,7 (adattatore per l'imaging dei campioni vivi) per il posizionamento del RHIT, oltre a RHIT per l'uso in steatosi avanzata o controllata. Per testare il sistema, sono stati prelevati maschi C57BL/6J Mus musculus di età compresa tra 6 e 10 settimane e nutriti con una dieta Standard o Western per 8-10 settimane prima dell'esperimento.

1. Progettazione di RHIT con modifiche

  1. Per ricreare RHIT, utilizza software di progettazione 3D di prodotti (vedi la Tabella dei Materiali). Apri il software di progettazione e crea una nuova parte standard. Salva il file con una descrizione appropriata.
  2. Crea lo schizzo di RHIT sul piano frontale usando la funzione Crea Schizzo 2D .
    1. Clicca sull'icona rettangolare e posiziona l'angolo in basso a sinistra all'origine del piano dello schizzo.
    2. Disegna un secondo rettangolo all'interno del primo per rappresentare la finestra di imaging di RHIT.
    3. Aggiungi dimensioni a entrambi i rettangoli usando la funzione Dimension , assicurandoti che tutte le lunghezze e larghezze siano riferite all'origine e relative tra loro.
    4. Regola le dimensioni RHIT in base alla dimensione del mouse.
    5. Aggiungi spessore a RHIT selezionando solo il rettangolo esterno e cliccando su estrusione. Quando appare un pop-up, seleziona lo schizzo usando lo strumento Estrudere per lasciare un'apertura al centro.
    6. Seleziona la faccia inferiore del RHIT estruso e avvia un nuovo schizzo 2D usando la funzione Start 2D Sketch .
  3. Disegna un rettangolo per definire la tasca del cuscinetto riscaldante. Applica le dimensioni acquisite usando la funzione Dimensione .
    1. Esci dallo schizzo 2D ed esegui una rimozione del materiale usando lo strumento Cut Extrude per creare una cavità profonda per il pad riscaldante.
  4. Inizia un nuovo schizzo per la sonda di temperatura sulla stessa faccia della cavità. Clicca su inizia uno schizzo 2D e seleziona l'icona del cerchio . Posiziona il cerchio sulla superficie piana e dimensionalo di conseguenza. Esci dalla modalità schizzo .
    1. Clicca su estrusione e seleziona lo schizzo del cerchio. In modalitàe-xtrusion , clicca su taglia estrusione e aspetta che appaia un popup con un'opzione attraverso tutto per rimuovere materiale. Clicca OK. Modalità estrusione di uscita.
    2. Aggiungi fillet ai bordi della finestra cliccando sull'icona del fillet e selezionando tutti e otto i bordi affilati. Aggiungi la dimensione del fillet e esci dalla modalità fillet .
      NOTA: Se si desidera un ulteriore assorbimento del movimento, gli utenti possono aumentare la densità interna del riempimento durante la preparazione alla stampa 3D.
  5. Prepara il modello per la stampa 3D navigando nella scheda ambiente e selezionando la scheda Stampa 3D.
    1. Usa la funzione Set Orientation per assicurarti che il modello sia disteso piatto sul piano di stampa e non orientato verticalmente.
    2. Clicca su Opzioni di stampa per configurare le impostazioni dell'unità e regolare la scala se necessario.
    3. Salva il modello finale. Formato STL utilizzando la funzione di esportazione STL .
    4. Esci dalla scheda ambiente e clicca su salva per salvare RHIT come parte solida.
  6. Chiudi il programma di progettazione.
    NOTA: Assicurati che la stampante sia compatibile con il file . Formato di file STL oppure convertire nel formato appropriato come richiesto dal software della stampante 3D.

2. Caricamento e stampa di RHIT da file STL

  1. Importa il file .stl dalla Figura 1A o Supplemental File 1, in un software 3D di progettazione assistita dal computer (CAD) cliccando su Importa e selezionando il file .stl. Clicca sul pulsante Prepara per tagliare il modello in strati sottili per la stampa 3D.
  2. Seleziona la stampante commerciale 3D appropriata e clicca su Stampa. Poi, monitora l'avanzamento della stampa e, una volta completata, rimuovi e pulisci l'oggetto stampato in 3D secondo necessità.
Dimensione del mousePeso corporeo del topo (g)Spessore RHIT (mm)Finestra di imaging dimensione L x l (mm)
Piccolo (S)17-201.517 x 17
Medium (M)22-252.521 x 21
Grande (L)35-40326 x 26

Tabella 1: Scalare la dimensione del mouse a RHIT. Il peso del topo è scalato allo spessore del RHIT, dove un peso superiore a 30 g (punta di freccia) corrisponde al più grande RHIT (3,0 mm). Il topo più leggero corrisponde al RHIT più sottile, mentre i topi obesi sono rappresentati dal RHIT più spesso. Queste dimensioni possono essere regolate tramite software CAD. La lunghezza e l'apertura di imaging della RHIT possono variare in base alla posizione dell'organo del campione utilizzato; lunghezza costante e apertura di imaging per tutti e tre i RHIT erano adatte a questo studio. Abbreviazioni: RHIT = Strumento di Imaging Epatico Riutilizzabile; CAD = progettazione assistita da computer.

3. Preparazione del microscopio e utilizzo del RHIT

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Figura 2: IVM del fegato usando la tecnica RHIT. (A) Schema del microscopio confocale rovesciato con un topo anestetizzato. (B) Un adattatore metallico per microscopio (insert) veniva utilizzato per posizionare il mouse sul palco del microscopio per l'imaging dal vivo. (C) La RHIT stampata in 3D veniva utilizzata con una striscia di garza per manipolare facilmente il parenchima epatico. (D) Immagine del fegato preesternato prima del posizionamento RHIT. Il cono nasale veniva utilizzato per l'anestesia prima e durante l'intervento. (E) Immagine del fegato esternalizzato prima del posizionamento RHIT durante una procedura acuta. Non era necessario radersi. (F) Immagine del topo rovesciato nella posizione finale a faccia in giù sul RHIT per l'imaging. (G) RHIT fissato saldamente allo stadio del microscopio. (H) Un mouse posizionato su RHIT e adattatore metallico. (I) I topi magri (freccia blu) e obesi (freccia verde) mostrati con inserti RHIT squamati in J-L rappresentano immagini anatomiche grossolane rispettivamente del fegato obeso e magro (rispettivamente). Le immagini IVM ad alta risoluzione M,N del fegato di topi obesi e magri etichettati con BODIPY (verde, raffigurato da una freccia rosa) per etichettare gocce lipidiche e Hoechst 33342 (bianco, raffigurato da una freccia ciano) per etichettare i nuclei, rispettivamente. Abbreviazioni: RHIT = Strumento di Imaging Epatico Riutilizzabile; IVM = microscopia intravitale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Preparare un microscopio confocale rovesciato convenzionale per la IVM epatica come mostrato nella Figura 2.
    1. Inserire un adattatore per il palco per adattarsi al campione. Per seguire questo protocollo, utilizza un inserto metallico su misura con un'apertura circolare da 35 mm e un vetro di copertura da 40 mm.
    2. Pulisci accuratamente entrambi i lati del vetro di copertura prima e dopo ogni immagine utilizzando etanolo al 70% se necessario.
  2. Fissare il RHIT appropriato in base alla dimensione del mouse (Tabella 1) con nastro (opzionale) allineando l'apertura RHIT con l'obiettivo e parallelo sopra il coperchio immagine (Figura 2G) sull'inserto metallico con nastro sopra il vetro di copertura.
  3. Scegli un obiettivo per l'imaging in base alla dimensione dell'area, alla risoluzione spaziale e al tempo di imaging, ad esempio un obiettivo idrico di 25x/0,95.
    NOTA: Sebbene un ingrandimento più elevato migliori la risoluzione, aumenta anche la probabilità di reperire artefatti di movimento.
    1. Uniforma l'obiettivo vicino al vetro di copertura.
  4. Fissare una striscia di garza (circa 1 x 8 cm, Figura 2C,D) attraverso la finestra RHIT con del nastro adesivo per aiutare a posizionare il tessuto e separarlo dagli altri organi addominali (Figura 2C).
  5. Preriscalda la RHIT utilizzando un cuscinetto riscaldante inserito nella fessura e fissa la sonda termica adiacente alla RHIT (Figura 2G,H) per mantenere la temperatura corporea del topo durante l'imaging.

4. Marcatura fluorescente e anestesia topina

  1. Riduci lo stress del topo sanificando la camera di induzione anestetica per eliminare eventuali ultime tracce di odore animale.
  2. Attiva il condensatore di ossigeno, un sistema di protezione ambientale (EPS) e il vaporizzatore di isoflurano.
  3. Inserire il topo nella camera di induzione e anestetizzare usando isoflurano al 2-3% per circa 3-5 minuti, o finché l'animale non mostra una respirazione stabile e perdita dei riflessi di raddrizzamento e pedale.
    1. Una volta anestetizzato, trasferire il topo sulla borsa riscaldante e mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano al 1-2% somministrato attraverso il cono nasale (Figura 2D), regolando secondo necessità per garantire un piano chirurgico di anestesia stabile durante tutta la procedura.
    2. Valuta la profondità dell'anestesia effettuando un test per pizzicare le dita del piede per osservare eventuali movimenti volontari.
  4. Per contrassegnare le strutture ricche di lipidi, iniettare 200 nmol di BODIPY 665/676 diluito in PBS (volume totale 200 μL) tramite la vena caudale usando una siringa di insulina da 31 G.
    1. Per un segnale ottimale, somministra BODIPY una volta al giorno per 2 giorni consecutivi prima dell'imaging farmacologico. Lascia almeno 3-4 ore dopo la seconda iniezione per garantire la pulizia sistemica del fondo e la stabilizzazione del segnale tissutale.
  5. Per fornire contrasto nucleare, iniettare Hoechst 33342 (2 μg/g di peso corporeo) diluito in una soluzione di eparina 1x (preparata mescolando 120 μL di eparina con 180 μL di soluzione salina per ottenere 400 U/mL) tramite il seno retro-orbitale usando una siringa di insulina da 31 G.
    NOTA: Hoechst viene somministrato separatamente per evitare precipitazioni quando miscelato con altri coloranti.
  6. Per visualizzare la vascolatura, iniettare 18 μg/g di peso corporeo di dextrano fluorescente (70 kDa) diluito nella stessa soluzione di eparina 1x descritta nello Passo 4.5, tramite il seno retro-orbitale controlaterale utilizzando una siringa di insulina da 31 G (Tabella 2).
    NOTA: L'eparina è inclusa per ridurre la formazione di coaguli e favorire un flusso sanguigno costante durante l'imaging di esperienza.
  7. Aspetta 10-15 minuti dopo le iniezioni di Hoechst e dextran prima di iniziare l'intervento e l'esame di imaging.
Reporter fluorescenteScopoDose per peso (o concentrazione)
Hoechst 33342Nuclei di colorazione2 μg/g: integrare il volume iniettoriale a 50 μl con soluzione di eparina
Carrozzeria 665/676Gocce lipidiche di colorazione0,8 μg/g: integrare il volume dell'iniettore a 200 μl in soluzione salina
2M tetrametil rodamina-dextrano (Dextran)Vascolarizzazione delle tinte18 μg/g: integrare il volume iniettabile a 50 μl con soluzione di eparina

Tabella 2: Opzioni per i reporter fluorescenti. Questa tabella fornisce una descrizione dettagliata dei metodi utilizzati per etichettare i tessuti del topo per l'imaging in vivo. La soluzione di eparina viene preparata prima e poi utilizzata per produrre le soluzioni DAPI-heparina edextran-heparina 7. Hoechst 33342 viene iniettato retro-orbitalmente in un occhio, mentre BODIPY viene iniettato direttamente nella vena caudale 2-3 giorni prima, con una concentrazione più elevata per topi obesi. Il Dextran viene iniettato retro-orbitalmente nell'altro occhio. È importante eseguire iniezioni retro-orbitali separatamente in ciascun occhio. Abbreviazione: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo.

5. Intervento chirurgico del topo

  1. Rasi il mantello addominale usando un tagliacapelli e/o una crema depilatoria. Rimuovere i residui di peli e usare etanolo al 70% per pulire la pelle esposta.
    NOTA: A seconda dei requisiti istituzionali dell'IACUC, può essere utilizzato un detersione alternata di betadine ed etanolo per garantire una preparazione adeguata del sito chirurgico.
  2. Rivaluta la profondità dell'anestesia prima dell'intervento.
  3. Espone il fegato realizzando un'incisione orizzontale a forma di mezzaluna di 2-3 cm sotto la gabbia toracica con forbici chirurgiche dal xifoide, terminando sul lato laterale sinistro della parte superiore dell'addome.
  4. Dopo l'incisione iniziale, si effettua con attenzione una piccola incisione secondaria nello strato muscolare per esporre il lobo sinistro del fegato, cauterizza (opzionale) se necessario per evitare sanguinamenti (Figura 2E).
    1. Prevenire danni da calore al fegato durante l'uso del cauterizzatore posizionando una garza imbestata di soluzione salina tra il fegato e lo strato muscolare per assorbire il calore emanato dallo strato muscolare.
    2. Evita qualsiasi sanguinamento eccessivo, traumi chirurgici o meccanici, o compressione esterna.
  5. Una volta esposto il fegato, trasferire il topo allo stadio del microscopio.

6. Posizionamento del mouse sul palco del microscopio

  1. Posiziona l'addome del topo anestetizzato rivolto verso il basso sopra la piattaforma RHIT del microscopio.
    1. Regola il cono nasale in modo che il topo rimanga sotto anestesia.
    2. Utilizzare un applicatore con la punta di cotone inumidito con soluzione salina per manovrare delicatamente il lobo laterale sinistro del fegato contro il coperto, applicando una lieve pressione esterna sulla cavità toracica.
      NOTA: Approfitta della gravità per manovrare con attenzione il fegato fuori e sul vetro di copertura.
    3. Usa una striscia di garza per separare delicatamente il fegato dal corpo del topo (Figura 2E-H).
  2. Controlla nuovamente il cono nasale per assicurarsi che il topo rimanga sotto anestesia durante l'immagini.
  3. Prevenire la disidratazione dei tessuti applicando un gel a base d'acqua ai bordi della cavità esposta ed evitando il contatto diretto con la borsa termica.
    NOTA: Il mantenimento di temperatura e umidità può essere facilitato anche da un microscopio con una camera di umidità chiusa 5,6,7.
  4. Applica una pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza corneale.
  5. Imposta la IVM in time-lapse per iniziare l'imaging 7,52.
    1. Apri gli otturatori laser, valuta la marcatura fluorescente e individua una regione stabile di interesse con un flusso sanguigno significativo. Selezionare parametri di acquisizione dell'immagine appropriati, inclusi formato dell'immagine, velocità di acquisizione, intervalli di immagine, durata totale di acquisizione e media linea/fotogramma (512 × 512 pixel; 1-5 fotogrammi s⁻¹ per regione; intervalli di imaging da 5 a 30 secondi; tempo totale di acquisizione da 5 a 20 minuti; media linea/fotogramma da 2 a 8, a seconda dei requisiti sperimentali). Ottimizzare l'esposizione al flash di fluorescenza per adattarsi ai fluorofori utilizzati.
    2. Definisci i limiti superiori e inferiori per gli stack Z selezionando il Z-Stack nel pannello di acquisizione , regolando i piani focali superiore e inferiore usando i controlli della posizione Z, e confermando la distanza con Set First/Set Last; poi avvia la registrazione time-lapse cliccando su Inizia Esperimento (o Inizia Acquisizione). Al termine dell'esame di imaging, sopportare l'eutanasia dell'animale in conformità con le istituzioni di cura degli animali e utilizzare i protocolli approvati dal comitato.

figure-protocol-2
Figura 3: Misurazione della maggiore stabilità IVM epatica della RHIT con SSIM. IVM epatica del lobo epatico inferiore sinistro sotto tre condizioni di stabilizzazione: (A) nessun inserto (NESSUNO), (B) inserto di cartone e (C) RHIT. I tessuti sono marcati con BODIPY (magenta, lipidi), Hoechst 33342 (verde, nuclei) e Destrono (ciano, vascolatura); i pannelli A e B mostrano distorsioni visibili e artefatti di movimento, mentre C mostra una maggiore chiarezza con RHIT. (D) L'indice di similarità strutturale (SSIM) è stato calcolato per quantificare la stabilità dell'immagine. Le barre mostrano la media ± SEM, e ogni punto colorato rappresenta una replica biologica individuale: RHIT (n = 14), Cartone (n = 10), No Insert (n = 8). Questi gruppi sono sottoinsiemi provenienti dalla coorte sperimentale complessiva di circa 50-70 topi. Solo le sessioni che soddisfano specifici criteri di imaging (ad esempio, allineamento coerente del fotogramma e qualità dell'immagine) sono state analizzate tramite SSIM. RHIT ha costantemente prodotto valori SSIM più alti (media 0,511 ± SEM), indicando un miglioramento della stabilità e della risoluzione in condizioni di imaging. Barre della scala = 15 μm. Sono mostrate immagini rappresentative; SSIM riflette sessioni seriali di IVM senza danni o interruzioni tissutali osservabili. Abbreviazioni: RHIT = Strumento di Imaging Epatico Riutilizzabile; IVM = microscopia intravitale; SSIM = indice di somiglianza strutturale; CARD = inserto di cartone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

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RHIT è stato progettato utilizzando un'applicazione CAD (Figura 1). Le dimensioni di RHIT sono scalate per accogliere topi di piccolo, medie e grandi dimensioni (Tabella 1). Il progetto RHIT consiste in un materiale piatto in ABS lungo 107,50 mm con un'apertura posizionata per consentire l'imaging epatico. La IVM è stata eseguita in condizioni ottimali (RHIT) e subottimali (nessun inserto o cartone) (vedi Figura 3A-C

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Discussione

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La microscopia intravitale del fegato è stata ampiamente studiata, tuttavia i metodi precedenti richiedono spesso procedure chirurgiche altamente invasive e non standardizzate per l'imaging terminalestabilizzato 5,6,7,9,31,32. Il movimento è probabilmente la barriera più difficile che impedis...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Intramurale presso i National Institutes of Health degli Stati Uniti, il National Cancer Institute e la biblioteca del NIH. H. Sanchez Cornejo ringrazia l'Agenzia Peruviana CONCYTEC per il sostegno finanziario tramite la sovvenzione n. PE501087367-2024-PROCIENCIA. Vogliamo ringraziare i membri del laboratorio Porat-Shliom e i collaboratori del gruppo di Fisica Quantistica dell'Università di Cambridge per la lettura critica, il personale della biblioteca del NIH e Geneti Gaga per l'assistenza tecnica. L'immagine renderizzata in 3D nella Figura 2A è stata creata utilizzando Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
nastro da mascheratura ½ polliciNastro mascherino 3M a uso generale:b40069428
Coperture da 40 mmBioptech40-1313-03191
Etanolo al 70% (v/v)Thermo Fisher ScientificBP2818-470% etanolo in volume e 30% acqua per volume
Macchina per anestesia: AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Gel per trasmissione a ultrasuoni Aquasonic 100Laboratori Parker  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Vedi Tabella 2
Software CAD (Autodesk Inventor o equivalente) & nbsp;Autodesk (software CAD rappresentativo)n/aSoftware
Sistema CautericoGeminiGEM 5917
Disinfettante ClidoxLaboratori di Ricerca Farmaceutica Inc.VWR, MSPP-96118F
Microscopio confocale (Leica SP8 o equivalente)LeicaSP8
Applicatori a punta di cotoneProdotti Medici Puritani25-806 1WC
Inserto per palchi in alluminio su misura (spesso 3 mm, depressione di 35 mm)N/AN/A
FORANO (isoflurano, USP) liquido per inalazione, 250 mLBaxter10019-360-60
Tagliacapelli (opzionale)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Cuscina termica con sonda rettaleStrumenti Scientifici ALACUSCINO RISCALDANTE-1/2
Eparina sodio, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Vedi Tabella 2
Tappetino riscaldante per mouseStrumenti Scientifici ALACUSCINO RISCALDANTE-1/2
Mus musculusIl Laboratorio JacksonC57BL/6Topo da laboratorio
Soluzione fisiologica normale (0,9% cloruro di sodio)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Strumento di Imaging Epatico Riutilizzabile) dimensione applicabileFornitoN/AVedi Tabella 1
Pinza chirurgica, punta curvaStrumenti scientifici di qualità11251-23
Garza chirurgicaMckesson6939
Forbici chirurgicheStrumenti scientifici di qualità14001-14
Tetrametilrodrodamine DextranoThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Vedi Tabella 2
Siringhe di insulina Ultra Fine U-100, 31 gBetty MillsBD326730

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

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