Biosensori geneticamente codificati basati su fluorofori per l'imaging a fluorescenza raziometrica nei microbi

Sommario

Questo protocollo descrive l'applicazione di biosensori geneticamente codificati basati su fluorofori nei microbi per l'imaging quantitativo a fluorescenza raziometrica in condizioni controllate. Integrando queste strategie di biorilevamento con tecniche di imaging avanzate, il metodo consente un'analisi ad alta risoluzione e in tempo reale a livello di singola cellula, fornendo informazioni più approfondite sulla dinamica delle piccole molecole.

Abstract

Lo studio della dinamica delle piccole molecole all'interno dei microbi è essenziale per studi completi sulla funzione microbica. Sia la dinamica intra-organismo che quella inter-organismo delle piccole molecole svolgono un ruolo critico nella fisiologia microbica, nella simbiosi e nella malattia. Tuttavia, il monitoraggio di queste dinamiche rimane molto impegnativo utilizzando la maggior parte delle tecniche esistenti. I biosensori geneticamente codificati basati su fluorofori sono strumenti potenti per tracciare la dinamica di piccole molecole in vivo e hanno un alto potenziale per guidare nuove scoperte. Questi biosensori sono più comunemente utilizzati nell'imaging a fluorescenza, spesso in combinazione con dispositivi di perfusione che consentono un controllo preciso delle condizioni ambientali. Se integrato con tecniche di imaging avanzate, questo approccio fornisce dati ad alta risoluzione, risolti spazialmente e temporalmente, consentendo di comprendere le risposte microbiche delle singole cellule. Nonostante le loro promesse, l'implementazione di tali biosensori rimane tecnicamente impegnativa. Comprendere i passaggi chiave è fondamentale per un'adozione più ampia. Qui, presentiamo un protocollo progettato per supportare l'efficace implementazione di biosensori di nuova concezione nei microbi per l'imaging quantitativo a fluorescenza raziometrica in condizioni controllate.

Introduzione

I biosensori a fluorforo singolo e a doppio fluoroforo sono ampiamente utilizzati dai ricercatori per una varietà di applicazioni¹. Alcuni studi hanno impiegato analisi multiplex di biosensori per tracciare simultaneamente più segnali all'interno delle stesse cellule². Molti di questi biosensori si basano su domini di legame del ligando, dove gli eventi di legame inducono cambiamenti conformazionali che alterano le proprietà di fluorescenza ^3,4. I biosensori geneticamente codificati sono diventati strumenti essenziali per l'imaging in vivo in una gamma di sistemi⁵, consentendo il monitoraggio ad alta risoluzione dei livelli di ioni e metaboliti nello spazio e^{nel tempo.} I primi biosensori, tuttavia, erano limitati nella gamma dinamica e nel rapporto segnale/rumore (SNR)⁶. I recenti progressi nei biosensori intensiometrici a singolo fluoroforo basati su proteine fluorescenti conformazionalmente sensibili (csFP) hanno migliorato significativamente le prestazioni. Tuttavia, le variazioni nei livelli di espressione proteica possono influire sulle misurazioni in vivo utilizzando biosensori basati su fluorofori geneticamente codificati⁶, che sono comunemente impiegati per visualizzare molecole di segnalazione e metaboliti nelle cellule viventi ^7,8. I biosensori intensiometrici a singolo fluoroforo non consentono la normalizzazione dei livelli di espressione del biosensore, che possono fluttuare in vivo. L'incorporazione di una proteina fluorescente di riferimento, tuttavia, può convertire i biosensori a singolo fluoroforo in versioni raziometriche a doppio fluoroforo, consentendo quantificazioni più affidabili⁹. A causa della perdita di energia dovuta a processi non radiativi, lo spettro di emissione fluorescente viene spostato rispetto allo spettro di assorbimento, un fenomeno noto come spostamento di Stokes¹⁰. Le Large Stokes Shift Fluorescent Protein (LSSFPs) sono state impiegate come fluorofori di riferimento ottimali in biosensori raziometrici a doppio fluoroforo ^9,11. Un recente progresso è lo sviluppo di biosensori Matrioska a mela verde (GA) monocromaticamente eccitabili, noti come GA-MatryoshCaMP6s, che incorporano un LSSFP rosso, chiamato LSSmApple¹². Se combinati con microdispositivi come i sistemi microfluidici, i biosensori geneticamente codificati basati su fluorofori offrono un approccio minimamente invasivo per l'imaging raziometrico quantitativo utilizzando tecniche come la microscopia confocale. Questa integrazione consente l'imaging ad alta velocità e il monitoraggio in tempo reale della dinamica di piccole molecole in singole cellule sottoposte a stress ambientale. Ad esempio, i biosensori di cAMP e glucosio sono stati applicati con successo nel lievito. Se utilizzati in combinazione con ceppi mutanti, questi biosensori hanno contribuito a chiarire le principali reti regolatorie che regolano l'assorbimento dello zucchero^13,14. Nonostante i progressi significativi, queste tecnologie non hanno ancora raggiunto il loro pieno potenziale per studiare questioni biologiche critiche che coinvolgono la dinamica delle piccole molecole in vivo¹⁵. Di conseguenza, la loro adozione diffusa nei laboratori rimane limitata e mancano ancora metodologie standardizzate per un'implementazione più ampia.

Rispetto alle metodologie tradizionali che si basano su biosensori a fluoroforo singolo non raziometrici o su misure a livello di massa, il nostro protocollo basato sui biosensori GA Matryoshka consente l'imaging ad alta risoluzione di singole cellule con analisi raziometrica quantitativa. Integrando il grande fluoroforo di Stokes come riferimento interno, il metodo compensa la variabilità nell'espressione del biosensore, una limitazione chiave dei progetti precedenti. Inoltre, la combinazione con dispositivi microfluidici consente un controllo preciso delle condizioni ambientali, offrendo un miglioramento rispetto alle camere di perfusione convenzionali o ai sistemi di coltura statica¹². Questo approccio fornisce anche vantaggi distinti per lo studio delle interazioni dinamiche tra i microbi e i loro ospiti, come le interazioni pianta-patogeno e le associazioni simbiotiche come le micorrize, dove la risoluzione spaziale e temporale a livello cellulare è essenziale per scoprire i meccanismi molecolari della comunicazione e dello scambio di nutrienti.

In questo contesto, presentiamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'imaging raziometrico dei biosensori nei microbi. Sebbene specificamente ottimizzato per l'implementazione nel lievito, questo protocollo può essere adattato per l'uso in altri microbi, compresi i batteri, ed esteso a organismi non modello come i microbi associati alle piante. Ad esempio, i biosensori possono essere utilizzati in combinazione con sistemi microfluidici per l'imaging quantitativo a fluorescenza della segnalazione del calcio nel lievito, consentendo il monitoraggio in tempo reale delle risposte del calcio in condizioni di stress ambientale¹⁴.

Questo protocollo ha lo scopo di guidare i ricercatori nell'implementazione efficace di biosensori di nuova concezione, facendo così progredire l'esplorazione dei processi biologici attraverso l'imaging fluorescente basato su biosensori nei sistemi microbici. Include raccomandazioni pratiche sulle condizioni di coltura del lievito, sulle impostazioni ottimali di eccitazione/emissione e sulla compatibilità con i ceppi di lievito comunemente usati (ad esempio, K601 e W303-1A MAT-a). Le limitazioni degne di nota includono il fotobleaching durante sessioni di imaging prolungate e le sfide relative all'espressione dei biosensori nei campioni biologici. Poiché numerosi fattori possono influenzare l'esito degli esperimenti di imaging con biosensori in vivo , questo protocollo graduale mira anche ad aiutare i ricercatori ad anticipare e superare potenziali sfide, facilitando così implementazioni riproducibili.

Protocollo

1. Progettazione razionale di biosensori raziometrici (Figura 1)

NOTA: La proteina legante di interesse viene selezionata come dominio sensoriale in base a criteri pertinenti, tra cui (i) specificità, (ii) affinità, (iii) informazioni strutturali e (iv) riarrangiamento della conformazione al legame con il ligando. La specificità garantisce che il biosensore risponda selettivamente alla molecola bersaglio senza cross-reattività. Si ritiene che l'affinità sia allineata con l'intervallo di concentrazione atteso della molecola bersaglio nel contesto biologico. Le informazioni strutturali, derivate da dati sperimentali o modelli computazionali come quelli generati da AlphaFold, forniscono informazioni sull'organizzazione tridimensionale del dominio sensoriale e sui cambiamenti conformazionali indotti dal ligando. Queste informazioni vengono utilizzate per identificare i punti di inserzione adatti per i fluorofori. Viene quindi sviluppata una strategia di convalida per valutare la reattività e la gamma dinamica del biosensore, a seconda delle applicazioni previste.

1. Costruire il design Matrioska in silico inserendo la cassetta Matrioska¹² della Mela Verde nel dominio sensoriale in modo tale che la proteina fluorescente verde (cpGFP) permutata circolarmente, che è sensibile ai cambiamenti conformazionali, risponda ai riarrangiamenti del dominio sensoriale indotti dal legame del ligando.
   1. Utilizzare software di visualizzazione molecolare, come Chimera, per analizzare la struttura del dominio di legame. Se la struttura tridimensionale non è disponibile, utilizzare AlphaFold per generare un modello affidabile.
   2. Identificare le anse flessibili all'interno della struttura proteica come punti deboli e potenziali siti di inserzione per la cassetta a doppio fluoroforo, scelti per evitare di interrompere la funzione o la stabilità complessiva della proteina.
   3. Utilizzare nuovamente AlphaFold per prevedere la struttura della proteina chimerica contenente la cassetta dual-FP inserita, confermando che l'inserimento non introduce cambiamenti strutturali sfavorevoli.
   4. Clonare i costrutti del biosensore in DNA plasmidico che ne consente l'espressione nelle cellule di lievito. In particolare, inserire il gene che codifica per il biosensore di nuova concezione nel vettore navetta del lievito pAG416, che contiene elementi appropriati per l'espressione del lievito, utilizzando una tecnica di clonaggio adatta 12,13,14.
   5. Dopo il clonaggio, trasformare il plasmide ricombinante in cellule batteriche per l'amplificazione del DNA plasmidico. Utilizzare DNA plasmidico purificato per la trasformazione del lievito.
   6. Introdurre il plasmide purificato nelle cellule di lievito attraverso la trasformazione mediata da polietilenglicole (PEG) come pubblicato¹⁶. Cellule di lievito trasformate su piastra su terreni carenti di uracile, che selezionano i cloni positivi contenenti il plasmide che trasporta il marcatore di selezione URA3.

2. Preparazione del campione

1. Striare i trasformanti del lievito che esprimono i biosensori GA-Matrioska su piastre di terreno selettive (ad es. SC-Ura) e incubare a 30 °C per 2-3 giorni per consentire la crescita delle colonie.
   NOTA: Il ceppo di lievito è portatore di un'auxotrofia ura3, che è completata dal gene URA3 sul plasmide, consentendo la selezione su terreni carenti di uracile. Il plasmide che codifica per il biosensore include una cassetta che integra l'auxotrofia (ad esempio, pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
2. Generare trasformanti di lievito dal ceppo K601/W303-1A MAT-a (genotipo: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Eseguire la trasformazione con un vettore di espressione comunemente usato per Saccharomyces cerevisiae, come pAG416¹².
3. Dopo la trasformazione, coltivare cellule di lievito a 30 °C su terreno SC-Ura, preparate per litro come segue, fino a quando non compaiono colonie trasformate indipendentemente: 0,77 g CSM-Ura, 6,7 g di base azotata di lievito (YNB) con solfato di ammonio, 20 g di glucosio, 20 g di agar e adenina aggiunti a una concentrazione finale di 150 μM.
4. Preparare cellule di lievito competenti ed eseguire la trasformazione mediata da PEG 3350 secondo un protocollo stabilito¹⁶.
5. Per gli esperimenti di intrappolamento di cellule microfluidiche, strisciare il 25% di stock di glicerolo su piastre SC-Ura e incubare a 30 °C per 2 giorni per consentire la crescita di singole colonie indipendenti. Risospendere le singole colonie in 5 mL di terreno liquido SC-Ura e incubare a 30 °C agitando fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5-1,0, rendendole adatte al caricamento nel sistema di perfusione.

3. Preparazione del sistema di perfusione (Figura 2)

1. Preparare la piastra microfluidica per le cellule di lievito aploidi caricandola con 50 μL di cellule di lievito che esprimono biosensori GA-Matryoshka, insieme ai terreni SC-Ura finali per la crescita e alla soluzione tamponata per i trattamenti (ad esempio, NaCl o sorbitolo).
   1. Rimuovere la soluzione di conservazione dai pozzetti 1-8. Aspirare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) dai pozzetti e aggiungere 400 μl di acqua sterile.
   2. Lavare i pozzetti 1-6 e 8. Lavaggio 1: Aspirare la soluzione di acqua sterile dai pozzetti 1-8 e aggiungere 400 μL di acqua sterile. Lavaggio 2: Ripetere il lavaggio aspirando e aggiungendo 400 μL di acqua sterile. Lavaggio 3: Ripetere ancora una volta con 400 μL di acqua sterile.
   3. Riempimento finale per pozzetti 1-6: aspirare la soluzione acquosa e aggiungere 300 μl di soluzioni finali di perfusione/crescita come SC-Ura per la crescita del lievito o una soluzione tampone contenente gli analiti di interesse per il trattamento.
   4. Caricamento cellulare nel pozzetto 8: aggiungere 50 μL di sospensione cellulare di lievito (OD600=0,5-1,0).
2. Sigillare le piastre con il collettore a temperatura controllata della piattaforma microfluidica e collegarlo al sistema di imaging di cellule vive. I collettori mantengono un ambiente termico stabile a una temperatura di 28 °C, mentre i tubi e una pompa garantiscono una corretta tenuta e una perfusione continua.
   1. Allineare la piastra sul collettore. Accendi l'aspirapolvere. Accendere la piattaforma microfluidica.
   2. Premere Seal e attendere che la luce verde si accenda. Aprire il software della piattaforma microfluidica, creare un nuovo esperimento e selezionare la piastra di lievito appropriata dall'elenco a discesa.
   3. Fare clic sul pulsante Esegui sequenza di adescamento liquido . Fare clic sulla sequenza di caricamento delle cellule di esecuzione per caricare le cellule di lievito dal pozzo 8 nella camera di coltura, dove verranno intrappolate e coltivate sotto perfusione continua di terreno selettivo SC-Ura durante la notte a 10 kPa a 28 °C.
   4. Nella scheda Modalità manuale, fare clic su Esegui una sequenza personalizzata o utilizzare l'editor di protocollo per impostare parametri sperimentali come la temperatura a 30 °C, la portata a 10 kPa, la durata del passo (ad esempio, 10 min) e i canali da aprire per la perfusione.
3. Far crescere le cellule per una notte nella camera di coltura in perfusione continua con terreno selettivo SC-Ura a 28 °C e una pressione di 10-17 kPa.

4. Imaging a fluorescenza raziometrica (Figura 3, Figura 4 e Video 1)

1. Valuta la crescita e la fluorescenza cellulare attraverso una rapida visualizzazione microscopica.
   1. Posizionare la piastra microfluidica sul tavolino di un microscopio invertito. Concentrati sul centro dell'area di visualizzazione per individuare le celle.
   2. Utilizzare la microscopia a campo chiaro e/o a fluorescenza per valutare la morfologia cellulare, la vitalità e l'espressione dei biosensori.
2. Studiare la dinamica dello stato stazionario del calcio in condizioni controllate con precisione utilizzando il sistema microfluidico e le piastre microfluidiche compatibili 4,12,13,14.
3. Esegui l'imaging di cellule vive utilizzando un microscopio confocale a scansione laser invertito con ingrandimento a100x e un'apertura numerica (NA) di 1,40. Monitora i biosensori a doppio fluoroforo eccitando GFP e LSSmApple a 488 nm utilizzando un laser ad argon. Raccogliere segnali di emissione a 520 nm per GFP e 610 nm per LSSmApple (Figura 5) e condurre esperimenti di imaging a fluorescenza raziometrica per quantificare le risposte dinamiche del biosensore. Misurare il rapporto tra le intensità di emissione (GFP/LSSmApple) nel tempo per monitorare le variazioni indotte dall'analita.

5. Analisi delle immagini con software open source (Figura 6)

1. Procuratevi il CellProfiler o qualsiasi altro software simile dal repository ufficiale e installatelo su una workstation locale.
2. Organizza le immagini di microscopia a fluorescenza time-lapse in ordine sequenziale (ad es. img_001.tif, img_002.tif, ecc.) per garantire la compatibilità con l'elaborazione batch automatizzata.
3. Avviare il software e inizializzare una nuova pipeline di analisi selezionando Nuovo progetto. Importare la sequenza di immagini time-lapse nell'area di lavoro della pipeline.
4. Incorpora il modulo IdentifyPrimaryObjects per rilevare le singole cellule all'interno di ciascun fotogramma in base al segnale di fluorescenza o ai criteri morfologici.
5. Aggiungere il modulo TrackObjects per stabilire corrispondenze temporali tra le celle tra i fotogrammi, consentendo il tracciamento di singole celle nel tempo.
6. Includere il modulo MeasureObjectIntensity per quantificare i parametri di intensità della fluorescenza (ad esempio, media, mediana e intensità integrata) per ogni cella tracciata.
7. Utilizza il modulo ExportToSpreadsheet per compilare ed esportare dati quantitativi in un formato tabulare (ad esempio, CSV) per l'analisi a valle.
8. Analizza i dati esportati utilizzando strumenti statistici o di visualizzazione dei dati come il software per fogli di calcolo.

Risultati

Per ottenere il successo dell'imaging raziometrico dei biosensori nei sistemi microbici, è necessario affrontare diverse sfide tecniche.

Sistema di espressione: La prima sfida risiede nella selezione del sistema di espressione; sia basati su plasmidi, cromosomicamente integrati, guidati da promotori costitutivi o inducibili e con o senza tag di targeting subcellulare. Questi fattori possono influenzare in modo significativo la stabilità, la tossicità e la localizzazione del biosensore all'inte...

Discussione

I biosensori basati su fluorofori geneticamente codificati consentono il monitoraggio in tempo reale delle concentrazioni intracellulari di analiti nelle cellule viventi¹. Questi biosensori funzionano tipicamente convertendo i cambiamenti conformazionali in segnali ottici, che possono essere rilevati sia raziometricamente che intensamente. I biosensori intensiometrici si basano sulle variazioni di intensità della fluorescenza di un singolo FP, il che li rende sens...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
CellASIC ONIX plate per cellule di lievito aploidi	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glucosio	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbitolo	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Per l'espressione del GA-MatryoshCaMP6s nel lievito
TCS SP8 STED Leica		NA
Ceppo di lievito K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-Mating Factor acetato sale	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG