Articolo metodologico

Utilizzo del metodo di trasferimento delle goccioline per preparare in modo affidabile vescicole unilamellari giganti

DOI:

10.3791/68340

⸱

19 settembre 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa guida per principianti presenta un protocollo generale per la preparazione di vescicole unilamellari giganti (GUV) tramite il metodo del trasferimento di goccioline, discutendo i passaggi critici e fornendo approfondimenti per aiutare le possibili regolazioni necessarie per diverse applicazioni, tra cui la biologia sintetica e la microrobotica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi due decenni, il metodo di trasferimento delle gocce, noto anche come emulsione invertita, doppia emulsione, trasferimento di fase o trasferimento di emulsione, si è dimostrato vantaggioso per la preparazione di vescicole unilamellari giganti (GUV) e, in particolare, per caricarle con carichi diversi, svolgendo così un ruolo cruciale nella biologia sintetica. A causa dell'efficienza dell'incapsulamento e della semplicità di esecuzione, è stato ampiamente utilizzato per lo sviluppo di cellule artificiali. In letteratura si osserva una grande variabilità in diversi parametri, che porta a risultati estremamente variabili. Ciò è in parte dovuto agli aggiustamenti necessari per le diverse esigenze e applicazioni di questo metodo versatile, ma potrebbe rivelarsi disorientante per i ricercatori che si avvicinano a questa tecnica per la prima volta.

Per fornire ai principianti una comprensione di base del metodo e del ruolo dei parametri critici, viene presentato un protocollo insieme a suggerimenti sui principi fisico-chimici fondamentali alla base della formazione di GUV attraverso il trasferimento di goccioline. Questa guida passo passo per la preparazione dei GUV include quindi considerazioni e suggerimenti pratici basati sulla letteratura e sull'esperienza diretta.

Considerando le possibili fonti di variabilità, alcuni aspetti sono identificati come critici: la sensibilità dei fosfolipidi alla luce, all'ossidazione e all'idrolisi; la scelta dell'olio per sciogliere i fosfolipidi (la soluzione lipidica o LS); e il recupero dei GUV dopo la centrifugazione. Vengono proposte misure efficaci in termini di costi per ridurre al minimo l'interferenza dell'ossigeno atmosferico e dell'umidità. Per aiutare a identificare le combinazioni appropriate di olio e fosfolipidi, il protocollo generale è integrato da una discussione sulle proprietà fisico-chimiche rilevanti del LS. Infine, per evitare procedure impraticabili, viene proposto un metodo semplice e sicuro per rimuovere completamente la fase oleosa in una sola volta e recuperare una dispersione GUV pulita. Queste misure accelerano l'attuazione di aggiustamenti alle nuove composizioni GUV, ampliando potenzialmente la loro adozione nella biologia sintetica e nei campi limitrofi, compresa la microrobotica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implementando una tecnica precedentemente descritta per produrre liposomi1, Pautot et al. hanno stabilito un protocollo per produrre vescicole lipidiche con diametri compresi tra 0,1 e 1 μm di diametro2. Il metodo di trasferimento delle gocce si è rapidamente dimostrato efficace nella produzione di vescicole ancora più grandi (diametri superiori a 1 μm)3, guadagnando sempre più popolarità per la semplicità di esecuzione e l'elevata efficienza di incapsulamento. Infatti, rispetto ai metodi di rigonfiamento (come il rigonfiamento del gel o l'elettroformazione), questo protocollo riduce il volume di soluzione di carico necessario per formare un numero comparabile di vescicole e i rifiuti associati4. I GUV possono essere assemblati da interfacce fluide attraverso metodi alternativi con un'efficienza di incapsulamento comparabile. Tuttavia, rispetto a quelli basati su chip microfluidici 5,6 o incapsulamento continuo dell'interfaccia di goccia (cDICE)7, il trasferimento di gocce offre la configurazione più semplice accessibile in qualsiasi laboratorio con apparecchiature di base. Inoltre, i metodi microfluidici possono portare a GUV con inclusioni di olio indesiderate nella membrana. Per questi motivi, il trasferimento di goccioline è stato il metodo di scelta per caricare i GUV con carichi di valore nei campi delle celle artificiali 3,8,9,10 e, recentemente, della microrobotica 11,12.

Il metodo si basa sulla formazione di lembi di membrane attraverso la stabilizzazione delle interfacce acqua/olio mediate dai fosfolipidi. In primo luogo, i fosfolipidi vengono disciolti in un olio (soluzione lipidica, LS), quindi viene preparata un'emulsione acqua-in-olio con la soluzione acquosa contenente il carico GUV desiderato (soluzione interna, IS) nel LS oleoso. L'emulsione viene quindi trasferita in un tubo dove un'altra soluzione acquosa (denominata soluzione esterna, OS) è stata precedentemente bilanciata con LS per formare un'interfaccia acqua-olio. I GUV si formano quando le goccioline d'acqua sono costrette ad attraversare questa interfaccia OS/LS mediante centrifugazione: il lembo interno dei GUV si forma sulla superficie delle goccioline IS, mentre il lembo esterno si forma tra OS e LS (Figura 1).

Sono state descritte molte varianti di protocollo con parametri aggiustati in base alle esigenze sperimentali contingenti. Un primo tentativo esteso di ottimizzare il processo è stato descritto da Moga et al.13, mentre Zhang et al. ha raccolto la maggior parte degli esempi rilevanti in una recente revisione14. Nonostante i numerosi parametri descritti che influenzano il protocollo, non vi è alcuna indicazione su come potrebbe essere condotto un processo di ottimizzazione per una nuova formulazione di GUV, né le migliori pratiche per il recupero e la manipolazione dei GUV dopo la produzione. Sulla base della letteratura scientifica disponibile e della nostra esperienza diretta, forniamo qui un protocollo generale per produrre GUV discutendo i principi di base. Così facendo, forniamo indicazioni utili per l'ottimizzazione di nuove formulazioni di GUV e due accorgimenti sempre applicabili al protocollo: la preparazione di LS in ambiente controllato e un metodo per rimuovere facilmente la fase oleosa superiore per il recupero di un campione di GUV pulito. Abbiamo scelto due esempi: uno con 240 mM di saccarosio come IS e 0,2 mM di DOPC in olio siliconico AR20 come LS (condizione E [vuoto], vedi Tabella 1) e l'altro composto da 0,2% di microparticelle di polistirene da 1,1 μm in 240 mM di saccarosio come IS e 3,18 mM di DOPC in olio minerale come LS (condizione P [con particelle], vedi Tabella 1). Entrambi i campioni sono stati prodotti con 240 mM di glucosio come OS. Abbiamo scelto questa osmolarità per ottenere GUV che, in condizioni fisiologiche, hanno una membrana lipidica rilassata (bassa tensione di membrana).

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Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo di trasferimento delle goccioline. (A) Tre soluzioni vengono preparate in fiale separate: fosfolipidi in olio (fase gialla) per formare una soluzione lipidica, una soluzione contenente saccarosio (in ciano) come soluzione interna e una soluzione equiosmolare di glucosio (bianca) come soluzione esterna. (B) LS viene quindi miscelato con l'IS per formare un'emulsione stabile, quindi (C) un'interfaccia tra OS e LS viene lasciata equilibrare prima che (D) l'emulsione venga versata sopra di essa. (E) Le goccioline d'acqua sono costrette ad attraversare l'interfaccia LS/OS mediante forza centrifuga per (F) consentire la formazione di GUV. La figura non è in scala e ha lo scopo di fornire solo uno schema del metodo. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; IS = soluzione interna; OS = soluzione esterna; GUV = vescicola unilamellare gigante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Salvo diversa indicazione, i processi vengono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparazione di soluzioni acquose (IS e OS)
    1. In due diverse navicelle di pesatura, pesare 2,16 g di glucosio e la quantità di saccarosio specificata nella Tabella 1. Aggiungere le polveri in due becher da 150 ml, aggiungere 40 ml di acqua ultrapura e mescolare mescolando.
    2. Trasferire le soluzioni in due cilindri da 50 mL e aggiungere acqua ultrapura fino a 50 mL per ottenere 240 mM di soluzioni di glucosio e soluzioni di saccarosio con le concentrazioni indicate nella Tabella 1. Coprire i cilindri con un pezzo di parafilm e mescolare le soluzioni capovolgendo i cilindri alcune volte.
    3. Filtrare le soluzioni con siringhe da 50 mL e filtri da 0,22 μm per prevenire la contaminazione da microrganismi.
    4. Per la condizione P, preparare la seguente miscela: 2 μL di 100 mg/mL, 1,1 μm di dispersione di particelle di polistirene, 24 μL di soluzione di saccarosio preparata nella fase 1.1.1 e acqua ultrapura fino a 100 μL (sospensione finale: 0,2% di microparticelle in 240 mM di soluzione di saccarosio). Conservare le soluzioni a +4 °C per un massimo di 1 settimana o preparare aliquote da 1 mL in provette da 1,5 mL e conservare a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
  2. Allestimento di una camera a guanti per la preparazione di LS in un ambiente controllato
    1. Tagliare cinque pezzi di tubo di silicone con un diametro interno di 7 mm, un diametro esterno di 13 mm e le lunghezze indicate nella tabella 2 (tubi da 1 a 5).
    2. Tagliare quattro pezzi di tubo di silicone con un diametro interno di 3 mm, un diametro esterno di 7 mm e le lunghezze indicate nella Tabella 2 (tubi da 6 a 9).
    3. Collegare un'estremità del tubo 1 a una valvola a due vie e l'altra estremità a una giunzione a tre vie (Figura 2A).
    4. Collegare il tubo 2 alle altre estremità della valvola a due vie, quindi collegare il tubo 3 e il tubo 4 alla giunzione a tre vie, con il tubo 3 collegato all'estremità opposta al tubo 1 (Figura 2A).
    5. Collegare l'estremità libera del tubo 4 all'ingresso della camera del vano portaoggetti (tubo di ingresso, Figura 2B).
    6. Collegare la valvola a tre vie fornita con la camera del vano portaoggetti all'uscita, quindi collegare la valvola al tubo 5 (tubo di uscita, Figura 2C).
    7. Collegare un'estremità del tubo 6 a un ago da 18 G e l'altra estremità a una giunzione a due vie. Ripetere l'operazione con il tubo 7 e l'ago da 21 G (Figura 2D).
    8. Inserire i due aghi in un tappo per flaconcino con setto: questo tappo porta-aghi permetterà l'afflusso controllato di azoto e il deflusso di azoto e cloroformio. Conservare il tappo in una provetta vuota da 50 ml senza tappo per evitare il contatto con gli aghi (Figura 2D).
    9. Schiacciare e inserire i tubi 8 e 9, rispettivamente, nelle aperture di ingresso e uscita dal lato interno della camera del vano portaoggetti (Figura 2E).
  3. Preparazione di LS
    1. Spostare la camera del vano portaoggetti all'interno o accanto a un cappuccio chimico. Aprire la camera del vano portaoggetti e inserire un cristallizzatore riempito con particelle di silice sul fondo della camera (Figura 2F). Coprire il cristallizzatore con la superficie di supporto bianca e coprirlo con carta assorbente.
    2. Inserire tutti i materiali necessari nella camera del vano portaoggetti (Figura 2G): un igrometro, la 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) in soluzione di cloroformio, l'olio o gli oli (Tabella 1), flaconcini di vetro scuro da 20 mL puliti (aperti e con i rispettivi tappi), una siringa Hamilton (Tabella 1), una micropipetta P10000 e puntali. Mettere il flaconcino di vetro contenente la soluzione di cloroformio su un anello di sughero, un becher da 150 ml o qualsiasi altro supporto adatto il più vicino possibile al lato dell'operatore.
      NOTA: Questa precauzione impedirà il ribaltamento delle bottiglie causato dal gonfiaggio e dallo sgonfiaggio dei guanti durante i cicli di vuoto e flusso di azoto.
    3. Chiudere la camera del guanti, assicurandosi che le due metà non possano scivolare, e sigillarle con le viti di plastica fornite con la camera del guanti.
    4. Chiudere la valvola di scarico e immergere il tubo 5 in un becher da 500 ml riempito a metà d'acqua (Figura 2H).
    5. Collegare l'estremità regolata dalla valvola del tubo di ingresso (tubo 2) alla linea del vuoto e l'altra estremità all'azoto (tubo 3, Figura 2A). La camera del vano portaoggetti è ora completamente impostata come mostrato nella Figura 2J.
    6. Aprire la valvola e la linea del vuoto fino a quando la depressurizzazione gonfia i guanti al punto da renderli troppo rigidi per piegarsi. Chiudere la linea del vuoto e la valvola.
    7. Aprire l'azoto fino a quando la pressione sgonfia i guanti al punto da farli uscire dalla camera del guanti. Chiudere la linea dell'azoto.
    8. Ripetere i passaggi da 1.3.6 a 1.3.7 almeno 10 volte, assicurandosi che l'umidità interna scenda al di sotto del 40%.
    9. Controllare la pressione interna con il vuoto e l'azoto per facilitare l'operatore nell'indossare i guanti.
    10. Utilizzando la siringa di Hamilton, trasferire il volume di DOPC nella soluzione di cloroformio indicata nella Tabella 1 in un flaconcino di vetro scuro. Chiudere il flaconcino con il tappo porta-aghi preparato al punto 1.2.9.
    11. Collegare il tubo 6 al tubo 8 e il tubo 7 al tubo 9 tramite le giunzioni a due vie (Figura 2I).
    12. Togliere i guanti e aprire la valvola di uscita.
      NOTA: Un secondo operatore potrebbe aiutare dai passaggi 1.3.13 a 1.3.15 per velocizzare il processo.
    13. Aprire il flusso di azoto molto lentamente e controllare il flusso di gas osservando le bolle nel becher dove era precedentemente posizionato il tubo 5 (passaggio 1.3.4). Regolare gradualmente il flusso di azoto fino a raggiungere una velocità relativamente alta alla quale le singole bolle rimangono osservabili. Lasciare fluire l'azoto per 3 minuti, quindi chiudere la linea dell'azoto.
      NOTA: Un'eccessiva pressione dell'azoto può causare la dispersione della soluzione DOPC in cloroformio in tutta la fiala, diminuendo la quantità di fosfolipide disponibile per la successiva soluzione lipidica (LS). Inoltre, l'alta pressione aumenta il rischio che gli aghi vengano espulsi dalla fiala. Pertanto, è essenziale regolare attentamente il flusso di azoto a un livello ottimale che mescoli delicatamente il cloroformio senza causare schizzi incontrollati.
    14. Nel frattempo, preparare un bagnomaria in un cristallizzatore e scaldarlo a 80 °C su una piastra calda.
    15. Attendere che l'ultima bolla sia uscita nel becher, quindi chiudere la valvola di uscita. Indossare nuovamente i guanti e scollegare i tubi 8 e 9 dalle giunzioni a due vie.
    16. Controllare che tutto il cloroformio sia evaporato dalla fiala scura, quindi aprirla e riportare il tappo nella provetta da 50 mL. Aprire il flacone dell'olio, trasferire il volume di olio richiesto (Tabella 1) nel flaconcino scuro e chiuderlo con il tappo. Togliete i guanti e aprite la camera del guanti.
    17. Sigillare l'LS con parafilm. Agitare energicamente la fiala per almeno 30 s. Incubare a 80 °C per 30 minuti nel bagnomaria preparato al punto 1.3.14. Agitare energicamente la fiala per almeno 30 s. Incubare a temperatura ambiente per una notte.
    18. Procedere con la preparazione dei GUV o conservarli a +4 °C per un massimo di 1 settimana.
      NOTA: Nelle preparazioni GUV asimmetriche, è possibile utilizzare due diversi LS per l'interfaccia e l'emulsione per ottenere due diversi lembi di membrana15.

2. Produzione GUV

  1. Allestimento di un contenitore per una facile rimozione dell'olio
    1. Con un paio di forbici, tagliare il tappo di una provetta da 5 ml. Praticare un foro di ~8 mm al centro del cappuccio e verificare che il foro sia sufficientemente largo da consentire l'inserimento e il bloccaggio di una punta P1000 (Figura 3A). Se il foro è troppo stretto, ripetere i due passaggi precedenti; Se troppo largo, scartare il tappo e ricominciare con uno nuovo dal passaggio 2.1.1.
    2. Taglia un pezzo di carta vetrata di 2 x 5 cm e leviga il foro. Riposizionare il tappo forato sopra la provetta da 5 ml e centrifugare a 3.000 × g per 5 minuti per rimuovere tutti i detriti di plastica residui dal foro. Rimuovere il tappo e gettare il tubo.
    3. Tagliare il tappo di una nuova provetta da 5 ml e sostituirla con il tappo forato. Posizionare un O-ring sopra il tappo e inserire una punta P1000 attraverso il foro. Bloccare l'O-ring tra la punta e il tappo e verificare che la punta non possa essere spinta ulteriormente verso il basso nel tubo (Figura 3B). Riempire la provetta da 5 mL con 5,5 mL di OS attraverso la punta.
  2. Formazione dell'interfaccia OS/LS
    1. Preparare un bagnomaria in un cristallizzatore e scaldarlo a 50 °C su una piastra calda.
    2. Agitare energicamente il flaconcino di LS preparato nel paragrafo 1.3 per almeno 30 s. Riscaldare l'LS a 50 °C a bagnomaria per 30 minuti.
    3. Equilibrare le soluzioni acquose preparate nella sezione 1.1 a temperatura ambiente per almeno 10 minuti.
    4. Pipettare 300 μL di OS in una provetta da 1,5 mL o in una provetta da 5 mL modificata secondo il passaggio 2.1. Pipettare lentamente 100 μL di LS sopra l'OS, assicurandosi che si formino due fasi distinte e continue nella provetta. Lasciare che l'interfaccia si equilibri per 10 minuti.
      NOTA: Per consentire la formazione di un monostrato omogeneo di fosfolipidi, il LS deve essere distribuito in modo omogeneo sopra l'OS (Figura 4A). Se lo strato di LS non è continuo, ridistribuire il volume di LS con una micropipetta o aumentare il volume di LS (questo può essere molto utile con oli altamente viscosi come la paraffina).
  3. Formazione di emulsioni acqua-in-olio
    1. In una provetta da 2 mL, pipettare, nell'ordine, 250 μL di LS e 6,25 μL di IS per un'emulsione al 2,5% di acqua in olio.
      NOTA: Nella nostra esperienza, questo rapporto acqua-in-olio molto probabilmente fornisce un'emulsione stabile, aumentando così il tasso di successo del protocollo (Figura 5). Per aumentare la resa di GUV, si consiglia di aumentare il volume dell'emulsione piuttosto che il rapporto IS/LS.
    2. Miscelare le due fasi utilizzando uno o più dei seguenti metodi fino a ottenere una miscela omogenea e stabile: vortice, agitazione meccanica su un rack standard per microprovette o picchiettamento della provetta con un dito (vedere la Figura 5 per esempi di emulsione omogenea).
    3. Trasferire 200 μl di emulsione sopra l'interfaccia OS/LS preparata nella sezione 2.2.
    4. Se si utilizza una provetta da 1,5 mL, è sufficiente chiudere la provetta; se si utilizza la provetta da 5 mL modificata della sezione 2.1, posizionare un tappo di gomma sulla parte superiore della punta e trasferire con cura la provetta in una provetta conica da 50 mL.
  4. Trasferimento di goccioline tramite centrifugazione
    1. Centrifugare le provette a temperatura ambiente seguendo le indicazioni della Tabella 1. Al termine della centrifugazione, verificare la presenza di un pellet opaco sul fondo della provetta e di una fase oleosa limpida nella parte superiore.

3. Recupero GUV

  1. Rimozione dell'olio
    NOTA: In base alle esigenze sperimentali, l'olio può essere rimosso in tre diversi passaggi alternativi.
    1. Se i GUV sono stati preparati in provette standard da 1,5 mL, rimuovere lentamente l'olio con l'aiuto di una pipetta P1000 e di una P200 per le ultime gocce, assicurandosi che il pellet non venga disturbato.
      NOTA: I puntali più stretti aiutano la rimozione dell'olio, quindi l'inserimento di un puntale per volumi più piccoli (10-200 μl) in un puntale P1000 migliorerà la precisione di questo passaggio.
    2. Se si tratta di più preparati GUV in diverse provette da 1,5 mL, rimuovere l'olio con l'aiuto di un pallone Büchner. Collegare un pezzo di un tubo in silicone di grosso spessore (diametro interno 7 mm, esterno 13 mm) alla linea del vuoto e inserire un altro tubo sull'apertura del pallone, sigillandolo con una guarnizione in gomma. All'altra estremità di questo tubo, inserire una punta P1000, avvolgerla con parafilm, tagliare circa 3 mm della punta e inserirla in una punta P200. Aprire il vuoto e aspirare l'olio con la punta P200, quindi chiudere il vuoto e rimuovere le ultime gocce attraverso una pipetta P200.
    3. Se i GUV sono stati preparati nel contenitore descritto al punto 2.1, rimuovere la punta dal tubo, assicurandosi che il tappo di gomma non si stacchi (Figura 3D). Quindi, scartare la punta e conservare il tappo di gomma, l'O-ring e il tappo forato per il riutilizzo.
    4. Con l'aiuto di una micropipetta P1000, rimuovere l'OS dalla provetta (Figura 3E), lasciando circa 50 μL del volume, assicurandosi che il pellet non venga disturbato.
    5. Cambiare la punta, risospendere il pellet nel volume rimanente e trasferirlo in una provetta pulita da 2 mL.
  2. Lavaggi GUV
    NOTA: Lo scopo di questi passaggi è quello di rimuovere le tracce della fase oleosa che non sono state rimosse nel passaggio 3.1. Se necessario, i passaggi 3.2.1 e 3.2.2 devono essere ripetuti fino a quando non si osserva alcuna goccia d'olio nel tubo.
    1. Riempire la provetta con 2 mL di OS e centrifugare a 1.500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere l'OS, lasciando circa 50 μL di volume, assicurandosi che il pellet non venga disturbato.
    3. Ripeti gli ultimi due passaggi.
  3. Equilibratura dei volumi
    NOTA: Includiamo questa sezione per consentire un confronto delle rese tra i diversi preparati GUV.
    1. Con una micropipetta P200, risospendere il pellet nei 50 μl del volume residuo dall'ultima ripetizione del passaggio 3.2.2.
    2. Misurare questo volume impostando la pipetta su 20 e aumentando il volume con il puntale immerso nella dispersione GUV senza toccare la parete del tubo per consentire al liquido di fluire all'interno del puntale.
    3. Aggiungere OS per raggiungere il volume finale di 100 μl.

4. Osservazione e analisi dimensionale

  1. Acquisizione di immagini microscopiche
    1. Miscelare delicatamente la dispersione GUV picchiettando il tubo con un dito.
    2. Caricare una camera Burker con 10 μl di campione GUV e attendere almeno 5 minuti per consentire ai GUV di sedimentare sul fondo della camera.
    3. Osservare il campione al microscopio a contrasto di fase. Utilizzando le linee di Burker come riferimenti, spostati sul campione e acquisisci almeno 20 immagini, assicurandoti che le aree di osservazione non si sovrappongano.
  2. Analisi dimensionale
    1. Caricare le immagini su ImageJ.
    2. Per calcolare il fattore di conversione pixel/μm, scegliere un'immagine che mostri un quadrato di 50 x 50 μm della camera Burker (fare riferimento alla scheda tecnica del produttore per la corretta identificazione), quindi selezionare lo strumento di selezione della linea retta , tracciare una linea tra due angoli consecutivi del quadrato e misurare la linea facendo clic su Analizza | Misurare. Ripeti 3 volte e calcola il valore medio.
    3. Imposta il fattore di conversione cliccando su Analizza | Imposta la scala. Inserire il valore del passaggio 4.2.2 nella casella Distanza in pixel, quindi inserire il valore 50 in Distanza nota e μm in Unità di lunghezza.
    4. Fare clic su Analizza | Impostare le misurazioni e selezionare la casella Area . Seleziona lo strumento di selezione ovale , quindi fai clic con il pulsante sinistro del mouse e tieni premuto il tasto Maiusc per sovrapporre il cerchio risultante attorno a un GUV. Misurare il diametro cliccando su Analizza | Misurare. Ripeti l'operazione per ogni GUV in ogni immagine.
    5. Nella finestra Risultati, fare clic su File | Salva con nome... per esportare il file csv dell'area di GUV, quindi analizza la distribuzione dimensionale con lo script disponibile su GitHub16.
      NOTA: È possibile saltare il passaggio 4.2.3 ed eseguire lo script specificando il fattore di conversione pixel/μm. Per calcolare questo valore, dividere per 50 il valore ottenuto al punto 4.2.2.

Risultati

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Una preparazione ottimale di GUV è caratterizzata dalla formazione di una fase oleosa limpida e di un pellet distinto (Figura 4A). Nei casi in cui le goccioline d'acqua non riescono a convertirsi in GUV, in genere collassano e lasciano detriti fosfolipidi all'interfaccia OS/LS (Figura 4C). Questo effetto è molto probabilmente causato dall'aggregazione di fosfolipidi e altre molecole dalla fase oleosa, risultante da un insufficiente equilibrio dei fosfolipidi all'interfaccia acqua/olio. Tuttavia, nonostante l'assenza di un pellet visibile o la presenza di detriti all'interfaccia, i GUV possono ancora formarsi, consentendo al processo di continuare. Sebbene le fasi di lavaggio non siano del tutto efficaci nella rimozione di tutti i detriti fosfolipidici, aiutano in modo significativo nell'eliminazione delle goccioline d'olio, migliorando la qualità complessiva del campione (confrontare la Figura 6A e la Figura 6B).

L'uso di vecchi LS o LS preparati in condizioni di elevata umidità spesso si traduce in una riduzione delle dispersioni di GUV con una resa inferiore e un contenuto più elevato di aggregati disordinati che sono molto probabilmente formati da fosfolipidi e altre molecole dalla fase oleosa (Figura 6C). Per i LS preparati in condizioni di elevata umidità, abbiamo osservato coefficienti di variazione superiori a 0,8 nella produzione di GUV (con campioni contenenti pochissimi GUV), mentre per i LS preparati nella camera a guanti modificata, il coefficiente di variazione era inferiore a 0,5.

Diverse condizioni di centrifugazione possono influire sulla resa e sulla qualità del GUV. Da un'analisi qualitativa, 20 minuti a 3.300 ×g sono stati identificati come una buona condizione per i GUV caricati con saccarosio (campione E). L'abbassamento della velocità (45 min a 500 × g) ha comportato una resa ridotta, mentre un aumento (5 min a 16.600 × g) ha portato a una maggiore formazione di aggregati fosfolipidici disordinati. Una forza centrifuga debole può impedire a molte goccioline di attraversare l'interfaccia OS/LS, da qui la resa ridotta, mentre una forza forte può non fornire tempo sufficiente per l'organizzazione dei fosfolipidi sul lembo esterno durante l'attraversamento dell'interfaccia (Figura 7). L'incapsulamento delle microparticelle può anche essere ottimizzato con regolazioni dei parametri di centrifugazione, a condizione che la densità di massa delle microparticelle corrisponda approssimativamente a quella dell'IS. A questo scopo, l'abbassamento dell'accelerazione di centrifugazione (e a sua volta l'aumento del tempo di centrifugazione) consente un incapsulamento più omogeneo delle particelle, evitando la rottura della membrana fosfolipidica dovuta alla forza esercitata dalle particelle solide (un esempio di buon incapsulamento è mostrato nella Figura 6D mentre lo studio dei parametri ottimali di centrifugazione è ancora in corso17).

Poiché la diffusione dei fosfolipidi può essere influenzata dalla fase oleosa, è possibile eseguire un semplice test qualitativo per valutare la stabilità dell'emulsione (Figura 5). Con l'aiuto di un colorante colorante (Brilliant Blue FCF) disciolto nell'IS per migliorare la visualizzazione, è possibile preparare e osservare nel tempo emulsioni con diversi rapporti acqua/olio. La perdita di stabilità può essere visualizzata dall'aggregazione di goccioline d'acqua e dalla conseguente separazione dalla fase oleosa. Poiché le goccioline di grandi dimensioni (visibili ad occhio nudo) hanno meno probabilità di essere convertite in GUV, si consiglia di utilizzare la condizione di emulsione che fornisce la minima separazione di fase.

L'effetto delle variazioni nel protocollo può essere verificato attraverso un'analisi della distribuzione dimensionale come descritto nella sezione 4 del protocollo: i diametri dei GUV possono essere misurati utilizzando ImageJ da immagini al microscopio a contrasto di fase e la distribuzione dimensionale può essere analizzata con uno script disponibile su GitHub16. Seguendo questo protocollo, è stato possibile, ad esempio, osservare un aumento dei GUV con diametri maggiori quando si sceglie l'olio minerale rispetto all'olio siliconico AR20 (Figura 8).

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Figura 2: Configurazione della camera del guanti. Questa figura mostra le principali modifiche alla camera a guanti per la preparazione della soluzione lipidica. (A) Collegamento di ingresso con azoto e vuoto; (B) raccordo di ingresso con la camera del guanti; (C) valvola di uscita; (D) cappuccio porta-aghi per l'evaporazione del solvente; (E) tubi sottili per l'evaporazione del solvente; (F) particelle di silice per assorbire l'umidità; (G) articoli da inserire nella camera del guanti: termoigrometro digitale (1), soluzione lipidica in solvente organico (2), supporto per anello di sughero (3), siringa di vetro (4), tappo aperto con setto e aghi (5), soluzione oleosa (6), flaconcino scuro aperto con tappo (7), puntali da 10 mL (8), pipetta P10000 (9); (H) estremità del tubo di scarico immersa nell'acqua; (I) flaconcino chiuso con tappo porta-aghi collegato all'ingresso e all'uscita; (J) schemi della camera del vano portaoggetti modificata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Contenitore per una facile rimozione dell'olio. Fasi principali della preparazione dei GUV in un contenitore per una facile rimozione dell'olio come da protocollo sezione 2.1. (A) Viene praticato un foro in un tappo della provetta da 5 ml per consentire l'inserimento di un puntale P1000; quindi (B) il tappo viene posizionato su una provetta vuota da 5 mL con la punta inserita nel foro attraverso un O-ring. (C) Le soluzioni vengono inserite nella provetta secondo le sezioni 2.2 e 2.3 del protocollo, la punta viene tappata e la provetta viene inserita all'interno di una provetta da 50 mL. I GUV preparati da 0,2 mM di DOPC in olio di silicone sono stati caricati con 230,7 mM di saccarosio e 3,1 mM di FCF blu brillante per migliorare la visualizzazione. (D) Dopo la centrifugazione, la fase oleosa superiore viene intrappolata all'interno della punta insieme a una parte del tampone GUV (che appare ciano a causa della mancata conversione di parte delle goccioline in GUV e del rilascio del colorante nell'OS). Grazie al tappo in gomma, il puntale può essere facilmente rimosso dalla provetta da 5 mL insieme al contenuto liquido, consentendo così una rapida e facile rimozione di tutta la fase oleosa. (E) Il pellet GUV può essere facilmente raccolto dal fondo di una provetta in una dispersione chiara, senza apparente contaminazione da olio, come verificato (F) mediante microscopia a contrasto di fase. Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; IS = soluzione interna; OS = soluzione esterna; GUV = vescicola unilamellare gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Formazione di GUV. Esempi di (A) interfaccia OS/LS, (B) un pellet GUV pulito con una fase oleosa limpida e (C) un pellet GUV con detriti all'interfaccia OS/LS (i detriti e il pellet appaiono rossastri perché l'IS di questa popolazione GUV è stato integrato con 1,65 mM di colorante New Coccine per migliorare la visualizzazione). Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; IS = soluzione interna; OS = soluzione esterna; GUV = vescicola unilamellare gigante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Stabilità dell'emulsione con diversi rapporti olio e acqua-in-olio. La figura mostra la stabilità delle emulsioni nel tempo, a seconda del tipo di olio e del rapporto acqua/olio (s/p) utilizzato. L'IS era composto da 230,7 mM di saccarosio e 3,1 mM di FCF blu brillante per migliorare la visualizzazione delle emulsioni. Le emulsioni preparate con olio minerale sono meno stabili delle loro controparti realizzate con olio siliconico AR20. Questo effetto è ulteriormente amplificato con l'aumentare dei rapporti w/o. Sebbene le emulsioni nell'olio siliconico AR20 siano significativamente più stabili, la loro stabilità diminuisce anche all'aumentare del rapporto w/o, con separazione di fase visibile immediatamente dopo l'emulsione (olio siliconico AR20 al 10%). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Osservazione dei GUV con un microscopio a contrasto di fase. Un ingrandimento 20x di GUV caricati con saccarosio preparato da un LS composto da 3,18 mM di DOPC in olio minerale. (A) campione recuperato dopo la rimozione dell'olio; (B) campione recuperato dopo le fasi di lavaggio; (C) scarsa resa GUV ottenuta da un LS preparato in ambienti con ossigeno e umidità non regolati; (D) GUV caricati con microparticelle. Barra di scala = 10 μm; Le gocce di olio sono cerchiate e gli esempi di aggregati disordinati di fosfolipidi e molecole di olio sono indicati da una freccia. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; GUVs = vescicole unilamellari giganti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Effetto di diverse condizioni di centrifugazione sulla formazione di GUV. Immagini a contrasto di fase di GUV caricati con saccarosio preparati con un LS composto da 0,2 mM di DOPC in olio di silicone AR20. La figura mostra un confronto qualitativo dei GUV a (A) 16.600 × g per 5 minuti, (B) 3.300 × g per 20 minuti e (C) 500 × g per 45 minuti. Mentre l'elevata velocità di centrifugazione si traduce in una maggiore presenza di aggregati fosfolipidi, una bassa velocità di centrifugazione porta a una resa ridotta. Barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: LS = soluzione lipidica; GUV = vescicola unilamellare gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Analisi della distribuzione dimensionale. Confronto di due campioni di GUV caricati con saccarosio ottenuti da (A) 0,2 mM di DOPC in olio minerale e (B) 0,2 mM di DOPC in olio di silicone AR20 (*il campione è stato diluito 10 volte per consentire una chiara distinzione dei GUV al microscopio a contrasto di fase). L'analisi effettuata seguendo la sezione 4 del protocollo mostra una distribuzione dimensionale spostata verso diametri più elevati per il campione di olio minerale rispetto ai campioni di olio siliconico AR20. Tuttavia, la resa del campione di silicone è quasi 20 volte superiore. Abbreviazioni: GUV = vescicola unilamellare gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

PassoCondizione ECondizione PDescrizione
1.1.14,11 grammi17,11 gMassa di saccarosio
1.1.12,16 g2,16 gMassa di glucosio
1.1.2240 mM1000 mMConcentrazione di saccarosio
1.1.2240 mM240 mMConcentrazione di glucosio
1.3.2Olio siliconicoOlio mineraleFase oleosa per LS
1.3.2Siringa di vetro da 0,1 mLSiringa di vetro da 0,5 mLSiringa in vetro per il trasferimento di DOPC in soluzioni di cloroformio
1.3.1063 μl500 μlVolume di DOPC in soluzione di cloroformio
1.3.1610 ml5 mlVolume dell'olio
2.4.13300 g 20 minuti500 g 45 minutiCondizione di centrifugazione

Tabella 1: Variazioni nel protocollo. La tabella riporta le variazioni per i vari passaggi del protocollo (indicati nella prima colonna) per preparare due diverse popolazioni di GUV: GUV caricati con saccarosio (condizione E) e GUV caricati con microparticelle (condizione P).

IDPassaggi coinvoltiDiametro interno (mm)Diametro esterno (mm)Lunghezza (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tabella 2: Tubi per i collegamenti del gas e del vuoto nella camera del guanti. La tabella riporta le dimensioni dei tubi in silicone utilizzati per collegare la camera del vano portaoggetti alle linee di azoto e vuoto. Gli ID di riferimento vengono forniti per facilitare il processo di assemblaggio.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I metodi per la produzione di GUV possono essere suddivisi in due gruppi principali: i metodi basati sul rigonfiamento dai substrati attraverso l'idratazione e quelli basati sull'assemblaggio da interfacce fluide. I metodi del primo gruppo sono molto efficienti nel fornire ampie popolazioni di GUV per la caratterizzazione biofisica delle membrane lipidiche o delle proteine transmembrana. Al contrario, metodi come il trasferimento di goccioline sono scelti principalmente per l'incapsulamento del carico a causa del ridotto consumo di carichi e della maggiore efficienza di incapsulamento18.

Per questo motivo, una pletora di carichi diversi è stata incapsulata nei GUV, rendendo il trasferimento delle goccioline un processo di riferimento per le cellule artificiali 3,8,9,10 e una possibile soluzione per la costruzione di nuovi microrobot biomimetici 11,12. Per modulare le proprietà fisico-chimiche delle membrane GUV, possono essere incluse diverse molecole, come i fosfolipidi ionici10, gli acidi grassi19, i polimeri come il PEG20 o il colesterolo21 (sebbene le molecole idrofobiche come il colesterolo abbiano un'elevata affinità per l'olio, con conseguente minore controllo della composizione della membrana rispetto ai metodi di rigonfiamento22). Il protocollo è abbastanza versatile da consentire queste modifiche, ma alcuni passaggi hanno un impatto maggiore di altri.

Per discutere le criticità del metodo, abbiamo descritto qui un protocollo per la preparazione di due diverse popolazioni di GUV: una preparazione di GUVs contenente una soluzione di saccarosio e una preparazione di GUVs che incapsulano microparticelle. Le differenze nel protocollo sono descritte in dettaglio nella Tabella 1 come condizione E (vuoto) e condizione P (con particelle). Questo metodo consente la formazione di GUVs trasferendo goccioline d'acqua da una fase oleosa a una fase acquosa in un processo bistabile guidato dai fosfolipidi23 e influenzato dalle proprietà fisico-chimiche di tutte e tre le fasi coinvolte: IS, OS e LS.

Tra i tre, LS è il più sensibile a causa della suscettibilità dei fosfolipidi alla luce, all'ossidazione e all'idrolisi 24,25,26. Per questo motivo, la fase iniziale di evaporazione del solvente organico utilizzato per la conservazione a lungo termine dei fosfolipidi a -20°C (tipicamente cloroformio o metanolo) deve essere eseguita in fiale di ambra in flusso di azoto o argon. Se non sono garantiti bassi livelli di umidità nell'ambiente di laboratorio, i fosfolipidi potrebbero essere danneggiati13, 14, 27. Pertanto, LS deve essere preparato in un ambiente confinato come una scatola a guanti o la camera a guanti modificata economica descritta in questo protocollo. Una volta che l'olio è stato aggiunto al film lipidico, l'LS può essere rimosso dalla camera del guanto e la completa dissoluzione dei fosfolipidi viene effettuata mediante vortice e riscaldamento della soluzione.

Sebbene alcuni protocolli includano la sonicazione in questa fase13, aumenti localizzati della temperatura possono portare a danni ancora non descritti per alcune formulazioni LS. Per questo motivo, il riscaldamento della soluzione a bagnomaria può fornire un processo meglio controllato e omogeneo. Per ridurre ulteriormente le possibilità di danneggiare il LS, questo protocollo suggerisce l'uso di due diverse temperature: poiché la dissoluzione di un LS appena preparato richiede un'energia maggiore rispetto a un LS precedentemente disciolto (a causa di un imballaggio più denso di molecole di fosfolipidi nel film steso sulla superficie del flacone di vetro), si adottano 80 °C per la prima dissoluzione del film lipidico e 50 °C per risciogliere semplicemente i fosfolipidi subito prima del loro utilizzo. Poiché un aumento della variabilità delle prestazioni nel tempo è generalmente osservato per 3,18 mM di DOPC in olio minerale (Figura 4C), l'uso di LS entro una settimana è una pratica generalmente raccomandata. Tuttavia, alcune combinazioni di olio e fosfolipidi possono avere una durata prolungata e l'uso di una camera a guanti sembra anche migliorare la stabilità della LS nel tempo.

La personalizzazione delle membrane GUV con combinazioni specifiche di fosfolipidi può richiedere implementazioni su misura del protocollo. Per navigare tra tutte le possibili variazioni, è possibile ottenere indicazioni dalle proprietà fisico-chimiche del LS. Le concentrazioni micellari critiche (CMC) e la diffusività dei fosfolipidi nella LS sono influenzate dalle interazioni chimiche con le molecole nella soluzione28. La formazione di goccioline d'acqua nell'emulsione IS/LS è quindi influenzata dalla velocità con cui i fosfolipidi possono diffondersi nella fase oleosa e raggiungere le interfacce acqua/olio per formare un monostrato stabile (il lembo interno della membrana). Sono state osservate differenze di diffusività per i due oli sfruttati in questo protocollo, con l'olio siliconico AR20 che fornisce una maggiore stabilità dell'emulsione IS/LS (Figura 6). Poiché l'emulsione più stabile per entrambi gli oli è stata osservata quando l'acqua è stata dispersa con un rapporto del 2,5% (coerentemente con le precedenti osservazioni nell'olio minerale13), abbiamo fissato questo come un rapporto generalmente valido.

Tuttavia, poiché rapporti più elevati potrebbero fornire caratteristiche utili (ad esempio, il POPC nell'olio minerale ha mostrato uno spostamento verso GUV più grandi13), si consiglia di eseguire un test qualitativo preliminare come quello riportato nella Figura 6 per avere informazioni sulla stabilità dell'emulsione e, quindi, sull'efficienza attesa dell'incapsulamento. In questo caso, consigliamo ai lettori di non affidarsi a tempistiche precise o iterazioni di procedure per la formazione dell'emulsione perché l'efficacia dipende strettamente dall'operatore o dallo strumento adottato. Forniamo invece un punto di controllo per aiutare l'operatore a capire quando la qualità dell'emulsione è abbastanza buona da massimizzare - almeno teoricamente - le possibilità di convertire le goccioline in GUV. La diffusività dei fosfolipidi nell'olio influenza anche la loro capacità di riarrangiarsi durante il trasferimento delle goccioline e formare il foglietto esterno della membrana GUV 2,7,18,29. Questo passaggio è favorito da un corretto bilanciamento dell'interfaccia LS/OS. Sebbene il tempo di incubazione adottato da questo protocollo sia in linea con le raccomandazioni generali18, con le misurazioni della tensione interfacciale dei precedenti rapporti7 e dei nostri esperimenti preliminari, i GUV preparati con LS diversi possono beneficiare di un tempo di incubazione più lungo.

La formazione del lembo esterno è influenzata anche dalla velocità delle goccioline d'acqua che attraversano l'interfaccia LS/OS, un passaggio collegato alla densità e alla viscosità delle tre fasi30. Le differenze di densità devono sempre seguire l'ordine: IS > OS > LS. Questo è essenziale per consentire prima la sedimentazione delle goccioline di IS verso l'interfaccia LS/OS, quindi l'attraversamento dell'interfaccia per la conversione in GUV e la loro sedimentazione verso il fondo del tubo. Sebbene il processo possa avvenire spontaneamente anche quando l'acqua deionizzata viene utilizzata sia come IS che come OS23, è stata introdotta una differenza di densità tra IS e OS per favorire la formazione di GUV31. La coppia più comune a questo scopo è il saccarosio nell'IS e il glucosio nell'OS: alle concentrazioni equiosmolari necessarie per prevenire danni ai GUV in formazione dovuti allo stress osmotico, il saccarosio fornisce una soluzione più densa del glucosio. Poiché la differenza di densità aumenta con l'osmolarità di queste soluzioni, la resa dei GUV varia di conseguenza, senza ulteriori miglioramenti osservati oltre i 600 mOsm13.

Le condizioni ottimali di centrifugazione sono strettamente legate alla densità e alla viscosità delle tre fasi e alla diffusività dei fosfolipidi. In assenza di una caratterizzazione completa delle tre fasi, devono essere vagliate più condizioni. Dalle prove qualitative (Figura 4E e Figura 5) e dall'analisi sistematica preliminare17, è stato possibile definire buone condizioni di centrifugazione per i due campioni descritti in questo protocollo; Tuttavia, la qualità dei campioni è suscettibile di miglioramenti se vengono esaminate più condizioni. Quando l'equilibrio tra la diffusività dei fosfolipidi nel LS e la densità e la viscosità delle tre fasi non viene mantenuto correttamente, i fosfolipidi non hanno il tempo sufficiente per equilibrarsi all'interfaccia LS/OS e per riorganizzarsi correttamente quando le goccioline d'acqua si muovono verso l'OS. Questo spesso porta alla formazione di un precipitato biancastro in corrispondenza o appena sotto l'interfaccia, probabilmente costituito da fosfolipidi e altre molecole in fase oleosa trascinate da goccioline che non riescono ad assemblarsi in GUV durante la centrifugazione.

L'incapsulamento di una soluzione omogenea può essere guidato aumentando la densità dell'IS mantenendo un equilibrio osmotico con l'OS (come per la coppia saccarosio-glucosio), ma l'incapsulamento di una dispersione di microparticelle richiede che la densità della fase acquosa corrisponda a quella delle microparticelle32. L'efficienza dell'incapsulamento del carico è influenzata anche dalla composizione chimica della soluzione/dispersione del carico. Rapporti precedenti hanno mostrato un effetto negativo sulla resa GUV causato da molti alogenuri di metalli alcalini33 o variazioni di pH13, molto probabilmente a causa di interazioni o spostamenti nella carica netta dei carichi idrofili zwitterionici dei fosfolipidi. Pertanto, l'incapsulamento di reazioni biologiche (come la sintesi proteica enzimatica o priva di cellule) richiede spesso un compromesso, poiché il pH e le concentrazioni di sale (come KCl o NaCl) devono essere regolati a livelli non ottimali per la reazione stessa. Tuttavia, anche miscele di reazioni complesse come la sintesi proteica priva di cellule possono essere modificate perfornire cellule artificiali funzionali basate su GUV.

Da un punto di vista pratico, sebbene il metodo di trasferimento delle gocce offra un processo molto semplice, il recupero dei GUV dal sistema operativo può porre alcune limitazioni. Per facilitare la rimozione dell'olio dalla fase superiore dopo la fase di centrifugazione, è possibile utilizzare due puntali per pipette per una rimozione più fine (fase del protocollo 3.1.1) o un pallone di Buchner per una rimozione più rapida quando vengono preparati più campioni (fase del protocollo 3.1.2). Tuttavia, poiché l'olio non viene completamente rimosso, è necessario eseguire una fase di lavaggio per ottenere una dispersione GUV pulita (fase del protocollo 3.2). Sebbene le fasi di lavaggio abbiano portato all'efficace rimozione delle goccioline residue di olio senza perdite apprezzabili di GUV (Figura 4A, B), questo passaggio può essere meno semplice con olio altamente viscoso e può richiedere molto tempo quando si preparano più formulazioni di GUV. È stato descritto un metodo alternativo per bypassare la rimozione dell'olio e recuperare il GUV dal fondo del tubo attraverso un foro praticato con l'aiuto di un ago35. Questo processo, tuttavia, potrebbe non consentire un recupero completo del pellet GUV se il tubo non viene forato nella posizione corretta e, inoltre, è potenzialmente dannoso per l'operatore.

Per aiutare il recupero dei GUV, introduciamo qui un nuovo e semplice approccio per rimuovere rapidamente la fase oleosa. Questo si basa sull'intrappolamento della fase oleosa superiore, meno densa, in un puntale per pipette tappato in modo che, dopo la centrifugazione, il puntale possa essere rimosso in modo tale che non goccioli fluido. Questa semplice strategia consente una rimozione rapida e semplice dell'intera fase dell'olio in una sola volta, semplificando costantemente questa fase che richiede tempo.

Per valutare l'efficienza del protocollo, sono stati implementati alcuni metodi per il rilevamento automatico dei GUV per velocizzare il conteggio e l'analisi della distribuzione dimensionale. La marcatura dei GUV con sonde fluorescenti fornisce una strategia semplice ed efficace applicata sia alla citometria a flusso 36,37 che all'imaging al microscopio combinato con algoritmi di rilevamento circolare 13,37,38,39. Più recentemente, si stanno esplorando strumenti basati sull'intelligenza artificiale per il rilevamento degli oggetti per migliorare questo processo40,41. Tuttavia, i coloranti fluorescenti possono potenzialmente influenzare le proprietà GUV, introducendo così artefatti nell'analisi. Se si esclude il segnale fluorescente rilevabile, la microscopia rimane l'opzione più affidabile, con la microscopia a contrasto di fase che è il metodo preferito per una visualizzazione ottimale18 e l'applicazione di algoritmi di rilevamento del cerchio38.

In alternativa, è possibile sfruttare le proprietà peculiari di formulazioni specifiche per strategie di rivelazione uniche. Hadorn et al., ad esempio, hanno sfruttato la presenza di elettroliti nell'IS per rilevare i GUV con un contatore cellulare basato sull'impedenza33. Quando nessuno di questi metodi automatizzati o specifici per la formulazione è fattibile, l'annotazione manuale del cerchio rimane un ripiego universalmente applicabile. In questi casi, ImageJ offre uno strumento pratico per velocizzare il processo ed estrarre facilmente le misure del diametro grezzo come descritto in questo protocollo.

Nonostante l'ampia adozione del metodo di trasferimento delle goccioline, poca attenzione è dedicata ai processi di ottimizzazione necessari per le nuove formulazioni GUV. In questo lavoro, abbiamo raccolto le informazioni disponibili dalla letteratura per implementare un protocollo sistematico per guidare e semplificare questa ottimizzazione. Questa guida pratica prende in esame i principi di base coinvolti nella produzione di nuove formulazioni di GUV e nel recupero di un campione minimamente contaminato da olio, un aspetto spesso trascurato del protocollo13,14. Sebbene non sia possibile prevedere l'ottimizzazione richiesta da qualsiasi formulazione di GUV, questa guida fornisce suggerimenti e approfondimenti utili per accelerare l'implementazione di nuovi GUV, portando potenzialmente ad applicazioni tra cui celle artificiali e microrobot.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questi risultati fanno parte del progetto CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots) che ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (accordo di sovvenzione n. 948590). Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Commissione europea attraverso il progetto BRIEF NextGenerationEU. Ringraziamo Michele Ibrahimi per il supporto tecnico nell'allestimento della camera portaoggetti e per l'utile discussione sull'implementazione del contenitore per la facile rimozione dell'olio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m membrana mista esteri di cellulosa  filtri per siringheMerckSLGSVR255F
Provette da 1,5 mLBioclasse06.0279.00
100 μ L. siringa di vetroMerck20737
Becher da 150 mLAvantor213-1123Almeno 3
Fiale di vetro scuro da 20 mL ND24Avantor548-9001A
Provette da 2 mLBioclasse07.3534.99
Bombola da 50 mLAvantor612-3843
500 μ L. siringa di vetroHamilton549-1166
Provetta Falcon da 50 mLMerckCLS352070
Siringa da 50 ml Fisher Scientifico8SS50L1
Provette da 5 mLGreiner bio-one622201
Bicchiere da 600 mLAvantor213-1126
Bü Pallone ChnerMerckZ740682
Anelli in sughero per fiaschi a fondo tondoAvantor217-1000
CristallizzatoreDutscherCodice 080474A
D-(+)-glucosioSigma-AldrichG8270
D-(+)-SaccarosioSigma-AldrichS9378
Termoigrometro digitaleBohlenderV1863-07
DOPCAvanti ResearchCodice 850375C
TrapanoDremel4000
Sale disodico erioglaucina (Blu brillante FCF)Sigma-Aldrich861146
Ago per siringa G18TerumoAN1838R1
Ago per siringa G21TerumoAN2138R1
Camera portaoggettiBel-ArtF50030-0000Se disponibile, è possibile utilizzare una scatola a guanti, ma nei laboratori con bassi livelli di umidità potrebbe non essere necessaria
Agitatore magnetico a piastra riscaldanteArticoli da laboratorio LLG6.263 448
Olio minerale leggeroSigma-Aldrich330779
Nuove coccineSigma-Aldrich199737
O-ring in gomma nitrile, O-ring, foro da 8 mm, diametro esterno 12 mmRS196-4863
Tappi a vite aperti con setto ND24Avantor548-0031A
Micropipetta P1000Fisher Scientifico12346132
Micropipetta P10000Avantor89079-978
Micropipetta P200Fisher Scientifico12326132
Asciugamani di cartaAvantorKIMB6657
ParafilmAvantor291-1214
Puntali per pipette (1000)Eppendorf0030000919
Puntali per pipette (10000)Eppendorf0030000765
Puntali per pipette (200)Eppendorf0030000870
Particelle di polistirene, 1,1 & micro; mSigma-AldrichLB11-1ML
Tappo in gommaBioclass S.r.l.12.2300.05
Guarnizione conica in gommaAvantor217-0211
Tappi a vite  ND24Avantor548-0161A
Olio siliconico AR20Sigma-Aldrich10836
Tubo in silicone (diametro interno 1,6 mm, diametro esterno 3 mm)RS667-8441
Tubo in silicone (diametro interno 6 mm, diametro esterno 12 mm)RS273-2541Almeno 6 m
Giunzione a tre vieRS795-405
Giunzione a due vieRS419-7287
Valvola a due vieClaber91280
Acqua ultrapuraThermo Fisher Scientific 22934Quando disponibile, questo prodotto può essere sostituito con acqua purificata attraverso i sistemi Milli-Q
Forbici universaliBochem4154

Riferimenti

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