Articolo metodologico

Analisi 3D simultanea del danno cardiaco e della risposta immunitaria nell'infarto miocardico acuto riperfuso mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 settembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricostruzione tridimensionale (3D) del danno cardiaco nell'infarto miocardico acuto riperfuso (repAMI) consente una quantificazione e una co-localizzazione fedeli dei modelli associati che influenzano la malattia. In questo caso, viene fornito un approccio automatizzabile di imaging guidato da foglio luminoso per la misurazione contemporanea del danno cardiaco, dell'area a rischio e della risposta delle cellule immunitarie.

Abstract

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Complesse interazioni cellulari determinano il rimodellamento funzionale e strutturale dei tessuti durante l'infarto miocardico acuto riperfuso (repAMI). Questi processi mostrano una distribuzione spaziale distinta poiché il muscolo cardiaco danneggiato è segmentato in diverse aree (area danneggiata, area a rischio (AAR) e area remota). La visualizzazione tridimensionale (3D) di queste aree è essenziale per l'analisi delle varie interazioni tra le cellule cardiache residenti e le cellule immunitarie infiltranti, consentendo l'identificazione di possibili bersagli di trattamento. Qui viene descritto un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione 3D simultanea e automatizzabile dell'area di danno cardiaco, AAR e delle cellule immunitarie infiltranti (ad esempio, neutrofili) dopo repAMI. Ciò include la colorazione intravitale-mediata da anticorpi dell'area di danno cardiaco (CD31neg) e dell'infiltrazione di neutrofili (Ly6G+) in seguito alla visualizzazione ex vivo di AAR mediante perfusione anticorpale retrograda e ulteriore pulizia dei tessuti non tossici per l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio leggero (LSFM). Questa tecnica consente l'analisi spaziale delle cellule bersaglio, ad esempio le cellule immunitarie infiltranti e le aree danneggiate in un cuore di topo intatto dopo repAMI. L'istologia e l'immunoistochimica tradizionali possono essere eseguite dopo l'eliminazione non tossica dei tessuti e l'acquisizione di immagini con post-elaborazione assistita da computer. Ciò consente di multiplexare l'acquisizione di informazioni all'interno dello stesso cuore di topo, rafforzando la robustezza dei dati ed essendo particolarmente significativo in una lesione altamente complessa come repAMI.

Introduzione

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Il danno tissutale nell'infarto miocardico acuto riperfuso (repAMI) è il principale fattore trainante per il rimodellamento cardiaco e lo sviluppo dell'insufficienza cardiaca1. Molteplici mediatori locali e cellule cardiache residenti, ma anche cellule immunitarie infiltranti, influenzano la sua espansione in un'interazione complessa 2,3. Comprendere l'organizzazione spaziale di questi processi è essenziale per acquisire conoscenze approfondite per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per limitare il danno tissutale dopo repAMI e migliorare la funzione cardiaca.

Poiché il muscolo cardiaco stesso è costituito da diversi tipi di cellule, l'analisi dettagliata del danno cardiaco è impegnativa poiché ogni tipo di cellula mostra la propria capacità di resistenza specifica durante il danno da ischemia e riperfusione 4,5. Un importante segno distintivo nel contesto della repAMI è un'importante perdita di vascolarizzazione accompagnata da un deterioramento della funzione delle cellule endoteliali6. Il marcatore più consolidato utilizzato per la rappresentazione della struttura vascolare e l'analisi della disfunzione endoteliale nei topi e nell'uomo è il CD31 (noto anche come PECAM-1), una molecola di adesione espressa sulla superficie delle cellule endoteliali7. In diversi modelli di ischemia/riperfusione, la perdita di CD31 ha dimostrato di essere un buon marcatore surrogato per la distinzione del danno al tessuto endoteliale 8,9,10. Inoltre, durante la repAMI si distinguono tre principali compartimenti di lesione in tutto il cuore. Il tessuto cardiaco non interessato da lesione da ischemia/riperfusione (I/R) rappresenta l'area remota. Il miocardio a valle di un'occlusione vascolare è definito come un'area a rischio (AAR)11,12. Dopo l'inizio della riperfusione, all'interno dell'AAR può essere differenziata un'area distinta del tessuto cardiaco, che è stato danneggiato dalla precedente ischemia (area di danno)13. La valutazione convenzionale del danno cardiaco I/R nei topi utilizza il triphenil tetrazolium chloride (TTC) in sezioni spesse seriali che mostrano una ridotta attività metabolica delle cellule cardiache danneggiate13,14. Contemporaneamente, è possibile aggiungere la colorazione blu di Evan ex vivo per la determinazione di AAR15. Tuttavia, questi metodi consolidati presentano diverse limitazioni, tra cui la ridotta possibilità di co-valutazione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie, la distinzione delle lesioni specifiche del tipo di cellula e l'accurata ricostruzione 3D dei tessuti.

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) consente di visualizzare interi organi murini puliti intatti con una risoluzione del segnale di fluorescenza fino al livello cellulare. Recentemente, è stato introdotto un metodo migliorato e non tossico per la pulizia dei tessuti utilizzando l'etilcinnamato (ECi) per la visualizzazione 3D di cuori di topo intatti8. Per affrontare i limiti della colorazione blu di TTC/Evan, è stata utilizzata la colorazione a fluorescenza CD31 basata su anticorpi intravitali, rivelando il danno endoteliale cardiaco come aree senza colorazione CD31 (CD31neg) durante la repAMI8. La somministrazione aggiuntiva di iniezione aortica retrograda ex vivo con un anticorpo anti-CD31 coniugato con fluoroforo con un altro spettro di fluorescenza come per la colorazione intravitale rappresenta la rappresentazione 3D contemporanea di AAR. Inoltre, questo metodo può essere esteso aggiungendo la colorazione dei neutrofili, consentendo l'analisi della distribuzione cellulare separata per area remota, AAR e volume di lesione endoteliale cardiaca per migliorare la comprensione della funzione dei neutrofili durante repAMI.

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Protocollo

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Tutte le procedure per gli animali da esperimento sono state approvate dall'agenzia governativa locale competente (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) e sono state conformi a tutte le norme etiche pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali. Gli esperimenti sono stati eseguiti con topi maschi C57BL/6J (9-30 settimane di età). Gli animali sono stati alloggiati e utilizzati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) presso la stalla locale per animali con un ciclo di 12 ore/12 ore giorno e notte.

NOTA: Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti sotto induzione intraperitoneale di anestesia utilizzando ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) con mantenimento con isoflurano (1,5 Vol%). Per ridurre la sofferenza degli animali, tutti gli animali hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di 0,1 mg/kg di buprenorfina prima e dopo l'anestesia durante il giorno in combinazione con buprenorfina contenente acqua potabile durante la notte. Il protocollo chirurgico per l'induzione della repAMI è stato precedentemente descritto altrove16,17. Prima di iniziare con l'iniezione intravitale di anticorpi, preparare due piastre di Petri da 6 cm che vengono utilizzate per l'iniezione di anticorpi retrogradi ex vivo nelle fasi successive descritte di seguito. Una capsula di Petri poco profonda con PBS su ghiaccio è necessaria per la rimozione grossolana del tessuto circostante in eccesso dal cuore (si consiglia di utilizzare pezzi di garza tagliati a misura all'interno della capsula per facilitare il successivo processo di manipolazione). Per l'incannulamento aortico è necessario un altro piatto con un ago per cannula in acciaio smussato da 20 G immerso in PBS su ghiaccio con un nodo sciolto di sutura 5-0 sopra la tacca della cannula. Evitare o rimuovere le bolle d'aria all'interno della cannula, in quanto possono ostruire i vasi coronarici e prevenire la perfusione totale.

1. Iniezione intravitale di anticorpi

  1. Anestetizzare il topo usando ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  2. Iniettare 10 μg ciascuno di anticorpi anti-CD31 di topo marcato direttamente (clone: MEC13.3; fluoroforo: AlexaFluor 790) e anticorpi anti-Ly6G di topo (clone: 1A8; fluoroforo: AlexaFluor 647) in PBS con un volume totale di 5 μL per g di peso corporeo (100 μL per un topo di 20 g) tramite iniezione endovenosa della vena caudale.
    NOTA: Questa iniezione di anticorpi etichetterà tutto l'endotelio all'interno del cuore e ha lo scopo di quantificare le dimensioni della lesione da repAMI.
  3. Lasciare circolare gli anticorpi iniettati per 10 minuti prima di continuare la procedura.

2. Raccolta del cuore

NOTA: Le sezioni 2 e 3 sono critiche in termini di tempo e devono essere completate in meno di 6 minuti.

  1. Sacrificare l'animale mediante lussazione cervicale 10 minuti dopo l'iniezione di anticorpi. Controlla la morte valutando i riflessi.
    NOTA: Se sono necessari campioni di sangue, prelevarli prima di procedere al passaggio successivo.
  2. Metti il mouse sotto uno stereomicroscopio.
  3. Aprire la cavità toracica e incidere la vena cava superiore esposta vicino all'uscita del vaso dalla gabbia toracica al collo.
    NOTA: Mantenere intatta l'aorta in quanto è necessaria per l'iniezione di anticorpi retrogradi ex vivo .
  4. Perfondere i cuori in situ attraverso l'auricola atriale destra e sinistra con PBS contenente eparina (20 IE/mL) utilizzando un ago da 27 G con una pompa a rulli (70 μL/s) per un totale di 3 minuti. Una sufficiente rimozione del sangue cardiaco diventa evidente con lo sbiadimento del prelievo vascolare superficiale del cuore e lo sbiancamento del polmone e del fegato.
    NOTA: Evitare la perfusione cardiaca attraverso il ventricolo destro o sinistro in quanto potrebbe causare artefatti di imaging durante la microscopia a fluorescenza a foglio ottico.
  5. Asportare il cuore e almeno 5 mm di aorta rimanente insieme al tessuto polmonare circostante.
    NOTA: Non tenere direttamente il muscolo cardiaco durante l'escissione per evitare danni ai tessuti e artefatti di imaging durante la microscopia a fluorescenza a foglio ottico.

3. Iniezione di anticorpi retrogradi ex vivo

  1. Trasferire il cuore in una capsula Petri da 6 cm con PBS ghiacciato e garza preparata in precedenza.
  2. Tagliare il restante tessuto polmonare, adiposo e vascolare circostante fino a quando rimane solo il cuore con un'aorta di circa 5 mm.
  3. Trasferire il cuore nel piatto preparato per l'incannulamento aortico.
  4. Tirare l'aorta rimanente sopra la cannula d'acciaio smussata da 20 G e fissarla con la sutura pre-nodo 50 alla tacca della cannula.
    NOTA: La punta della cannula deve essere spinta vicino alla valvola aortica per garantire l'assenza di perdite di liquido di perfusione.
  5. Rilegare l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) in modo permanente con una sutura 6-0 nella posizione esatta utilizzata in precedenza per l'induzione della repAMI.
  6. Iniettare 400 μL di PBS contenente 20 μg di anticorpo di topo anti-CD31 (clone: MEC13.3), marcato con AlexaFluor 546, per via retrograda tramite cannula inserita.
    NOTA: Chiudere la giunzione tra la siringa per iniezione e la cannula inserita con una pellicola sigillante per garantire la completa perfusione degli anticorpi attraverso le arterie coronarie. Questa iniezione di anticorpi colora solo l'endotelio al di fuori dell'AAR e può quindi essere utilizzata per la quantificazione dell'AAR.
  7. Estrarre la cannula inserita dall'aorta.
  8. Trasferire il cuore in una provetta di reazione in polipropilene da 15 mL contenente 10 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare senza agitazione per una notte a 4 °C al buio.

4. Elaborazione e schiaritura dei campioni

  1. Lavare il cuore fissato in tre cambi da 5 mL di PBS per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente (RT) al buio, agitando sempre con una rotazione quasi sopra la testa in provette di reazione in polipropilene da 5 mL.
  2. Disidratare il cuore fissato in serie di etanolo ascendente da 5 mL al 50%, 70% e 100% in acqua deionizzata, ciascuno per almeno 2 ore a RT al buio agitando sempre con una rotazione quasi sopra la testa in provette di reazione in polipropilene da 5 mL.
    NOTA: L'incubazione in etanolo al 50% e al 70% può essere prolungata fino al giorno successivo, mentre l'incubazione in etanolo al 100% può essere prolungata fino a 3 giorni.
  3. Candeggina il cuore disidratato in provette di reazione in polipropilene da 15 mL contenenti 10 mL di etanolo al 100% con il 5% di DMSO e il 5% di H2O2 senza agitazione per 4 ore a 4 °C al buio.
    NOTA: Potrebbe formarsi una pressione all'interno del tubo durante il processo di sbiancamento; Prestare attenzione quando si apre il tubo in seguito.
  4. Lavare il cuore sbiancato in 5 mL di etanolo al 100% tre volte per 12 ore ciascuna a RT al buio, agitando sempre con una rotazione quasi sopra la testa in provette di reazione in polipropilene da 5 mL.
    NOTA: Ogni fase di incubazione può essere prolungata fino a 3 giorni.
  5. Trasferire il cuore in una provetta di reazione in polipropilene da 5 mL contenente 4 mL di etil cinnemato (ECi) per la pulizia dei tessuti e incubare senza agitazione per 3 giorni a RT al buio.
    NOTA: Il cuore schiarito può rimanere in ECi per almeno 3 mesi senza una diminuzione dell'intensità della fluorescenza se conservato correttamente al buio a RT. Non conservare ECi o campioni conservati in ECi a una temperatura inferiore a 6 °C, poiché l'ECi si congela a questa temperatura, danneggiando il campione durante il processo.

5. Preparazione dei blocchi di gomma di gellano

  1. Mescolare 1 g di gomma di gellano in polvere in 100 ml di acqua di rubinetto riscaldata (50-60 °C).
  2. Lasciare mescolare fino a quando non si sarà completamente risolta utilizzando un agitatore magnetico.
    NOTA: Se la polvere non si risolve correttamente, riscaldare la soluzione fino a ebollizione nel microonde.
  3. Filtrare la soluzione di gomma di gellano attraverso un filtro cellulare da 100 μm.
  4. Piastra della soluzione filtrata in una capsula di Petri poco profonda di 10 cm.
  5. Lasciate raffreddare fino a quando il gel non si sarà indurito.
  6. Tagliare il gel in blocchi di 15 mm, 15 mm, 5 mm.
  7. Disidratare i blocchi in 50 mL di serie ascendente di etanolo al 50% e al 70% in acqua deionizzata, ciascuno per almeno 2 ore a RT agitando sempre con una rotazione quasi sopraelevata in una provetta di reazione in polipropilene da 50 mL.
    NOTA: Riempire la provetta di reazione con etanolo dopo aver aggiunto i blocchi di gel. Riempire la provetta di reazione solo fino a metà con blocchi di gel.
  8. Incubare i blocchi disidratati in 50 mL di etanolo al 100% tre volte per 12 ore ciascuno a RT, agitando sempre con rotazione quasi dall'alto in una provetta di reazione in polipropilene da 50 mL.
    NOTA: Riempire la provetta di reazione con etanolo dopo aver aggiunto i blocchi di gel. Riempire la provetta di reazione solo fino a metà con blocchi di gel. I blocchi di gel possono rimanere nell'ultima provetta di reazione con etanolo al 100% per periodi prolungati fino a quando non vengono eliminati in ECi.
  9. Trasferire i blocchi in una provetta di reazione in polipropilene da 50 mL contenente 25 mL di ECi e incubare senza agitazione per 3 giorni a RT.
    NOTA: Mettere solo alcuni blocchi in una provetta di reazione con ECi per evitare di eliminare gli artefatti. I blocchi cancellati possono rimanere in ECi per almeno 6 mesi e conservati presso RT.

6. Imaging

  1. Tagliare i blocchi di gomma di gellano chiariti alla dimensione necessaria per stabilizzare il cuore pulito nel portacampioni del microscopio.
    NOTA: I blocchi di gomma Gellan possono essere riutilizzati più volte.
  2. Rileva i segnali di fluorescenza di interesse (autofluorescenza, colorazione AAR [anticorpo anti-CD31 marcato con AlexaFluor 546], anticorpo anti-Ly6G accoppiato ad AlexaFluor647 e colorazioneCD31 neg [anticorpo anti-CD31 marcato con AlexaFluor 790]) con le impostazioni appropriate del filtro di eccitazione ed emissione. Per l'acquisizione, utilizzare un obiettivo da 0,1 NA con una distanza di lavoro di 17,6 mm.
    NOTA: Rileva i segnali con un laser a luce bianca (200 mW; 480-2400 nm). Per il rilevamento dell'autofluorescenza derivata dal tessuto connettivo, utilizzare un filtro di eccitazione passa-banda 470/30 nm e un filtro di emissione passa-banda 525/50 nm; La colorazione CD31 con un anticorpo accoppiato ad AlexaFluor 546 viene rilevata con un filtro di eccitazione passa-banda 520/40 nm e un filtro di emissione passa-banda 585/40 nm; La colorazione Ly6G con un anticorpo accoppiato ad AlexaFluor 647 viene rilevata con un filtro di eccitazione passa-banda 630/30 nm e un filtro di emissione passa-banda 680/30 nm; La colorazione CD31 con un anticorpo accoppiato ad AlexaFluor 790 viene rilevata con un filtro di eccitazione passa-banda 740/40 nm e un filtro di emissione passa-banda 824/55 nm. I tempi di illuminazione e la percentuale di attenuazione del laser devono essere regolati in base alla qualità del segnale.
  3. Scegliere le seguenti impostazioni per l'imaging al microscopio a foglio leggero:
    1. Scegliere un foglio NA di 0,079, per ottenere uno spessore leggero del foglio di 5 μm.
    2. Scegliere 10 μm come distanza tra due singoli piani z.
      NOTA: Ciò si traduce in un sottocampionamento e conseguente perdita di precisione per la tracciabilità e le misurazioni del volume. Per evitare ciò, una distanza tra due singoli piani z dovrebbe essere uguale alla metà dello spessore del foglio leggero, quindi in questo caso, 2,5 μm. Questo studio ha scelto di sottocampionare i dati, poiché i vantaggi ottenuti dalla riduzione del tempo di imaging e delle dimensioni dello stack di dati superano la minima perdita di precisione dell'analisi.
    3. Utilizzare una larghezza del foglio del 100% per ottenere un'illuminazione omogenea del campione.

7. Post-elaborazione dell'immagine

NOTA: I dati delle immagini digitali acquisite sono stati ulteriormente elaborati utilizzando un software scientifico di elaborazione e analisi delle immagini 3D elencato nella Tabella dei Materiali.

  1. Avvia il software Imaris file converter 10.1 e carica il set di dati grezzo nel software trascinando e rilasciando la cartella con i file immagine nella finestra del convertitore di file Imaris o facendo clic su Sfoglia e navigando fino alla cartella con i file immagine.
  2. Seleziona la cartella di output tramite Seleziona cartella.
  3. Fare clic su Avvia tutto e attendere che i file vengano convertiti in file Imaris .ims.
  4. Avvia il software e seleziona Supera nell'angolo in alto a sinistra.
  5. Aprire le pile di immagini scegliendo Apri e selezionare il file di dati .ims corrispondente.
  6. Per creare una superficie generata automaticamente dell'intero cuore, selezionate Vista 3D e superfici ( 3D View) e superfici (Surfaces).
  7. ScegliereConsidera solo una regione di interesse, Elabora infine l'intera immagine e Statistiche oggetto-oggetto disabilitando Classifica superfici nella sezione Impostazioni algoritmo .
    NOTA: L'abilitazione delle statistiche oggetto-oggetto consente il calcolo della sovrapposizione di diverse superfici e funzioni spot.
  8. Fai clic sul pulsante freccia blu nell'angolo in basso a destra del foglio Crea per continuare con i passaggi successivi.
  9. Determinare la regione tridimensionale di interesse utilizzando i manipolatori che appaiono all'interno della vista immagine.
  10. Procedi con il passaggio successivo scegliendo il canale sorgente (canale di autofluorescenza).
  11. Abilita Smooth e scegli l'impostazione predefinita di 11,8 μm.
  12. Continuare con il passaggio successivo e determinare la soglia necessaria per creare una superficie tridimensionale otticamente soddisfacente che appaia all'interno della vista dell'immagine.
  13. Nell'ultimo passaggio, regolare il filtro di superficie, scegliendo Numero di Voxel come tipo di filtro e determinando 10 come soglia.
  14. Per creare una superficie, fare clic sul pulsante freccia verde nell'angolo inferiore destro della sezione Crea . Utilizzando il foglio Colore , modificare il materiale e il colore della superficie creata in base alle esigenze.
  15. Genera due superfici aggiuntive create manualmente per AAR (volumenegativo CD31 nel canale AlexaFluor 546) e volume di lesione endoteliale cardiaca (volumenegativo CD31 nel canale AlexaFluor 790) scegliendo nuovamente Vista 3D e Superfici .
  16. Scegli Segmenta solo una regione di interesse, Elabora infine l'intera immagine e Statistiche oggetto-oggetto disabilitando Classifica superfici nella sezione Impostazioni algoritmo e fai clic su Salta creazione automatica, modifica manualmente.
  17. All'interno del foglio Scheda , selezionare XY per l'orientamento, Nessuno per la visibilità e regolare manualmente il controller di risoluzione al massimo.
  18. Vai alla scheda del modello , fai clic sull'icona Distanza e imposta la spaziatura dei vertici su 100 μm.
  19. Abilita Disegna e circonda le areeneg CD31 nel canale AlexaFluor 546 o nel canale AlexaFluor 790 ogni 10 sezioni dell'immagine.
  20. Dopo aver completato l'accerchiamento di tutte le aree corrispondenti, selezionate Adattamento automatico (Autofit ) ed Esegui adattamento automatico (Perform Autofit).
  21. Fare clic su Crea superficie e regolare il materiale e il colore delle superfici generate nel foglio Colore .
  22. Per visualizzare i neutrofili come spot Ly6G+, generare una funzione spot scegliendo Vista 3D e Spot.
  23. Seleziona Segmenta solo una regione di interesse, Elabora infine l'intera immagine e Statistiche oggetto-oggetto disabilitando Classifica punti nella sezione Impostazioni algoritmo .
  24. Procedi con i passaggi successivi utilizzando il pulsante freccia blu nell'angolo in basso a destra del foglio Crea .
  25. Determinare la regione tridimensionale di interesse utilizzando i manipolatori che appaiono all'interno della vista dell'immagine, come menzionato in precedenza.
  26. Continuare con il passaggio successivo utilizzando il canale sorgente (canale AlexaFluor 647).
  27. Impostare il diametro XY stimato su 10 μm, abilitare l'allungamento PSF del modello lungo l'asse Z e impostare il diametro Z stimato su 20 μm.
  28. Disabilita la sottrazione dello sfondo.
  29. Procedi con il passaggio successivo, seleziona Intensità min come filtro e imposta una soglia appropriata.
    NOTA: Per stimare il livello di soglia, fare clic su Slice nell'area superiore della finestra del programma e selezionare il canale AlexaFluor 647. Spostare il cursore su diversi punti della porzione di immagine grezza che rappresentano una colorazione Ly6G positiva e leggere il valore di intensità nell'angolo in basso a sinistra della finestra del programma.
  30. Genera spot facendo clic sul pulsante freccia verde nell'angolo in basso a destra del foglio Crea .
  31. Impostare la scala del raggio su 3.0 nella sezione Stile/Qualità punti del foglio Crea .
  32. Arrivato al foglio dei colori per la regolazione del colore spot come desiderato.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'approccio presentato che utilizza la microscopia a fluorescenza a foglio leggero (LSFM) consente l'analisi simultanea di AAR, danno endoteliale e infiltrazione di neutrofili dopo repAMI. La Figura 1A illustra la colorazione intravitale ed ex vivo degli anticorpi dei topi C57BL/6J 24 ore dopo l'induzione di repAMI. Gli anticorpi per la colorazione del danno endoteliale cardiaco (anti-CD31 marcato con AlexaFluor 790) e l'infiltrazione di neutrofili (anti-Ly6G marcato con AlexaFluor ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esistono diverse entità di imaging per rilevare lesioni al tessuto cardiaco durante la repAMI nei topi. Queste tecniche offrono diversi vantaggi, ma hanno anche dei limiti. La colorazione della diminuzione dell'attività metabolica delle cellule cardiache mediante TTC è il metodo più comunemente usato per la quantificazione del danno I/R cardiaco e può essere combinato con la colorazione blu di Evan per la distinzione di AAR 13,14,15.

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia riporta onorari personali e altri da AstraZeneca, che sono al di fuori del lavoro presentato. Simon F. Merz e Lea Bornemann sono attualmente impiegati presso Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck e Tienush Rassaf riportano compensi personali, e altri da Edwards e Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo e Astra Zeneca, che sono al di fuori del lavoro presentato. Tienush Rassaf e Ulrike B. Hendgen-Cotta hanno co-fondato Bimyo, un'azienda focalizzata sullo sviluppo di peptidi cardioprotettivi. Matthias Gunzer ha ricevuto un finanziamento generale per la ricerca da Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: Fondazione tedesca per la ricerca (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) e la Società Tedesca di Cardiologia (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Parte di questo lavoro è stato svolto presso l'Imaging Center Essen (IMCES), una struttura di base della Facoltà di Medicina dell'Università di Duisburg-Essen, in Germania. Ringraziamo lo staff IMCES per il continuo supporto tecnico e l'utilizzo dei loro strumenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ferri da 27 gBecton Dickinson305889BD Eclissi
Elaborazione di immagini 3D e software di analisiPiano bitVers. 10.1.0Imaris
Sutura 5-0Serag-WiessnerIC108000Seta
Sutura 6-0EthiconEH7814Prolene
Kit di marcatura degli anticorpi AlexaFluor 546InvitrogenCodice: A20183
Kit di marcatura degli anticorpi AlexaFluor 790InvitrogenCodice: A20189
Anticorpo Ly6G anti-topo (AlexaFluor 647)Bioleggenda127610Clone: 1A8
Filtro cellulare (100 µ m)Corning431752
Dimetilsolfossido (DMSO)Carl Roth7029.1
EtanoloCarl Roth0911.4
Etilcinnemato (ECi)Sigma-Aldrich112372
Software di conversione filePiano bitVers. 10.1.0Imaris
GarzaFuhrmann10021
Gomma di gellano in polvereSigma-AldrichP8169Phytagel
Eparina (25.000 IE/5 mL)LEO Farmaceutico15261203
Perossido di idrogeno (H2O2, 30%)Carl Roth8070.2
Siringa per iniezioneB BraunCodice 9161502SOmnican F
Ketamina (100 mg/mL)Bela-Pharma402581.00.00
Sistema di microscopio a foglio luminosoMiltenyi Biotec-UltraMicroscopio Blaze
Siringa Luer lockBecton Dickinson303172BD Plastipak
Agitatore magneticoVWR444-0572
Fotocamera Neo sCMOS (4,2 MP)Tecnologia AndorZL41 Cella 4.2
ObiettivoMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 mm
Paraformaldeide (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% formalina, tamponata neutra
PetriGreiner Bio-One632181
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco14190-094Senza MgCl2/CaCl2
Provetta in polipropilene (15 mL)Greiner Bio-One188261
Provetta in polipropilene (5 mL)Carl RothEKY9.1Nero
Provetta in polipropilene (50 mL)Greiner Bio-One227261
Piatto di preparazione per l'incannulamento del cuore del topoHugo Sachs Elektronik73-4327Cannula inclusa
Anticorpo CD31 purificato anti-topoBecton Dickinson53369Clone: MEC13.3
Pompa a rulliIsmatecISM597-230
Pellicola sigillanteBemisPM-996Parafilm
StereomicroscopioLeicaS6D
Rotatore per tubiHeidolphPannello Polymax 1040
Laser a luce biancaFotonica NKTSuperK estremo200 mW, 480– 2400 nm
Ceppo di topo WTLaboratori Janvier-C57BL/6JRj
Xilazina (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Riferimenti

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