Articolo metodologico

Modello murino ottimizzato per indurre il cancro del colon associato alla colite utilizzando azossimetano e destrano solfato di sodio per studi di immunologia e terapia dei tumori

DOI:

10.3791/68351

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25 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

In questo articolo

Sommario

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Il carcinoma del colon associato alla colite indotto da azossimetano (AOM)/destrano solfato di sodio (DSS) è un approccio consolidato ed economico per modellare i tumori autoctoni dell'intestino crasso nei topi. Presentiamo un protocollo aggiornato e discutiamo le considerazioni critiche per l'ottimizzazione della dose di DSS sesso-specifica e il contributo del microbioma per il rigore, la robustezza e la riproducibilità.

Abstract

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L'azossimetano (AOM, un agente che danneggia il DNA) e il destrano solfato di sodio (DSS, un agente che promuove la colite) possono indurre tumori nell'intestino crasso dei topi con alta penetranza. Il modello di carcinoma del colon associato alla colite murina (CAC) indotto da AOM/DSS rappresenta un gold standard nello studio del cancro del colon correlato all'infiammazione, data la sua accuratezza nel ricapitolare le caratteristiche cliniche del CAC umano. I vantaggi del modello includono la sua origine e lo sviluppo da tessuto endogeno, la competenza immunitaria che preserva un repertorio completo di interazioni tumore-sistema immunitario, l'adattabilità a numerosi ceppi di topo, la convenienza di una latenza di 3 mesi e costi relativamente bassi. Nonostante questi vantaggi, diverse sfide limitano l'efficacia del protocollo. La variabilità del dosaggio del DSS e della penetranza tumorale tra gli studi porta a osservazioni incoerenti. Inoltre, le variazioni del microbiota intestinale contribuiscono ad aumentare la variabilità sperimentale, con un impatto negativo sulla potenza statistica. Le differenze di sesso in risposta all'AOM/DSS complicano ulteriormente l'interpretazione dei risultati. Inoltre, la variabilità del DSS da lotto a lotto ostacola la riproducibilità dei risultati. Affrontare queste sfide è fondamentale per migliorare l'affidabilità e l'applicabilità di questo modello nella ricerca preclinica. Per risolvere questo problema, utilizzando i topi C57BL/6J come modello, abbiamo perfezionato il protocollo stabilito con strategie per un'ottimizzazione efficace per migliorare la riproducibilità e l'armonizzazione tra gli studi. Queste includono raccomandazioni per la titolazione della dose di DSS in topi maschi e femmine, l'implementazione dell'omogeneizzazione del microbiota prima di ogni ciclo DSS per mitigare l'eterogeneità della flora intestinale da gabbia a gabbia. Questi passaggi hanno ridotto significativamente la variabilità e migliorato la riproducibilità, con conseguente robusta induzione di CAC. Riconoscendo il ruolo fondamentale dell'infiammazione e dei meccanismi immunitari cellulari nello sviluppo del CAC, il protocollo descrive anche le procedure di processamento tissutale adatte per l'isolamento di RNA o proteine e per la profilazione delle citochine infiammatorie dai tumori del colon e dal tessuto del colon circostante. In definitiva, l'uso di questo metodo garantisce una produzione di CAC più rigorosa, robusta e riproducibile.

Introduzione

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Il cancro del colon-retto (CRC) è il terzo tumore più comune al mondo e una delle principali cause di decessi correlati al cancro 1,2. Rispetto al CRC sporadico, il carcinoma colorettale associato alla colite (CAC) insorge a seguito di danni intestinali prolungati e ripetuti in pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD)3,4, è caratterizzato da un grado maligno più elevato e da una tendenza alla presentazione multifocale in età più giovane. A causa di questi fattori, la CAC richiede generalmente un trattamento più aggressivo con esiti clinici meno favorevoli5. Sebbene il CAC sia considerato un'entità distinta a causa almeno in parte della tempistica unica di acquisizione delle mutazioni e di un ruolo smisurato dei meccanismi immunitari infiammatori e del microbioma, il CAC e il CRC sporadico condividono molte somiglianze per quanto riguarda i paesaggi genomici complessivi e le caratteristiche patogenetiche. Per far progredire la nostra comprensione del CRC in generale e del CAC in particolare, e per migliorare le strategie terapeutiche, sono essenziali solidi modelli preclinici.

Tra i vari modelli utilizzati per lo studio del CRC, il modello CAC indotto da AOM/DSS è il più ampiamente adottato ed è considerato l'attuale gold standard 6,7. Iniziato con un forte insulto mutageno fornito dall'AOM, questo modello si basa su ripetuti attacchi di colite indotti dal DSS che imitano da vicino l'IBD umana, come il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, che sono fattori di rischio ben consolidati per il CAC8. Il modello AOM/DSS offre diversi vantaggi chiave rispetto ad altri approcci in vivo. A differenza dei metodi che si basano sull'iniezione di materiale esogeno per l'inizio del cancro per stabilire tumori del fianco o addirittura ortotopici, il CAC indotto da AOM/DSS è autoctono, il che significa che l'inizio del tumore avviene endogenamente e la progressione del cancro si svolge nel microambiente tissutale nativo, riflettendo più da vicino la sua biologia e la sua storia naturale. A differenza degli xenotrapianti di linee cellulari umane o di materiale derivato da pazienti che possono essere coltivati solo in topi immunocompromessi, è immunocompetente, consentendo lo studio delle interazioni cancro-sistema immunitario. A differenza dei modelli geneticamente modificati che producono tumori con driver genetici specifici, è agnostico rispetto a mutazioni predefinite, consentendo una modellazione più ampia delle vie di segnalazione del cancro e dei meccanismi di educazione immunitaria. Infine, il modello AOM/DSS può essere facilmente adattato a molti ceppi diversi di topi, eliminando la necessità di lunghi schemi di allevamento, rendendolo efficiente in termini di tempo e costi. Tuttavia, fattori come il sesso animale, il dosaggio del DSS e le differenze nel microbiota intestinale possono introdurre variabilità, influenzando la riproducibilità e complicando la sua applicazione nella ricerca traslazionale.

Abbiamo mirato a perfezionare questo protocollo per mitigare l'impatto di questi fattori che sono alla base delle incongruenze nell'entità dell'infiammazione del colon e della tumorigenesi del CAC. Esiste una significativa variabilità nelle concentrazioni di DSS utilizzate per indurre infiammazione acuta, colite o infiammazione cronica e CAC 9,10. Il DSS è un polimero e il peso molecolare medio può variare tra i lotti e i produttori, influenzando la variabilità dei risultati sperimentali. Pertanto, è essenziale testare ogni lotto di DSS per garantire la coerenza tra gli studi. Inoltre, l'entità dell'infiammazione indotta dal DSS è fortemente influenzata dal microbioma intestinale, che può differire in modo significativo tra le strutture di topi in tutto il mondo e persino tra diversi luoghi di detenzione e colonie all'interno della stessa istituzione11,12. Questa variabilità nella composizione microbica può influenzare i risultati del modello e contribuire a risultati incoerenti13. La co-housing di animali dei diversi gruppi sperimentali, quando possibile, è fondamentale per ridurre la variabilità, ma potrebbe non essere sufficiente per affrontare questo fattore confondente, poiché le comunità microbiche subiscono una deriva stocastica nel tempo e portano a effetti in gabbia nei modelli di infiammazione cronica14. Poiché il protocollo AOM/DSS prevede un trattamento a lungo termine per mantenere l'infiammazione cronica, abbiamo implementato l'omogeneizzazione del microbiota mescolando periodicamente le lettiere di tutte le gabbie che ospitano animali trattati con AOM/DSS. Questa pratica aiuta a omogeneizzare l'ambiente del microbiota, con conseguente riduzione della variabilità sperimentale. Inoltre, le osservazioni indicano che gli effetti del DSS possono variare in base al sesso animale15,16, portando potenzialmente a risposte differenziali nell'infiammazione e nello sviluppo del cancro. Abbiamo perfezionato il protocollo esistente titolando separatamente il DSS in topi femmina e maschio per scegliere un dosaggio appropriato di DSS per entrambi i sessi, garantendo risultati più uniformi e fornendo input critici per i calcoli statistici di potenza per determinare le dimensioni ottimali del campione in topi maschi e femmine.

Nel complesso, per migliorare la riproducibilità del modello AOM/DSS, delineiamo una serie standardizzata di linee guida di protocollo che tengono conto e mitigano questi fattori confondenti. Utilizziamo tecniche di omogeneizzazione del microbioma e descriviamo un preciso aggiustamento del dosaggio del DSS per ottenere risultati più coerenti e riproducibili, migliorando così l'utilità del modello AOM/DSS e l'armonizzazione tra diversi studi. Il nostro protocollo si distingue per la riduzione della variabilità rispetto alle gabbie omogeneizzate con microbiota e fornisce istruzioni chiare e dettagliate per l'implementazione di queste pratiche di riproducibilità. Di conseguenza, la minore variabilità all'interno del gruppo effettuata da questi perfezionamenti del protocollo porta a una riduzione delle dimensioni del campione necessarie per raggiungere la potenza statistica desiderata nel rilevare le differenze tra i gruppi sperimentali. Questo protocollo ottimizzato è pensato per i ricercatori che mirano ad adattare il modello AOM/DSS ai propri modelli murini e ai propri disegni sperimentali, indipendentemente dal ceppo o dal background di genere, per studiare i meccanismi di tumorigenesi, i bersagli terapeutici o esplorare le dinamiche delle cellule immunitarie.

Protocollo

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Tutte le procedure per gli animali devono essere eseguite in conformità con un protocollo approvato istituzionalmente per garantire un trattamento umano e il rispetto degli standard etici. Gli studi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Florida.

1. Ottimizzazione del dosaggio DSS

  1. Procurati topi dell'età, del ceppo e della fonte da utilizzare nell'esperimento principale, con un'equa distribuzione di maschi e femmine. Etichetta ogni mouse con un pugno per l'orecchio, un segno di coda o un altro metodo approvato per il tracciamento individuale. Misurare e registrare il peso corporeo iniziale di ogni animale.
    NOTA: I topi maschi devono essere alloggiati insieme prima dello svezzamento e non devono essere ridistribuiti tra le gabbie per ridurre al minimo i combattimenti.
  2. Se si utilizza l'irrigazione automatica, una settimana prima di iniziare un esperimento, passare gli animali alle bottiglie d'acqua e contemporaneamente bloccare gli ugelli della gabbia (tubi metallici nella gabbia) con tappi sterili.
    NOTA: Assicurarsi che eventuali modifiche all'erogazione dell'acqua, come gli ugelli automatici dell'acqua potabile ostruiti, siano approvate dall'IACUC o dall'organismo di regolamentazione appropriato che sovrintende all'uso umano degli animali. Le gabbie per animali possono richiedere controlli giornalieri per garantire l'accesso ininterrotto all'acqua potabile.
  3. Preparare la soluzione DSS sciogliendo DSS in acqua potabile sterile autoclavata a concentrazioni variabili dall'1,5% al 5% (p/v), utilizzando un'ancoretta magnetica e una piastra di agitazione. Attendere 30 minuti a temperatura ambiente affinché la polvere DSS si sciolga completamente in acqua. Preparare l'acqua DSS fresca ogni settimana e conservarla a 4 °C per un massimo di una settimana.
  4. Riempire due provette coniche da 50 ml con acqua DSS ad ogni concentrazione (una per i maschi, una per le femmine) e collegare saldamente un ugello sterile autoclavato per evitare perdite.
  5. Somministrare acqua DSS ad ogni concentrazione a topi femmina e maschio, con 3 topi in ogni gabbia che ricevono la stessa concentrazione. Utilizzare acqua potabile sterile senza DSS come controllo negativo. Sostituire l'acqua DSS a giorni alterni.
  6. Somministrare acqua DSS per 7 giorni. Registra il peso corporeo di ogni mouse ogni giorno.
  7. L'8° giorno, riporta tutti gli animali all'acqua potabile normale.
  8. Il giorno 8, valutare la gravità della diarrea in base alla consistenza delle feci utilizzando un sistema di punteggio standardizzato come descritto17 e registrare i punteggi. Segna "1" come pellet di feci morbide ma ancora formate, "2" come pellet di feci molto morbide e "3" come diarrea.
  9. Il giorno 8, raccogli 2-3 pellet di feci fresche e valuta la presenza di sangue occulto (vedi Tabella dei materiali). Registrare la presenza o l'assenza di sangue nel campione.
  10. Valutare il sanguinamento intestinale in base a una combinazione di due criteri di punteggio, consistenza delle feci (0-3) e presenza di sangue nelle feci (0-3), per un punteggio totale compreso tra 0 e 6.
  11. Dal giorno 9 al giorno 12, registra il peso corporeo di ciascun topo ogni giorno e monitora attentamente gli animali trattati con DSS per una significativa perdita di peso corporeo e diarrea grave. Sopprimere prontamente gli animali che raggiungono o superano gli endpoint umanitari mediante asfissia da anidride carbonica (CO2) o un altro metodo appropriato secondo il protocollo di utilizzo animale approvato e le linee guida etiche stabilite.
  12. Dal giorno 13 al giorno 18, continuare a monitorare gli animali e registrare il peso corporeo di ciascun topo ogni giorno fino a quando non si è completamente ripreso ai livelli pre-esperimento.
  13. Determinare la concentrazione ottimale di DSS, in quanto ciò comporta una perdita di peso corporeo di circa il 20% accompagnata da feci morbide ma ancora formate. La dose ottimale di DSS può variare tra maschi e femmine, ceppi di topi, età, lotti di DSS e strutture per animali.

2. Induzione CAC

  1. Giorno 0-6: Trattamento AOM Giorno 7-28: 1 ° ciclo di trattamento DSS
    1. Preparazione madre AOM: Sciogliere la polvere AOM in soluzione fisiologica sterile per ottenere una concentrazione madre di 10 mg/mL. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 μm, distribuire 1 mL di aliquote in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -80 °C per un massimo di un anno.
      NOTA: L'AOM è un agente cancerogeno volatile e deve essere maneggiato con cautela sotto una cappa di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), seguendo le raccomandazioni di sicurezza del produttore. L'AOM e tutti i materiali contaminati dall'AOM devono essere smaltiti in conformità con i protocolli di smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi dell'istituto. È responsabilità dello sperimentatore ottenere in anticipo le necessarie approvazioni per la salute e la sicurezza ambientale.
    2. Se si utilizza l'irrigazione automatizzata della gabbia, 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento, bloccare l'ugello automatico dell'acqua potabile e passare gli animali alle bottiglie d'acqua per l'acclimatazione come al punto 1.2.
    3. Il giorno 0, pesare e registrare il peso corporeo di ciascun topo per calcolare la quantità totale richiesta di AOM. Quindi calcolare il volume totale di AOM (1 mg/mL di concentrazione di lavoro finale) in base al peso di ciascun animale per ottenere una dose di 10 mg/kg, ad esempio 200 μL per un topo di 20 g.
    4. Scongelare il numero richiesto di nuove aliquote di 10 mg/mL AOM con ghiaccio prima di ogni utilizzo. Diluire ogni aliquota da 1 mL di AOM con 9 mL di soluzione fisiologica sterile per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 mg/mL.
    5. Somministrare AOM ai topi tramite iniezione intraperitoneale. Eseguire questa procedura all'interno di una cabina di biosicurezza indossando DPI appropriati come doppi guanti e una maschera N95 per una protezione ottimale.
      ATTENZIONE: Eliminare la soluzione AOM residua in conformità con i requisiti di smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi.
    6. Il giorno 3, trasferisci gli animali trattati con AOM in gabbie pulite. Indossare DPI adeguati quando si maneggiano gabbie contaminate da AOM e altri materiali per la protezione.
      ATTENZIONE: Smaltire la lettiera della gabbia sporca e gli avanzi di cibo secondo le procedure di smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi approvate dall'istituto.
      NOTA: L'AOM e i suoi metaboliti vengono completamente escreti entro 72 ore dalla somministrazione18, a quel punto la lettiera sporca della gabbia può essere smaltita.
    7. Il giorno 7, eseguire l'omogeneizzazione del microbiota intestinale per ridurre al minimo la variabilità da gabbia a gabbia. Per fare ciò, campiona il 25% della lettiera da ogni gabbia, mescola accuratamente e ridistribuiscila in ogni gabbia.
      NOTA: Astenersi dal cambiare le gabbie durante la settimana di trattamento DSS e per i cinque giorni successivi. Coordinarsi con il servizio di cambio gabbie della struttura, se necessario.
    8. Avviare l'induzione della colite fornendo DSS nell'acqua potabile utilizzando provette coniche da 50 mL dotate di ugelli adatti. Controlla i topi ogni giorno per confermare che gli animali abbiano accesso illimitato all'acqua DSS. Sostituire l'acqua DSS a giorni alterni. Registra il peso corporeo di ogni mouse ogni giorno.
    9. Il giorno 14, sostituisci l'acqua DSS con normali bottiglie di acqua potabile. Continuare a monitorare attentamente gli animali per il dolore e l'angoscia.
    10. Nei giorni 14-19, pesa ogni topo ogni giorno. Sopprimere gli animali che perdono più del 25% del loro peso corporeo o se un animale raggiunge uno degli endpoint umanitari delineati nel protocollo approvato per la cura e l'uso degli animali. Inoltre, monitorare e registrare eventuali casi di sanguinamento rettale.
  2. Giorno 7-28: 1° ciclo di trattamento DSS
    1. Il giorno 7, eseguire l'omogeneizzazione del microbiota intestinale per ridurre al minimo la variabilità da gabbia a gabbia. Per fare ciò, campiona il 25% della lettiera da ogni gabbia, mescola accuratamente e ridistribuiscila in ogni gabbia.
      NOTA: Astenersi dal cambiare le gabbie durante la settimana di trattamento DSS e per i cinque giorni successivi. Coordinarsi con il servizio di cambio gabbie della struttura, se necessario.
    2. Avviare l'induzione della colite fornendo DSS nell'acqua potabile utilizzando provette coniche da 50 mL dotate di ugelli adatti. Controlla i topi ogni giorno per confermare che gli animali abbiano accesso illimitato all'acqua DSS. Sostituire l'acqua DSS a giorni alterni. Registra il peso corporeo di ogni mouse ogni giorno.
    3. Il giorno 14, sostituisci l'acqua DSS con normali bottiglie di acqua potabile. Continuare a monitorare attentamente gli animali per il dolore e l'angoscia.
    4. Nei giorni 14-19, pesa ogni topo ogni giorno. Sopprimere gli animali che perdono più del 25% del loro peso corporeo o se un animale raggiunge uno degli endpoint umanitari delineati nel protocollo approvato per la cura e l'uso degli animali. Inoltre, monitorare e registrare eventuali casi di sanguinamento rettale.
  3. Giorno 29-49: 2 ° ciclo di trattamento DSS
    1. Ripetere l'omogeneizzazione del microbiota insieme alla somministrazione di DSS, seguendo le stesse procedure dei passaggi 2.2.1-2.2.4. Facoltativo: dopo il secondo e/o terzo ciclo DSS, eseguire la colonscopia come descritto in precedenza19.
  4. Giorno 50-70: 3° ciclo di trattamento DSS
    1. Ripetere l'omogeneizzazione del microbiota insieme alla somministrazione di DSS, seguendo le stesse procedure dei passaggi 2.2.1-2.2.4. Poiché i topi tendono a perdere più peso tre giorni dopo il terzo ciclo di DSS, monitorare attentamente tutti gli animali per un'eccessiva perdita di peso corporeo o per eventuali indicazioni di sanguinamento rettale durante questo periodo e fornire cibo umido per la cura di supporto, se indicato.

3. Valutazione della gravità della colite e della patologia macroscopica CAC

  1. Il giorno 70, raccogliere 2-3 pellet fecali freschi da ciascun topo per testare la presenza di sangue occulto e/o marcatori di infiammazione come la lipocalina-220 per valutare la gravità della colite. Utilizzare reagenti/kit appropriati (vedere l'elenco dei materiali e delle attrezzature) e seguire le istruzioni del produttore per eseguire i test, brevemente descritte di seguito.
  2. Per preparare campioni fecali per la valutazione dei livelli del marcatore di infiammazione lipocalina-2, posizionare pellet di feci fresche in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Sciogliere i pellet in 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) utilizzando un miscelatore a vortice fino a ottenere una soluzione uniforme. Centrifugare la soluzione a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Il surnatante può essere utilizzato immediatamente per il ELISA di lipocalina-2 o conservato a -80 °C per un uso successivo.
  3. Eseguire l'ELISA di lipocalina-2 del topo secondo le istruzioni del produttore del kit. Eseguire esperimenti pilota di diluizione seriale per determinare la diluizione ottimale dei campioni fecali rispetto agli standard.
    NOTA: Si prevede che i livelli di lipocalina-2 aumentino di almeno 1000 volte nei topi trattati con DSS rispetto agli animali di controllo trattati con acqua20.
  4. Valutare la gravità della colite utilizzando un sistema di punteggio della diarrea17 come descritto nei passaggi 1.8-1.10.
  5. Il giorno 70, sopprimere gli animali mediante asfissia da CO2 o utilizzando qualsiasi altro metodo umanitario approvato.
  6. Spruzzare la zona addominale di ogni animale con etanolo al 70% per ridurre al minimo la contaminazione durante le fasi successive.
  7. Utilizzare una pinza chirurgica fine per sollevare la pelle e lo strato peritoneale. Fai un'incisione orizzontale con le forbici per esporre la cavità addominale.
  8. Estrarre l'intestino tenue all'esterno e identificare il cieco. Sollevare delicatamente il cieco e il colon usando una pinza. Sezionare con cura il colon tagliando il mesentere e il sistema vascolare associato usando le forbici, evitando di perforare o tagliare il colon.
  9. Tagliare l'osso pelvico e la pelle che circonda l'area rettale-anale per esporre l'intero colon distale. È importante sezionare l'intero colon con la parte distale intatta, poiché la maggior parte dei tumori si verifica tipicamente in questa regione.
  10. Posizionare il colon sezionato su una striscia pulita di carta da filtro, raddrizzandolo delicatamente.
  11. Misura la lunghezza dei due punti con un righello e documentala con una fotografia. Includi il righello nella fotografia per la scala.
  12. Pulisci le chiazze di Peyer all'esterno del colon, facendo attenzione a non perforare il tessuto.
  13. Sciacquare il colon in PBS sterile freddo.
  14. Fissare un puntale per micropipetta da 200 μl (senza filtro) su una siringa da 3 ml utilizzando una pellicola di paraffina. Utilizzare questa configurazione per riempire la siringa con PBS sterile, inserire la punta della pipetta nel lume del colon e sciacquare delicatamente il contenuto del colon 2-3 volte, assicurando la completa rimozione dei pellet di feci.
  15. Stendere delicatamente il colon su una striscia di carta da filtro pulita e pre-bagnata. Tagliare il colon longitudinalmente e stenderlo sulla carta da filtro.
  16. Identificare i tumori più grandi, che in genere si presentano come bolle prominenti che sporgono dalla parete del colon con un aspetto infiammato e rosso.
  17. Per i tumori più piccoli, prestare particolare attenzione durante l'identificazione. Utilizza un anello di semina batterica sterile per sondare delicatamente la superficie del colon alla ricerca di eventuali irregolarità o protuberanze. Verificare che le protuberanze rilevate non siano residui di linfonodi o vasi sanguigni situati all'esterno della parete del colon.
  18. Usa i calibri digitali per misurare la larghezza e la lunghezza di ogni tumore.
  19. Registra il conteggio dei tumori e le dimensioni e la posizione di ciascun tumore su una mappa del colon prestampata.

4. Valutazione istologica

  1. Usa due paia di pinze a punta fine per afferrare entrambe le estremità laterali del colon distale. Arrotolare il colon dall'estremità distale all'estremità prossimale in una forma a rullo svizzero come descritto altrove21. Assicurarsi che l'estremità distale sia al centro del rotolo e che l'estremità prossimale formi lo strato più esterno.
  2. Fissare ogni colon arrotolato con un ago da 271/2 G.
  3. Posizionare ogni colon arrotolato in Svizzera in una cassetta di fazzoletti adeguatamente etichettata.
  4. Immergere le cassette di tessuto contenenti colon arrotolati in svizzera in paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS sterile. Lasciare che i tessuti rimangano nel fissativo per 24 ore.
  5. Dopo 24 ore, trasferire i tessuti in etanolo al 70%. I tessuti possono essere conservati in etanolo al 70% a 4 °C per un massimo di tre mesi.
  6. Lo Swiss-roll può essere utilizzato per molteplici esami istopatologici, tra cui la colorazione convenzionale con ematossilina ed eosina (H&E), l'immunoistochimica e l'immunofluorescenza.

5. Prelievo di tessuti per l'isolamento di proteine e RNA dai tumori e dal colon circostante

  1. Lavorare sul ghiaccio e utilizzare tubi e reagenti pre-raffreddati per preservare l'integrità del materiale biologico.
  2. Dopo la valutazione del tumore, sezionare i tumori e raccoglierli in provette pre-raffreddate e pre-marcate con tampone appropriato (vedi sotto) su ghiaccio. A seconda del disegno sperimentale, raggruppare tutti i tumori dello stesso animale o elaborarli individualmente. Se lo si desidera, allo stesso modo, raccogliere pezzi di ~ 1 cm di tessuto del colon non tumorale circostante.
  3. Isolamento delle proteine
    1. Aggiungere 0,5 mL di perle di vetro da 800 μm e 400 μL di tampone di lisi (1% NP-40 in 150 mM di NaCl con 20 mM di Tris-HCl (pH 7,5) e 1% di proteasi e inibitori della fosfatasi in ciascuna provetta per omogeneizzazione tissutale e trasferire il colon/tessuto tumorale in ciascuna provetta.
    2. Omogeneizzare il tessuto del colon/tumore utilizzando un omogeneizzatore tissutale a base di perline a 6 M/S per 30 s, ripetere due volte per un'omogeneizzazione completa.
      NOTA: Posizionare le provette sul ghiaccio tra un ciclo e l'altro per evitare il surriscaldamento del campione dovuto all'omogeneizzazione meccanica.
    3. Dopo l'omogeneizzazione, aspirare 150 μl di lisato (surnatante) e trasferirli in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL.
    4. Centrifugare il lisato a 10.000 g a 4 °C per pellettare qualsiasi materiale insolubile. Se lo si desidera, trasferire il surnatante in una provetta pulita.
    5. Quantificare la concentrazione proteica totale mediante il dosaggio dell'acido bicinchoninico (BCA) o altro metodo appropriato.
    6. Se lo si desidera, regolare la concentrazione proteica totale a 4 mg/mL per ciascun campione con lo stesso tampone di lisi.
    7. Utilizzare immediatamente i lisati proteici per i saggi a valle, come l'immunoblotting o l'analisi delle citochine, oppure conservarli a -80 °C per un uso successivo.
  4. Purificazione dell'RNA:
    1. Dopo la dissezione, posizionare il colon/i tumori in provette da microcentrifuga da 1,5 ml e immergerli in 200 μl di reagente di conservazione dell'RNA appropriato.
      NOTA: Punto di pausa: il tessuto fresco del colon/tumore può essere congelato in azoto liquido e conservato a -80°C per una successiva lavorazione
    2. Scongelare il tessuto del colon/tumore sul ghiaccio.
    3. Trasferire il colon/tumore in una provetta per omogeneizzazione tissutale contenente 500 μl di tampone di lisi appropriato adatto all'isolamento dell'RNA e 200 μl di perle di vetro per macinazione.
    4. Omogeneizzare utilizzando un omogeneizzatore tissutale a base di microsfere a 6 M/S per 30 s tre volte, con una pausa di due minuti tra ogni ciclo.
      NOTA: Trasferire la provetta sul ghiaccio tra un ciclo e l'altro per evitare il surriscaldamento della degradazione dell'RNA durante l'omogeneizzazione meccanica.
    5. Trasferire 300 μl di lisato in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
    6. Isolare l'RNA totale utilizzando la procedura di purificazione dell'RNA appropriata, se necessario. Misurare la concentrazione, la purezza e la qualità/integrità dell'RNA in base all'uso a valle.

Risultati

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Abbiamo eseguito l'ottimizzazione della dose di DSS per le nostre condizioni sperimentali. Il dosaggio del DSS deve essere ricalibrato per ogni struttura animale, ceppo di topo, disegno dello studio e lotto di DSS. Per questo studio, i topi C57BL/6J sono stati alloggiati in uno specifico vivaio privo di agenti patogeni in gabbie ventilate con dieta per roditori con 18% di proteine irradiate ad libitum . Sia i topi maschi che le femmine iniziano a perdere peso a partire dal quinto giorno dopo essere stati messi in acqua DSS, raggiungendo il loro peso più basso tre giorni dopo la sospensione del DSS (Figura 1A, C). Nel giorno di maggiore perdita di peso, i topi maschi hanno mostrato una perdita di peso di circa il 15%, mentre i topi femmina hanno mostrato una perdita di peso di circa il 20% (Figura 1B, D). Sulla base di questi risultati, abbiamo determinato che la dose ottimale per le nostre specifiche condizioni sperimentali era del 3,0% per le femmine e del 3,25% per i maschi. Il programma di trattamento per AOM/DSS è delineato nella Figura 2A, con l'omogeneizzazione del microbioma che avviene all'inizio di ogni ciclo di trattamento DSS fino alla conclusione dell'esperimento per mitigare gli effetti e la variabilità della gabbia. Le dinamiche tipiche della perdita di peso e del recupero degli animali per l'intera durata dell'esperimento sono mostrate nella Figura 2B. Gli animali recuperano completamente il peso corporeo originale entro due settimane dall'interruzione della somministrazione di DSS. Un modello di colite DSS ben calibrato produce granuli di feci molli ma ancora formati invece di diarrea (punteggio di consistenza delle feci 1-2), con rilevamento occasionale di sangue occulto nelle feci indicativo di sanguinamento subclinico e pochi casi di sangue visibile nelle feci (punteggio di presenza di sangue 1-2)17. Per valutare ulteriormente la gravità della colite, sono stati raccolti campioni fecali per analizzare i livelli di lipocalina-2 del marcatore infiammatorio. La presenza di sangue occulto non è stata rilevata nei topi che hanno ricevuto regolarmente acqua potabile durante l'esperimento, a differenza degli animali trattati con DSS (Figura 2C). Coerentemente, i livelli di lipocalina-2 erano aumentati di circa 1.000 volte nei topi trattati con AOM/DSS rispetto ai controlli AOM/solo acqua (Figura 2D).

Al punto finale, abbiamo sezionato i colon e contato i tumori utilizzando una mappa di registrazione dei tumori (Figura 3A). La colite DSS determina una lunghezza del colon significativamente più corta, a differenza dei controlli AOM/solo acqua (Figura 3B). Inoltre, gli animali trattati con AOM/DSS sviluppano tumori del colon visibili, la maggior parte dei quali si forma nell'estremità distale (Figura 3C). L'esame istologico delle sezioni del colon colorate con H&E ha rivelato una significativa erosione delle cellule epiteliali, infiltrazione immunitaria e ulcerazione nei topi AOM/DSS (Figura 4A). La gravità dell'istopatologia del colon può essere quantificata utilizzando sistemi di punteggio consolidati per la CAC murina indotta da DSS, sulla base di quattro parametri (Figura 4B): infiltrazione immunitaria ed edema (0-3), ulcerazione (0-3), morfologia epiteliale del colon (0-4) e neoplasie (0-4)22,23,24. I risultati di tali valutazioni, applicati agli esempi istologici nella Figura 4A, sono presentati nella Figura 4C. La proliferazione epiteliale del colon è stata valutata mediante analisi immunoistochimica utilizzando la colorazione Ki67, dimostrando che il trattamento DSS promuove la proliferazione delle cellule epiteliali del colon. Inoltre, le sezioni del colon possono essere utilizzate per la colorazione immunofluorescente di vari marcatori, come il marcatore di angiogenesi CD31 (Figura 4D, E).

Abbiamo inoltre valutato gli effetti dell'omogeneizzazione del microbiota su endpoint sperimentali come l'entità dell'infiammazione del colon, la perdita di peso corporeo e il carico tumorale cumulativo in ciascun animale. Un gruppo di topi è stato alloggiato in gabbie che sono state sottoposte a miscelazione e ridistribuzione della lettiera sporca il giorno 0 per ottenere l'omogeneizzazione del microbiota, insieme agli animali di controllo in gabbie in cui questa manipolazione è stata omessa. Gli animali di entrambi i gruppi hanno ricevuto il 2,5% di acqua DSS per 7 giorni. Mentre i livelli medi del marcatore infiammatorio lipocalina-2 nelle feci per gabbia il giorno 8 non differivano significativamente tra i gruppi ( t-test di Welch), abbiamo osservato una variabilità significativamente inferiore tra i punti dati nelle gabbie sottoposte a omogeneizzazione del microbiota (Figura 5A, F-test di Welch per confrontare le varianze, p<0,0001). Coerentemente, entro l'ottavo giorno, tutti gli animali hanno mostrato un'entità simile di perdita di peso corporeo rispetto al basale del giorno 0. Tuttavia, i topi nel gruppo di omogeneizzazione del microbiota hanno mostrato una minore variabilità nella perdita di peso corporeo rispetto al gruppo di controllo (Figura 5B). Inoltre, in un protocollo di induzione CAC di 10 settimane (Figura 2A) con (omogeneizzazione del microbiota) e senza miscelazione (di controllo) della lettiera della gabbia prima di ciascun ciclo DSS, il carico tumorale cumulativo per topo era più consistente nel gruppo omogeneizzato del microbiota rispetto ai controlli che erano significativamente più variabili (Figura 5C). Nel complesso, questi dati forniscono una forte evidenza che l'omogeneizzazione del microbiota migliora fortemente la robustezza e la riproducibilità del modello AOM/DSS.

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Figura 1. Titolazione della dose di DSS in topi maschi e femmine. (A-D) Variazione percentuale del peso corporeo rispetto al giorno 0 in topi selvatici di 14 settimane maschi (A, B) e femmine (C, D) C57BL/6J mantenuti in acqua con concentrazioni indicate di DSS (1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% per i maschi e 2%, 3%, 4% per le femmine). (A, C) Agli animali è stato somministrato DSS per 7 giorni e monitorato per la perdita di peso corporeo fino a 12 giorni. B e D mostrano una perdita di peso corporeo dei topi maschi al giorno 8 (B) e delle femmine al giorno 9 (D) dall'inizio del trattamento DSS. I dati sono presentati come medie ± SEM; n=3 in A & B, n=4 in C & D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Cronologia e monitoraggio del CAC indotto da AOM/DSS. (A) Cronologia sperimentale CAC indotta da AOM/DSS. (B) Peso corporeo relativo al giorno 0 in topi femmina C57BL/6J wild-type sperimentali trattati con AOM/DSS (rosso) o di controllo (solo AOM, senza DSS, nero). Tutti gli animali hanno ricevuto una dose di AOM (10 mg/kg) e sono stati randomizzati a tre cicli di DSS al 3% (rosso) o acqua potabile normale (controllo, nero) per un totale di 70 giorni. I dati sono presentati come medie ± SEM, n=2 e 11. (C) Test emoocculto fecale da topi femmina di controllo (solo AOM) o trattati con DSS (AOM e 1,5% DSS). (D) Livelli fecali di lipocalina-2 da 6 topi di controllo (solo AOM, nero) o 35 topi femmina trattati (AOM e 1,5% DSS, rosso) al giorno 70. I dati sono presentati come medie ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Valutazione macroscopica del colon. (A) Esempio di una mappa di registrazione del tumore. (B) Immagini rappresentative del colon da topi femmina di controllo (solo AOM) o trattati con DSS (AOM e 1,5% DSS) al giorno 70. L'accorciamento della lunghezza del colon indica una maggiore infiammazione negli animali trattati con DSS. Barra - 5 mm; , p=0,002, test della somma dei ranghi di Mann-Whitney; n=12 e 30. (C) Quadri macropatologici rappresentativi del colon con tumori al giorno 70 da topi femmina trattati con AOM e DSS al 3% (i tumori sono cerchiati e contrassegnati con triangoli neri). Barra - 5 mm. Callout - vista ingrandita delle regioni del colon distale con tumori; barra - 1 mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Valutazione istologica CAC. (A) Sezioni rappresentative colorate con H&E di colon arrotolati in Svizzera di topi trattati con AOM/DSS e di controllo (solo AOM) al giorno 70 con regioni distali allargate di 3 animali visualizzati a destra. I due punti di controllo mostrano un'organizzazione intatta della cripta del colon. I colon dei topi trattati con AOM/DSS sono caratterizzati da ispessimento sottomucoso (punte di freccia), infiltrazione immunitaria (frecce), rottura o perdita dell'architettura della cripta (stella), erosione dello strato epiteliale, iperplasia epiteliale o epiteli displastici (cerchi) con formazione di adenoma e adenocarcinoma (delineati da una linea tratteggiata). Bar - 500 μm. (B) Sistema di punteggio istopatologico utilizzato per valutare la gravità del fenotipo CAC. (C) Esempio di punteggi istologici del colon da topi trattati solo con AOM o trattati con AOM/DSS mostrati in A. (D) Colorazione immunoistochimica rappresentativa per il marcatore di proliferazione Ki67 in colon arrotolati svizzeri da animali trattati con AOM dopo 1 o 3 cicli di DSS. Le cellule proliferanti Ki67-positive (marroni) si localizzano sul fondo delle cripte del colon ma si diffondono verso l'alto e invadono all'interno delle cripte con l'inizio del CAC e la patologia più avanzata. Bar - 100 μm. (E). Colorazione immunofluorescente rappresentativa che valuta la vascolarizzazione basata sul marcatore endoteliale CD31 (rosso) e controcolorata con DAPI per visualizzare i nuclei (blu) nelle sezioni del colon di topi trattati con AOM/DSS. Barra - 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. L'omogeneizzazione del microbiota riduce la variabilità dell'infiammazione del colon e del carico tumorale CAC. (A) Livelli medi di lipocalina-2 fecale nei topi trattati con DSS al 2,5% il giorno 8. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il t-test di Welch per confrontare i livelli medi di lipocalina-2 fecale tra i due gruppi (p = 0,137, n = 6 e 12 gabbie). Inoltre, è stato condotto un test F sulle varianze, che ha prodotto un valore p di 0,0001, indicando differenze significative nella varianza tra i due gruppi. (B) Perdita media di peso corporeo negli animali trattati con AOM/DSS che hanno ricevuto acqua DSS il giorno 8. Mentre la perdita media di peso corporeo tra i due gruppi non è significativamente diversa ( test t di Welch, p = 0,194, n = 6 e 12), la varianza all'interno dei gruppi è significativamente diversa (test F, p = 0,027). (C) Carico tumorale per topo dopo 10 settimane di trattamento AOM/DSS. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t di Welch per valutare le differenze nel carico tumorale medio tra i gruppi (p = 0,211, n = 8 e 18) e un test F per valutare la differenza tra le varianze (p = 0,013). (A-C) I grafici a violino blu raffigurano il gruppo che ha subito l'omogeneizzazione del microbiota, mentre i grafici a violino verde rappresentano il gruppo di controllo (senza omogeneizzazione del microbiota), ns - non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il protocollo AOM/DSS è stato introdotto per la prima volta nel 1996 da Okayasu et al.25 e da allora è stato riconosciuto come un modello eccellente per imitare fedelmente l'inizio e la progressione del cancro del colon dal tessuto normale alle alterazioni adenomatose e, infine, al carcinoma, come dimostrato da Suzuki et al. nel 200626, specialmente nel contesto dell'infiammazione del colon. Studi successivi hanno valutato gli effetti di AOM e AOM/DSS su diversi ceppi di topo, nonché l'impatto della variazione della durata del trattamento sul fenotipo e sulla penetranza del tumore 26,27,28. Nel 2018, Christopher Williams e il suo gruppo hanno pubblicato un protocollo29 aggiornato che ha gettato le basi cruciali per lo sviluppo di questa metodologia. Recenti progressi hanno ulteriormente dimostrato l'utilità del modello AOM/DSS per gli studi sull'immunità della mucosa integrando metodi per l'isolamento degli infiltrati immunitari intestinali e l'immunofenotipizzazione tramite citometria a flusso30.

Uno dei principali punti di forza del protocollo AOM/DSS è la facile adattabilità praticamente a qualsiasi ceppo di topi, che stimola lo studio degli effetti dei diversi background genetici. Pertanto, Suzuki et al. hanno confrontato la suscettibilità alla carcinogenesi del colon indotta da AOM/DSS in quattro diversi ceppi di topo utilizzando la penetranza dell'adenoma del colon come lettura, con i seguenti risultati: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. Ulteriori studi hanno scoperto che i topi FVB/N sviluppano tumori del colon più facilmente dopo ripetuti trattamenti AOM rispetto ai ceppi C57BL/6J e 129/SvJ27. In particolare, lo sviluppo di un adenocarcinoma del colon ben differenziato con penetranza quasi del 100% è stato riportato nei topi FVB/N in un protocollo di induzione CAC AOM/DSS di 10 settimane31. Questi risultati suggeriscono collettivamente che diversi ceppi di topo potrebbero non essere ugualmente suscettibili al trattamento AOM/DSS, contribuendo alle variazioni nella tumorigenesi e sottolineando ulteriormente la necessità di un insieme coerente di linee guida per l'armonizzazione e la riproducibilità del protocollo AOM/DSS tra ceppi di topo, strutture di stabulazione e altre variabili. Tra questi, una significativa variabilità nel microbioma intestinale ostacola la riproducibilità degli studi incentrati sull'infiammazione e sulla penetranza tumorale 9,10. In particolare, la composizione del microbioma intestinale, comprese le specie Duncaniella muricolitica e Alistipes okayasuensis, può avere un impatto sproporzionato sulla gravità della colite DSS13. Un altro studio ha evidenziato l'importanza della composizione del microbiota nell'induzione del CAC, dimostrando che i topi carenti di NLRP3 mostravano un fenotipo di colite esacerbato caratterizzato da un'aumentata presenza dei phyla batterici Bacteroidetes (in particolare Prevotellaceae) e TM710.

Nonostante la popolarità del metodo, i protocolli AOM/DSS esistenti non hanno affrontato il problema significativo dell'elevata variabilità osservata tra gli animali all'interno dei gruppi sperimentali32. Per affrontare questa sfida, abbiamo presentato una serie di raccomandazioni per l'ottimizzazione e l'armonizzazione dei protocolli implementando la titolazione DSS (tenendo conto del sesso animale) e l'omogeneizzazione del microbiota. Il nostro approccio mira a ridurre la variabilità e migliorare la riproducibilità del modello AOM/DSS attraverso ceppi animali, disegni sperimentali ed endpoint. Sebbene non sia possibile fornire raccomandazioni specifiche in merito alle dimensioni del campione, il numero di repliche sperimentali sarà guidato dal disegno di studio specifico e dalle dimensioni degli effetti attesi per ciascun esperimento. La minore variabilità all'interno del gruppo ottenuta da questi raffinamenti richiede un minor numero di animali in ogni condizione per ottenere la stessa potenza statistica nel rilevare queste differenze. Prevediamo che questi miglioramenti promuoveranno ulteriormente l'uso etico degli animali, la gestione responsabile dei fondi di ricerca e la riduzione della manodopera, portando a una maggiore efficienza.

Il modello AOM/DSS ha un valore traslazionale significativo nello studio del cancro del colon-retto associato alla colite umana. Date le sfide della modellazione del CRC umano a causa della sua complessa eziologia, è importante sottolineare che, sebbene il modello AOM/DSS possa fornire alcune informazioni sulla patogenesi del CRC sporadico, è più appropriato per gli studi sui tumori maligni associati all'infiammazione. Inoltre, il cancro indotto da AOM/DSS ha una bassa incidenza di metastasi 33,34 e quindi è inappropriato per lo studio della diffusione metastatica. Nonostante queste limitazioni, il modello AOM/DSS è altamente penetrante, affidabile, dimostra un'istopatologia rilevante per l'uomo e imita accuratamente la progressione della malattia dall'infiammazione alla displasia all'adenocarcinoma, il tutto rimanendo economicamente efficace. In questo protocollo, forniamo raccomandazioni per generare risultati riproducibili e ridurre al minimo i fattori di confusione in base ai flussi di lavoro esistenti 8,35.

L'identificazione del dosaggio ottimale di DSS attraverso esperimenti pilota dose-risposta, che tengono conto del sesso animale come variabile biologica 16,36,37, è il primo passo critico verso la creazione di un robusto protocollo AOM/DSS (Figura 1). Abbiamo scoperto che il trattamento con DSS al 3% per 7 giorni ha determinato una diminuzione più significativa del peso corporeo nelle femmine (~20%) rispetto ai maschi (~15%) (Figura 1B, D). Tuttavia, i topi maschi possono essere più, meno o ugualmente sensibili al DSS rispetto alle femmine. Ciò può essere attribuibile a diversi ceppi di topi e variazioni nella composizione del microbioma intestinale tra le strutture animali, richiedendo un riaggiustamento della concentrazione di DSS su misura per ogni specifica serie di esperimenti. La concentrazione ottimale di DSS è un compromesso tra la massimizzazione dell'infiammazione del colon e l'induzione del tumore senza superare la tossicità tollerabile. Nella nostra esperienza, questo equilibrio è molto probabilmente raggiunto a dosi di DSS con conseguente perdita di peso corporeo di circa il 20% dopo il primo ciclo. Gli animali tendono a perdere meno peso nel secondo ciclo di trattamento, ma una maggiore riduzione del peso corporeo si osserva generalmente nel terzo ciclo di DSS, potenzialmente a causa della formazione di tumori nel colon. Pertanto, la perdita di peso corporeo del 25% può essere adottata come endpoint umano per i protocolli istituzionali di utilizzo degli animali. Inoltre, la colite DSS ben calibrata si traduce in granuli di feci molli ma ancora formati piuttosto che diarrea e occasionali test emoocculti positivi, ma pochi casi di tracce ematiche visibili nelle feci, con gli animali che dovrebbero riprendersi completamente entro due settimane dalla cessazione della somministrazione di DSS.

Il DSS è un polimero con un peso molecolare compreso tra 36.000 e 50.000 Da. A causa della variabilità da lotto a lotto nella produzione di DSS, è essenziale eseguire esperimenti di ricalibrazione della dose DSS per ogni nuovo lotto del prodotto. Per mantenere la coerenza, è pratico stimare la quantità totale di DSS necessaria per l'intero studio da acquistare dallo stesso lotto. Inoltre, questo protocollo descrive anche i passaggi per standardizzare la composizione del microbiota nell'intera coorte sperimentale di topi durante l'induzione del CAC, mitigando così i potenziali effetti della gabbia per ridurre la variabilità. Come ulteriore precauzione per ridurre al minimo gli effetti della gabbia, si raccomanda che gli animali di diversi gruppi sperimentali siano alloggiati insieme quando possibile. A seconda degli obiettivi sperimentali specifici e delle politiche etiche di uso degli animali, queste considerazioni dovrebbero essere rispecchiate negli esperimenti pilota. La deriva del microbiota può anche essere accelerata dai cambiamenti della lettiera in una gabbia bagnata con bottiglie che perdono. È meglio astenersi dal cambio della gabbia durante la consegna DSS e per i cinque giorni successivi. L'utilizzo di provette da 50 mL per la somministrazione dell'acqua DSS riduce il rischio di perdite e riduce al minimo gli sprechi DSS. Queste considerazioni logistiche possono richiedere una stretta collaborazione tra il personale di ricerca e i tecnici della cura degli animali che eseguono il cambio della gabbia e i servizi di allevamento.

In questo protocollo, forniamo anche un flusso di lavoro di base per la raccolta di tessuti e cellule, nonché per la raccolta dei dati. Ciò include i test per la presenza di sangue occulto (Figura 2C) e la mappatura dei tumori (Figura 3A). Il modello AOM/DSS è adatto a topi immunocompetenti, il che lo rende un sistema ideale per esplorare il microambiente immunitario tumorale grazie al sistema immunitario completamente intatto38,39, in contrasto con gli approcci xenotrapianto. In particolare, è suscettibile di perturbazione sperimentale del sistema immunitario o delle componenti stromali, sia attraverso un sistema genetico Cre-Lox per knock-in/out genici specifici per tipo di cellula o cassette reporter, sia per l'attecchimento o l'esaurimento di specifiche popolazioni cellulari. Ad esempio, combinando il modello AOM/DSS con il trapianto di midollo osseo, abbiamo precedentemente studiato come le mutazioni nel sistema ematopoietico modulano la gravità e il carico del CAC40. Per aiutare in tali studi, esistono eccellenti metodi pubblicati per isolare leucociti vitali infiltranti il tumore adatti per ulteriori analisi, come l'immunofenotipizzazione, i saggi funzionali e la multi-omia a singola cellula41. Infine, a causa dell'elevata penetranza e della latenza costante, il modello AOM/DSS è adatto per studi terapeutici preclinici che utilizzano il carico tumorale totale come lettura primaria.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dai premi NIH R01 DK121831 (OAG) e R01 AI067846 (DA). L'OAG è stato sostenuto anche dalla Edward P Evans Foundation e dalla Oxnard Family Foundation. DA è supportato dal premio Merit Society. L'UFHCC è un centro oncologico designato dall'NCI (P30 CA247796).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Azossimetano in polvereSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586cancerogeno per indurre tumori del colon
Microcentrifuga da bancoNA NAPer la preparazione del campione 
C57BL/6J topiJackson Laboratory000664Ceppo ed età appropriati per ogni studio specifico
Provette coniche, 50 mLFisher14955239Per somministrare acqua DSS
Destrano solfato sale sodico, MW ca 40.000Cayman Chemical 23250Per indurre l'inflmmazione del colon 
Etanolo, 70%Fisher43655223Per igienizzare le superfici di lavoro e gli strumenti di dissezione
Rettifica di perle di vetro, 800 &5; m VWR12621-148Per facilitare l'omogeneizzazione del tessuto del colon/tumore
HemoCue America  Kit per il test del sangue occulto fecale immunochimico Beckman Coulter Hemoccult ICTHemoCue America 395065ACodice prodotto: 23280010Per il rilevamento del sangue occulto nelle feci
Siringa da insulina 27GX5/8 1CC BD 3294-12Per iniezioni AOM
Lixit blockerNANA Perbloccare l'erogazione automatica dell'acqua alle gabbie dei topi, se presenti (fornite dalla struttura per animali, sterille) 
Ancoretta magnetica e piastra di agitazione NANAPer sciogliere DSS 
Omogeneizzatore di microprovette per microtubi, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Per omogeneizzare colon/tumore
Topo Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISA R& D SystemsCodice prodotto: DY1857Per rilevare la lipocalina-2 da campioni fecali
Soluzione NP-40, 10%Thermo Fisher Scientific85124Per la lisi del tumore/colon del tessuto
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA65453Per quantificare la concentrazione di proteine nei lisati tissutali totali, o qualsiasi altro metodo appropriato
Cocktail di inibitori della proteasi e del fosfato...FisherPI78440Per preparare campioni per l'analisi di citochine/proteine 
tampone RLTplusQiagen1053393Per isolare l'RNA o qualsiasi altro metodo di isolamento dell'RNA appropriato
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021Per conservare i campioni di tessuto prima dell'isolamento dell'RNA
Kit RNeasy Microprep QIAGEN74004Per isolare l'RNA, o altri metodi di isolamento e purificazione dell'RNA a seconda dei casi
Ugello per bottiglia d'acqua per roditori (30 mm)Tipodi visione EPer la somministrazione di acqua o soluzione DSS
Forbici e pinze steriliNANA Perla dissezione dei tessuti
Aghi per siringa, 27G x 1/2 pollice di lunghezza (corti)BD 305109Per la fissazione dei tessuti a rullo svizzero del colon 
Siringhe, Luer lock, 3 mLBD 309657Per lavare il colon prima della dissezione e della stadiazione
TapeStationAgilentPer la valutazione della concentrazione dell'RNA e della qualità/integrità
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Dieta standard per roditori, 18% di proteine, irradiata
Cassetta tissutaleVWR#87002-472Per conservare il campione per l'inclusione
Bilancia da laboratorio a caricamento dall'alto, 0-220 gNANAPer pesare gli animali
Whatman Blotting PaperVWR InternationalCat# 28298-020Per la stadiazione di colon sezionati per patologia macroscopica e conta dei tumori

Riferimenti

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