È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Fibroblasti associati al cancro da tumori mammari di topo come strumenti per studi molecolari e computazionali

1.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3 luglio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea i metodi per coltivare, manipolare e analizzare i CAF murini, inclusi saggi funzionali in vitro/in vivo , trascrittomica e analisi computazionale. Inoltre, descrive una piattaforma web-based sviluppata per analizzare i trascrittomi pubblicamente disponibili di componenti stromali ed epiteliali micro-sezionati a cattura laser da una collezione di tumori umani del cancro al seno.

Abstract

Una serie di ricerche ha confermato il ruolo critico del microambiente tumorale (TME) nella crescita e nell'aggressività del cancro al seno (BC). I fibroblasti associati al cancro (CAF), il componente cellulare predominante del TME, influenzano in modo significativo il suo comportamento attraverso un complesso crosstalk con il cancro e altre cellule stromali in risposta a segnali di attivazione derivati dal tumore. I modelli murini sono ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi alla base del ruolo del CAF nella progressione del BC, in quanto consentono la valutazione del TME endogeno e la valutazione del coinvolgimento del sistema immunitario utilizzando studi di xenotrapianto singenico. Qui, presentiamo una serie di metodi per la coltura di CAF derivati da BC, la manipolazione dell'espressione genica e la valutazione delle loro funzioni pro-tumorigeniche utilizzando approcci sia in vitro che in vivo . Descriviamo anche i protocolli per la profilazione dell'espressione genica CAF e l'analisi trascrittomica, insieme a una procedura computazionale per l'inferenza delle firme trascrizionali nei tumori primari utilizzando dati di RNA-seq di massa disponibili pubblicamente. Inoltre, introduciamo uno strumento di facile utilizzo basato sul web per l'analisi dei trascrittomi dei componenti stromali ed epiteliali da tumori BC micro-dissezionati a cattura laser. In definitiva, questi metodi possono fornire preziose informazioni sui meccanismi molecolari che guidano le interazioni CAF-tumore e hanno il potenziale per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.

Introduzione

Il carcinoma mammario (BC) è il tumore maligno più comune che colpisce le donne ed è caratterizzato da una significativa eterogeneità molecolare, con profili molecolari distinti che guidano la diagnosi, le decisioni terapeutiche e la prognosi. Anche il microambiente tumorale (TME) è altamente eterogeneo e svolge un ruolo fondamentale nella progressione del tumore, nell'immunità e negli esiti del trattamento.

I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono il tipo di cellula più abbondante nella TME e regolatori chiave dello sviluppo tumorale. Contribuiscono alla deposizione e al rimodellamento della matrice extracellulare, all'angiogenesi, all'evasione immunitaria e alla resistenza ai farmaci 1,2,3,4,5,6. I CAF influenzano le cellule tumorali attraverso il contatto diretto cellula-cellula, il rilascio di vescicole extracellulari7 e la secrezione di vari fattori solubili 2,5 per promuovere la crescita tumorale, l'invasione e la resistenza alla terapia 8,9,10. Infatti, le firme geniche correlate allo stroma hanno un valore predittivo per la progressione del BC e la risposta alla terapia e sono associate alla resistenza alla chemioterapia 11,12,13,14. Tuttavia, nonostante prove sostanziali suggeriscano che i CAF siano un bersaglio terapeutico attraente, gli studi clinici mirati a queste cellule hanno in gran parte fallito15. Una delle principali sfide è la comprensione limitata dei meccanismi molecolari con cui i CAF modulano il comportamento tumorale. I recenti progressi nelle analisi trascrittomiche spaziali e a singola cellula hanno fornito informazioni più approfondite sulla complessità dei CAF in BC 16,17,18,19,20,21, consentendo l'identificazione di sottotipi distinti di CAF con specifici programmi funzionali16,22 e evidenziando ulteriormente la loro complessità e plasticità23.

I modelli murini geneticamente modificati (GEMM), in cui gli oncogeni o i geni oncosoppressori sono sovraespressi o inattivati, sono modelli consolidati per lo studio del cancro umano 24,25,26,27. Rispetto ai modelli singenici, che prevedono l'innesto di cellule tumorali in topi wild-type23,28, i GEMM imitano più accuratamente la progressione in più fasi del BC e le interazioni tra le cellule tumorali e il TME. Tuttavia, la manipolazione delle attività dei CAF nei GEMM è stata difficile a causa della loro eterogeneità, che rende difficile colpire tutti i sottotipi di CAF senza effetti off-target su altre componenti stromali o epiteliali5. La combinazione di GEMM con approcci complementari, come la manipolazione in vitro di CAF, può aiutare a generare modelli cellulari per esperimenti di perdita di funzione sia in vitro che in vivo. Tuttavia, lo sviluppo di modelli cellulari stabili per esplorare i ruoli funzionali di geni specifici rimane impegnativo a causa della rapida insorgenza della senescenza.

Qui, descriviamo una solida piattaforma per esperimenti stabili di perdita di funzione nei CAF, seguiti da analisi funzionali in vitro e in vivo e profilazione trascrizionale delle cellule ingegnerizzate; questo approccio offre una strategia completa per sezionare la rilevanza funzionale dei geni espressi da CAF nel carcinoma mammario, con vantaggi in termini di specificità, riproducibilità e adattabilità rispetto ai metodi esistenti. Questo approccio è anche integrato da un nuovo strumento basato sul web per esplorare i trascrittomi dei compartimenti stromali ed epiteliali microdissezionati a cattura laser da tumori mammari umani, consentendo confronti tra specie e facilitando la generazione di ipotesi da dati umani.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Questo studio è conforme a tutte le linee guida istituzionali relative alla manipolazione dei topi e al campionamento dei tessuti. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le leggi e le politiche nazionali e internazionali. I topi sono stati alloggiati in un'unità transgenica priva di patogeni specifici con un ciclo luce/buio di 12 ore a 22 °C con il 50% di umidità e hanno ricevuto cibo e acqua ad libitum. Le procedure chirurgiche devono seguire le istruzioni veterinarie istituzionali per garantire un'anestesia e un'analgesia appropriate, sia durante la procedura che nel periodo postoperatorio. La Tabella dei materiali fornisce dettagli su materiali, reagenti e strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Coltura cellulare

  1. Colture di cellule a 37 °C in un'atmosfera al 5% di CO2 con 95% di umidità relativa, in DMEM (HEK293T, CAF e CAF immortalizzati (iCAF)) o terreno RPMI (4T1), integrati con 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina (1% Pen/Strepto).
    NOTA: Composizione completa del terreno (cDMEM, cRPMI): FBS inattivato termicamente al 10%, composizione del terreno di digiuno (sDMEM, sRPMI): no FBS. Tempi medi di raddoppio per le cellule: HEK293T e iCAF sono di 24 ore; Le celle 4T1 sono 12h.
  2. Celle di passaggio quando raggiungono l'80% di confluenza, con un rapporto non superiore a 1:5, mai più di 10 volte dopo lo scongelamento per evitare la deriva fenotipica, come descritto di seguito.
    1. Aspirare il terreno e aggiungere delicatamente 7 ml di PBS sul lato di un piatto da 100 mm. Aspirare il PBS, aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA. Incubare per 2-3 minuti a 37 °C.
      ATTENZIONE: L'EDTA è elencato come composto pericoloso di categoria 2 per l'irritazione oculare. Maneggiare in una cappa biologica/aspirante indossando DPI adeguati.
    2. Inattivare la tripsina-EDTA con 5 mL di cDMEM, staccare le cellule pipettandole verso l'alto e verso il basso e raccoglierle in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 290 x g per 5 min.
    3. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di cDMEM. Per una scissione 1:5, seminare 1 mL di cellule risospese in un piatto da 100 mm contenente 9 mL di cDMEM.
  3. Conteggio delle cellule: caricare 10 μL della sospensione cellulare del passaggio 1.2.3 sul lato di una camera di conteggio Neubauer, contare le cellule nei quadrati grandi e moltiplicare il numero ottenuto per 1 x 104 per calcolare il numero di cellule contenute in 1 mL di sospensione cellulare.
  4. Crioconservazione: Congelare il 50% di una piastra da 100 mm (circa 3 x 106 cellule) in 0,5 mL di terreno di congelamento ghiacciato (10% di DMSO in FBS inattivato a caldo) come descritto di seguito.
    1. Da un piatto di 100 mm, tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 1.2.1 e 1.2.2, tranne per il fatto che le cellule vengono risospese in 1 mL di mezzo di congelamento ghiacciato.
    2. Erogare 0,5 mL in ogni crioviale e porre a -80 °C in un contenitore che garantisca una velocità di raffreddamento di circa 1 °C/min. Ogni aliquota può essere scongelata in una capsula da 100 mm.
  5. Test di contaminazione da micoplasma: Raccogliere 1 mL di terreno di coltura di cellule confluenti coltivate per almeno 3 giorni. Far bollire a 95 °C per 20 min. Centrifugare a 16200 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT). Aggiungere 5 μL di surnatante a 45 μL di miscela di reazione PCR (0,15 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1x tampone di reazione, 1 U Taq polimerasi, 0,5 μM primer A e B, vedere la Tabella 1). Eseguire la PCR, compresi i controlli positivi e negativi, e separare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% insieme a una scala del DNA. I campioni contaminati da micoplasma mostreranno una banda di 600 bp.

2. Isolamento dei CAF dai tumori mammari

NOTA: Questo passaggio è ottimizzato per tumori in stadio avanzato di 5-10 mm di diametro (vedi riferimento29 ).

  1. Sacrifica il topo per lussazione cervicale. Isolare i tumori mammari di almeno 125 mm3. Asportare accuratamente il tumore, rimuovendo la pelle circostante, il tessuto mammario e le aree necrotiche visibili. Utilizzando una pinzetta, raccogliere in una microprovetta da 1,5 ml posta sul ghiaccio.
  2. Pesare il tumore con una bilancia di precisione, asportare un pezzo cubico di 0,1-0,3 g con un bisturi, trasferire in una nuova microprovetta da 1,5 ml riempita con PBS ghiacciato e conservare in ghiaccio. Assicurarsi che il tessuto sia immerso per evitare la disidratazione.
  3. Trasferire in una pirofila di 60 mm di diametro, con ghiaccio. Tritare finemente 1 mL di PBS con un bisturi fino ad ottenere pezzi di circa 1-2 mm.
  4. Trasferire in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL per 0,1 g di tumore in cDMEM più 10 μg/mL di collagenasi. Sciacquare la capsula con 1 mL dello stesso terreno, utilizzando una pipetta P1000 con la punta tagliata per evitare danni alle cellule. Fissare il tappo con una pellicola sigillante per evitare perdite.
  5. Incubare orizzontalmente per 1 ora a 37 °C su un agitatore orbitale. Posizionare un colino cellulare da 70 μm sopra una provetta conica da 50 mL e trasferire l'omogeneizzato con una pipetta sierologica da 10 mL. Utilizzare il retro di uno stantuffo della siringa da 5 ml per macinare e spingere il campione attraverso il filtro.
  6. Utilizzare cDMEM (non superiore a 30 mL di volume finale) per recuperare tutto dal colino. Centrifugare le celle a 129 x g a 4 °C per 10 minuti e scartare il surnatante.
  7. Aggiungere 3 ml di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per rimuovere i globuli rossi (RBC). Chiudere bene i tubi e mescolare per inversione. Incubare per 5 minuti a RT su un agitatore orbitale.
  8. Arrestare la lisi dei globuli rossi aggiungendo PBS a un volume finale di 30 mL. Centrifugare le celle a 129 x g a 4 °C per 10 minuti e scartare il surnatante.
  9. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di cDMEM e contare le cellule vitali come nel passaggio 1.3 utilizzando 10 μL di blu di metilene: le cellule viventi riducono il colorante a un prodotto incolore e non colorano, mentre le cellule morte sono colorate di blu.
  10. Seminare 5 x 105 cellule/piastra da 60 mm in 5 mL di cDMEM, incubare 20 minuti a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%, raccogliere le cellule non aderenti e ripiastarle per una notte.
  11. Dopo 48 ore o 72 ore, eseguire la tripsinizzazione differenziale. Poiché i fibroblasti si staccano più velocemente delle cellule epiteliali e mioepiteliali30, procedere come descritto nel passaggio 1.2. ma monitora attentamente il distacco delle cellule al microscopio. Le cellule a forma di fibroblasto diventeranno rotonde e si staccheranno mentre le cellule epiteliali rimarranno attaccate.
  12. Aggiungere cDMEM per inattivare la tripsina e raccogliere i CAF staccati, trasferendoli in una nuova piastra da 60 mm in 5 mL di cDMEM. Passare i CAF primari 1:3 (vedere il passaggio 1.2) per tre passaggi, quindi preparare le aliquote congelate del passaggio iniziale come descritto nel passaggio 1.4.

3. Immortalizzazione per trasduzione virale

NOTA: Alcuni dei seguenti passaggi devono essere eseguiti in un ambiente adatto alla manipolazione di vettori retrovirali (ad esempio, BSL2+); Controlla le tue regole istituzionali.

  1. Preparazione del virus ricombinante
    1. Coltivare HEK293T le cellule e verificare la presenza di contaminazione da micoplasma (vedere passaggio 1).
    2. Rivestire una piastra di 100 mm di diametro pipettando 6 mL di una soluzione 0,1 mg/mL di poli-L-lisina in ddH2O per 5 minuti a RT, aspirare e lasciare asciugare sotto la cappa (circa 10 minuti).
    3. Seminare 3 x 106 cellule HEK293T (passaggio basso, micoplasma negativo) in 10 mL di cDMEM nel piatto rivestito di poli-L-lisina dal passaggio 3.1.2 (vedere il passaggio 1.3).
    4. Il giorno successivo, preparare due provette contenenti 0,75 mL di terreno ottimizzato per la trasfezione privo di antibiotici. A uno di essi, aggiungere 30 μL di reagente di trasfezione mediata da lipidi cationici (T1). Al secondo, aggiungere 2 μg di pCL-Ampho (vettore di imballaggio retrovirale) e 2 μg di vettore retrovirale del cDNA pBABE-neo largeT (T2). Aggiungere T2 a T1, mescolare delicatamente e incubare per 10 minuti.
    5. Distribuire uniformemente il terreno sulle cellule dopo averlo sostituito con un terreno ottimizzato per la trasfezione privo di antibiotici + 10% di FBS inattivato termicamente. Spostare la piastra in un impianto di coltura tissutale di livello di biosicurezza 2+ (BSL-2+). Sostituire il terreno con cDMEM dopo 6-12 ore e incubare le cellule per 24-48 ore.
    6. Filtrare il terreno contenente le particelle pseudovirali attraverso un filtro per siringa da 0,45 μm e conservare a 4 °C per alcuni giorni o a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
  2. Trasduzione virale del CAF
    1. Seminare 7,5 x 105 CAF in ciascuna delle due piastre da 60 mm in 4 mL di cDMEM (vedere il passaggio 1.3) e coltivarli come al passaggio 1.1.
    2. Il giorno successivo, sostituire il terreno di una piastra con 2 mL del terreno contenente pseudovirus della fase 3.1.6 (CAF trasdotti), aggiungere 2 mL di cDMEM e incubare per 24 ore. Lasciare intatta l'altra pietanza (CAF non trasdotti).
    3. Il giorno dopo, ripetere il passaggio 3.2.2 sui CAF trasdotti. Dopo 24 ore, sostituire il terreno di entrambe le piastre con 4 ml di cDMEM.
    4. Dopo altre 24 ore, iniziare la selezione sostituendo il terreno di entrambe le piastre con cDMEM integrato con 400 μg/mL G418. Sostituire il terreno contenente G418 ogni 2-3 giorni fino a quando non rimangono più cellule vive nella capsula di controllo dei CAF non trasdotti.
      NOTA: Le cellule non trasdotte sono sensibili a G418 e muoiono entro 7-10 giorni, indicando che solo le cellule trasdotte resistenti a G418 saranno sopravvissute nella condizione di CAF trasdotte. La concentrazione ottimale di antibiotico deve essere determinata per ogni tipo di cellula, eseguendo curve di uccisione (testare un intervallo da 50 a 1000 μg/mL di concentrazione di G418 per 7-10 giorni e selezionare la dose che uccide tutte le cellule entro 10 giorni).
    5. Far passare le celle trasdotte selezionate 2 volte con un rapporto 1:3 (vedere il passaggio 1.2) prima di uscire dalla struttura BSL. Preparare aliquote crioconservate dei primi passaggi come al punto 1.4.
    6. Verificare che le cellule continuino a proliferare senza mostrare un fenotipo senescente per diversi passaggi e procedere alla caratterizzazione fenotipica e funzionale (vedi passaggi 4 e 6-9).

4. Caratterizzazione fenotipica

NOTA: I marcatori CAF come l'alfa actina della muscolatura liscia (α-SMA), la caveolina, la proteina attivante i fibroblasti (FAP), la N-caderina, il fattore di crescita beta derivato dalle piastrine (PDGFR-β), S100A4 e la vimentina29 possono essere valutati mediante RT-qPCR e Western Blot.

  1. RT-qPCR: Estrarre l'RNA totale con una soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidina come descritto nel riferimento15. Trascrivere inversamente 2 μg di RNA totale in un volume di 20 μl, seguendo le istruzioni del produttore per le condizioni di reazione. Diluire il cDNA 1:20 e utilizzare 3 μl per eseguire le reazioni RT-qPCR, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella 1 per i primer).
    NOTA: Si consiglia di preparare l'RNA da una piastra a 12 pozzetti.
  2. Western blot
    1. Lavare 2 volte con PBS come descritto al punto 1.2.1, aggiungere 0,2 mL di tampone di lisi ghiacciata, staccare le cellule con un raschietto e raccoglierle in una microprovetta da 1,5 mL come descritto in29. Lasciare agire per 20 minuti in ghiaccio.
    2. Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Quantificare le proteine mediante saggio colorimetrico secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare almeno 20 μg di proteine per il Western blot (vedere la Tabella 2 per gli anticorpi).
      NOTA: Si consiglia di preparare in un piatto le proteine provenienti da non meno di 6 pozzetti.
  3. Analisi delle proteine secrete
    1. Seminare 2 x 106 iCAF (vedere il passaggio 1.3) in un piatto di 100 mm di diametro in 10 mL di cDMEM e coltivarli come descritto nel passaggio 1.1.
    2. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno, lavare 2 volte con 10 mL di PBS e incubare per 48 ore con 10 mL di sDMEM (vedere il passaggio 1.1) per generare il terreno condizionato (CM).
    3. Dopo altre 48 ore, filtrare il CM attraverso un filtro per siringa da 0,2 μm in una provetta conica da 15 mL. Tenere saldamente sia la siringa che il tubo e prepararsi a una certa resistenza. Il CM può essere conservato a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
    4. Concentrare CM circa 10 volte utilizzando concentratori di proteine secondo le istruzioni del produttore, per generare CM concentrato (conCM). Quantificare la CM, far bollire ed eseguire il Western Blot (vedere la Tabella 2 per gli anticorpi).

5. Analisi del knockdown genico

NOTA: Per interferire stabilmente con l'espressione genica, trasduciamo iCAF con particelle lentivirali che esprimono shRNA appositamente progettati. Questi possono essere ottenuti clonando le sequenze di targeting in un opportuno vettore lentivirale come pLKO.1-Puro, seguendo i protocolli disponibili presso https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. Le sequenze di targeting specifiche possono essere selezionate utilizzando strumenti di progettazione di shRNA disponibili al pubblico (ad esempio, GPP-Genetic Perturbation Portal del Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). In alternativa, sono disponibili in commercio set di vettori di targeting predefiniti (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Si consiglia di progettare 4-5 diversi shRNA per ciascun gene e di selezionare i migliori 2 per gli esperimenti. Generare anche vettori non targettizzati come controlli negativi. Alcuni dei seguenti passaggi devono essere eseguiti in un ambiente adatto alla manipolazione di virus derivati dall'HIV (ad esempio, BSL2+). Controlla le tue regole istituzionali.

  1. Generazione di particelle lentivirali
    1. Semina 3 x 106 HEK293T celle come nei passaggi 3.1.1-3.1.3. Il giorno seguente, preparare i complessi reagente di trasfezione mediata da lipidi cationici-DNA come al punto 3.1.4, utilizzando rispettivamente 9 μg e 3 μg dei vettori di imballaggio pCMV-R8.74 e pCMV-VSVG e 7 μg del costrutto pLKO.1 contenente shRNA in 0,75 mL di terreno ottimizzato per la trasfezione privo di antibiotici, e procedere come descritto nei passaggi 3.1.5 e 3.1.6.
  2. Trasduzione dei CAF
    1. Infettare le cellule come descritto nei passaggi 3.2.1, 3.2.2 e 3.2.4. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di infezione e iniziare la selezione con 2 μg/mL di puromicina in cDMEM. Vedere la nota al punto 3.2.5 per determinare la concentrazione ottimale.
    2. Sostituire la puromicina/cDMEM dopo 48 ore. La selezione è solitamente completa in 3 giorni. Espandi e congela le celle come nel passaggio 3.2.6. Valutare l'efficienza del knockdown mediante RT-PCR e Western blot come descritto nei passaggi 4.1. e 4.2.

6. Super-attivazione di iCAF con CM da cellule tumorali

NOTA: I passaggi seguenti illustrano i metodi per la caratterizzazione in vitro delle attività pro-tumorali degli iCAF. Le attività pro-tumorali dei CAF possono essere potenziate incubandole con CM da cellule tumorali BC di topo (super-attivazione, s.a.), come descritto di seguito.

  1. Contare le cellule BC murine 4T1 come descritto al punto 1.3 e seminare 2 x 106 cellule in un piatto di 100 mm di diametro in 10 mL di cRPMI (vedere il passaggio 1.1).
  2. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno, lavare 2 volte con 10 mL di PBS e incubare per 48 ore con 10 mL di sRPMI (vedere il passaggio 1.1) per generare CM.
  3. Il giorno successivo, seminare 2 x 106 iCAF su un piatto di 100 mm di diametro, in 10 mL di cDMEM (vedi passaggio 1.3) e coltivarli come descritto nel passaggio 1.1. Filtrare il CM attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm in una provetta conica da 15 ml come al punto 4.3.3.
  4. Super-attivazione (s.a.): rimuovere il terreno dalla capsula iCAF, lavare 2 volte con 10 mL di PBS e aggiungere il filtrato 4T1 CM (8-10 mL). Incubare per 48 ore per ottenere s.a. iCAF.

7. Proliferazione delle cellule tumorali

  1. Pretrattare le cellule 4T1 per 48 ore con iCAFs CM, preparate come nei passaggi 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Tripsinizzarli e contarli, quindi seminare 4 x 103 cellule/pozzetto di una piastra da 96 pozzetti in 100 μL di cRPMI come descritto nella fase 1.3 e coltura come nella fase 1.1. Piastra tecnica triplicata.
    1. Preparare una piastra da 96 pozzetti al giorno del corso a tempo. Il numero di celle qui suggerito è ottimizzato per un protocollo di 4 giorni; Ridimensionalo per tempi più lunghi.
  3. Dopo 4 ore, o non appena le cellule sono attaccate, rimuovere il terreno, lavare con PBS aggiungendo delicatamente 100 μl, facendo attenzione a non staccare le cellule appoggiando la punta contro il bordo del pozzetto, con una pipetta multicanale e utilizzando un serbatoio sterile. Rimuovere il PBS, quindi aggiungere allo stesso modo 100 μL di sDMEM (controllo) o iCAF CM, entrambi integrati con FBS inattivato termicamente al 2% (vedere i passaggi 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Dopo 4 h, fermare la targhetta giorno 0 come descritto dal punto 7.5. Per gli altri punti temporali, sostituire il mezzo a giorni alterni fino alla fine dell'esperimento.
  5. Per valutare la densità cellulare, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore e lavare i pozzetti 2 volte con 100 μl di PBS, come descritto al punto 7.3.
  6. Sotto una cappa aspirante, aggiungere 100 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% in ciascun pozzetto e fissare le celle per 10 minuti a RT.
    ATTENZIONE: Il PFA può causare gravi danni agli occhi e irritazioni cutanee; È dannoso se ingerito e inalato ed è sospettato di causare difetti genetici e cancro. Maneggiare in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).
  7. Lavare 3 volte con 100 μL di PBS come al punto 7.3 e lasciare asciugare sotto la cappa aspirante (circa 10 min).
  8. Incubare con 50 μl di cristallovioletto allo 0,1% in metanolo al 20% per 10 minuti a RT.
    ATTENZIONE: Il cristallovioletto può causare gravi danni agli occhi ed è segnalato come pericolo di categoria 4 per la tossicità acuta orale e come pericolo di categoria 2 come cancerogeno. Maneggiarlo in una cappa aspirante indossando DPI adeguati.
  9. Lavare 3 volte con 100 μL di ddH2O, svuotare i pozzetti e picchiettare la piastra su un tampone assorbente o un tovagliolo di carta per rimuovere completamente il liquido.
  10. Sciogliere il cristallovioletto in 100 μL di acido acetico al 10% per 15 minuti a RT e misurare la densità ottica (O.D.) a 600 nm di lunghezza d'onda in un lettore di micropiastre, utilizzando 100 μL di acido acetico al 10% come bianco. Normalizza il D.O. per quel giorno a 0 per condizione.

8. Migrazione e invasione

  1. Pipettare 700 μL di DMEM integrati con FBS inattivato termicamente all'1%, Pen/Strepto all'1%, nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare un inserto di pozzetto poroso da 8 μm, rivestito (invasione) o meno (migrazione) con matrice biologicamente attiva, in ciascun pozzetto. Lasciare la piastra nell'incubatore in equilibrio a 37 °C mentre si raccolgono e si contano le cellule 4T1 come al punto 1.3.
  2. Staccare le cellule 4T1 pretrattate per 48 ore con iCAF CM da una piastra di 100 mm di diametro come nei passaggi 4.3.1, 4.3.2 e 4.3.3, utilizzando 1 mL di EDTA da 5 mM invece di tripsina-EDTA.
  3. Aggiungere 5 mL di cDMEM, raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e pellettare centrifugando come al punto 1.2. Risospendere le cellule in sDMEM, contare come al passaggio 1.3 e diluire a 1 x 105 cellule/100 μL.
  4. Aggiungere 100 μl della sospensione cellulare alla camera superiore del transwell. Come controllo della piastra, seminare 100 μL di cellule in una piastra a 24 pozzetti, in 500 μL di cDMEM. Incubare per 16 ore (migrazione) o 24 ore (invasione) e interrompere l'esperimento come descritto di seguito.
    NOTA: I tempi di incubazione devono essere determinati empiricamente se si utilizzano celle diverse.
  5. Etichettare gli inserti sul lato superiore con un pennarello sottile e immergerli in una provetta conica da 50 ml riempita di PBS per il lavaggio con una pinzetta. Pulire accuratamente la parte interna del pozzetto con un batuffolo di cotone.
  6. Sotto una cappa aspirante, incubare i campioni in 700 μl di PFA al 4% per 10 minuti a RT (vedere passaggio 7.6).
  7. Lavare 3 volte con 700 μL di PBS e lasciare asciugare sotto la cappa (circa 10 min). Incubare gli inserti con 700 μl di cristallovioletto allo 0,1% in metanolo al 20% per 10 minuti a RT (vedere passaggio 6.10).
  8. Lavare gli inserti 3 volte immergendoli in una provetta conica da 50 mL riempita con ddH2O utilizzando una pinzetta. Pulire accuratamente la parte interna del pozzetto con un batuffolo di cotone. Conserva i campioni presso RT e scatta foto fino a 3 giorni dopo.
  9. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, scattare una foto con un obiettivo 10x che immagino la maggior parte della superficie del pozzetto, quindi acquisire immagini da 5 aree indipendenti con un obiettivo 20x.
  10. Sciogliere il cristallovioletto in acido acetico al 10% come segue: per i pozzetti, aggiungere 100 μL di acido acetico e mescolare su un agitatore orbitale per 10 minuti a RT; Per i pozzetti, adagiarli su un banco con la superficie inferiore rivolta verso l'alto, depositare 50 μL di acido acetico sulla superficie e mescolare pipettando fino a quando il cristallovioletto non è completamente sciolto.
  11. Leggere l'assorbanza a 600 nm in una piastra a 96 pozzetti utilizzando 50 μl del materiale disciolto dal passaggio precedente. Usa il 10% di acido acetico come bianco.
  12. Normalizzare la densità ottica (O.D.) del controllo della placcatura dal passaggio 8.5 ed esprimere la migrazione o l'invasione in relazione alla condizione di controllo.

9. Crescita del tumore primitivo e formazione di metastasi polmonari

NOTA: Il passaggio seguente illustra i metodi per la caratterizzazione in vivo delle attività pro-tumorali dei CAF. Questa fase è ottimizzata per la valutazione delle caratteristiche pro-tumorigeniche in vivo dei CAF mediante co-iniezione in modelli murini singenici. Poiché sia i CAF che le cellule 4T1 provengono dal background di topo BALB/c, vengono utilizzati topi BALB/c.

  1. A 2 giorni prima dell'iniezione, numerare topi femmina BALB/c di 6 settimane con marchi auricolari identificativi in metallo e radere la 4aregione della ghiandola mammaria con un rasoio.
  2. Raccogliere e contare le cellule 4T1 e gli iCAF s.a., preparati come descritto al punto 6. In una provetta conica da 15 mL, miscelare 1 x 105 cellule 4T1 e 3 x 105 iCAFs/topo, considerando un eccesso di almeno il 20%. Utilizzare 4T1 solo come controllo.
  3. Centrifugare a 290 x g per 5 minuti, risospendere in un volume di PBS calcolato per ottenere il numero di cellule/topi di cui sopra in 50 μL, trasferire in una microprovetta da 1,5 mL e mantenere in ghiaccio.
    NOTA: Ad esempio, per iniettare 10 topi, mescolare 1,2 x 106 cellule 4T1 con 3,6 x 106 iCAF s.a., cellule a pellet e risospendere in 600 μL di PBS. Iniettare 50 μl di sospensione cellulare per topo.
  4. Preparare l'area di lavoro pulendo e disinfettando la superficie di una cappa a flusso laminare. Coprire una tavola chirurgica in schiuma con un foglio protettivo per banco.
  5. Anestetizzare i topi uno alla volta, secondo le procedure istituzionali (utilizziamo l'iniezione intraperitoneale di base di tiletamina/base di zolazepam + xilazina 70 mg/kg + 5 mg/kg). Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Usando una punta di cotone, disinfettare la pelle con una soluzione di iodio povidone.
  6. Usa il test di pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarti che i topi siano sotto anestesia adeguata. Con un ago ipodermico, iniettare 50 μL della sospensione cellulare nel 4°cuscinetto adiposo mammario. Utilizzare il nipplo come riferimento e iniettare circa 3 mm verso la gamba omolaterale.
  7. Ispezionare i topi per alcune ore dopo l'iniezione e nei giorni successivi. I tumori diventano palpabili dopo 4 giorni.
  8. Misurare la dimensione del tumore ogni 48 ore con un calibro, determinando i diametri massimo e minimo. Calcolare il volume del tumore utilizzando la formula: (lunghezza x larghezza2)/2.
  9. Dopo 10 giorni dall'iniezione, rimuovere chirurgicamente i tumori primari come descritto di seguito.
    1. Preparare l'area chirurgica come al punto 9.5. Sterilizzare gli strumenti in autoclave e posizionarli su una superficie sterile durante il lavoro. Sterilizzare gli strumenti tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore a perline calde.
    2. Anestetizzare i topi come nei passaggi 9.6 e 9.7. Usando una lama di bisturi, praticare un'incisione di 5-8 mm vicino al tumore e tirare delicatamente via la pelle, creando una piccola tasca per accedere al tumore. Cauterizzare qualsiasi vaso sanguigno visibile con una penna cauterizzante a bassa temperatura per evitare emorragie durante la dissezione.
    3. Usa il bisturi per rimuovere il tumore, cercando di non rimuovere la pelle. Riposizionare i lembi di pelle nella loro posizione originale, suturarli insieme utilizzando un filo chirurgico 5-0 con un ago da 17 mm 1/2c e aggiungere colla chirurgica per sigillare completamente la ferita.
    4. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Gli animali sottoposti a intervento chirurgico non vengono restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
  10. Monitorare attentamente gli animali dopo l'intervento chirurgico e nei giorni successivi, somministrare un trattamento analgesico se necessario, secondo i protocolli istituzionali. Utilizziamo iniezioni sottocutanee di Carprofene (3-5 mg/kg).
  11. Pesare il tumore utilizzando una bilancia di precisione come al punto 2.2. Sezionare il tumore a metà usando il bisturi. Mettere una metà in una microprovetta da 1,5 mL, congelarla in azoto liquido e conservarla a -80 °C per le analisi molecolari. Fissare l'altra metà in 5 mL di PFA al 4% in una provetta conica da 15 mL per 24 ore a 4 °C per l'analisi istologica.
  12. Al giorno 21 dopo l'iniezione, sacrificare i topi mediante esposizione a CO2 e raccogliere i polmoni dopo l'infusione intratracheale con PFA al 4% come descritto di seguito. Lavorare sotto una cappa aspirante.
    1. Aprire la cavità toracica utilizzando le forbici chirurgiche. Rimuovere la pelle dalla zona sottomandibolare e dalle ghiandole salivari per esporre chiaramente la trachea.
    2. Preparare una siringa con ago da 22 G contenente una soluzione di PFA al 4%. Inserire l'ago nella trachea del topo, dirigendolo verso i polmoni mentre si blocca la trachea verso la testa. Iniettare la soluzione fino a quando i polmoni non si gonfiano (circa 2 mL).
    3. Sezionare i polmoni e metterli in una provetta da 15 ml contenente una soluzione di PFA al 4%. Capovolgere delicatamente il tubo alcune volte e lasciarlo fissare per 24 ore a 4 °C.
  13. Eseguire sezioni semi-seriali dei polmoni e colorare con ematossilina ed eosina (H&E), una fetta ogni 50/100 μm fino all'esaurimento del campione, come descritto nel riferimento31.
  14. Punteggio delle metastasi dopo l'analisi guidata dal software delle microfotografie delle sezioni colorate con H ed E.

10. Firme di espressione genica

  1. Definire una firma genetica come descritto di seguito.
    1. A seconda del contesto sperimentale e della specifica questione biologica indagata, ottenere una firma genica in diversi modi. Più comunemente, valutare l'espressione differenziale tra due condizioni (ad esempio, CAF vs controparti normali, o trattate in diversi modi (ad esempio, super-attivate o silenziate) vs non trattate.
    2. In alternativa, identificare i geni più variamente espressi o informativi nei campioni analizzati (ad esempio, geni con alta varianza o con carichi elevati sui primi componenti di un'analisi dei componenti principali). In questo caso, utilizzeremo come esempio una firma regolamentata da STAT3. Questa firma è stata definita come i geni sottoregolati dopo il silenziamento di STAT3 nei BC CAF29, come descritto di seguito. Per una descrizione approfondita del sequenziamento dell'RNA, vedere i riferimenti32,33.
  2. Estrarre l'RNA totale in triplicato tecnico da ciascun campione come al punto 4.1.1 e valutare la qualità dell'RNA per verificarne l'integrità (RIN ≥ 9).
  3. Preparare librerie da 2 μg di RNA selezionato in poli(A) e sequenziarle. Abbiamo utilizzato la piattaforma NextSeq 500.
  4. Letture della mappa sull'assembly di riferimento Mus musculus mm9 utilizzando TopHat v2.0. 1034.
  5. Calcola la conta dei geni utilizzando lo strumento htseq-count del pacchetto HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Eseguire l'analisi delle espressioni differenziali utilizzando R e il pacchetto DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Filtrare i geni down-regolati con FDR < 0,05 per definire la firma STAT3.

11. Stima dell'espressione della firma nei tumori primari

NOTA: I passaggi seguenti descrivono una procedura per stimare computazionalmente l'espressione della firma regolata da STAT329 attraverso i dati trascrittomici pubblicamente disponibili dei tumori primari BC, testando la sua relazione con la proporzione stromale stimata nello stesso set di campioni.

  1. Installare R (https://cran.r-project.org/) e RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Avvialo e installa le librerie richieste: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Scarica i dati di espressione genica del tumore primario, come i dati TCGA da https://portal.gdc.cancer.gov/, i dati METABRIC da http://synapse.org/ (syn1757063) o altri dati trascrittomici dal Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) come matrici di espressione pre-normalizzate. I dati devono essere formattati come matrice numerica con righe come geni e colonne come campioni, normalizzati a seconda della piattaforma e ridimensionati in base ai log utilizzando un offset di 1.
    1. Scarica l'elenco degli ortologhi genetici topo-umani da Biomart all'indirizzo https://www.ensembl.org/biomart/martview/, seleziona il database: ensembl genes, scegli il set di dati dei geni umani e fai clic sulla selezione degli attributi nella scheda a sinistra.
    2. Dalle Funzionalità preselezionate, aprire la scheda ESTERNO e selezionare il simbolo HGNC, selezionare Omologhi nella casella nella parte superiore della pagina e selezionare Ortologhi del topo / Nome del gene del topo.
    3. Fai clic sul pulsante Risultati nell'angolo in alto a sinistra, seleziona il formato CSV e fai clic sul pulsante VAI per scaricare il file.
  3. Carica la firma di espressione genica (un insieme di geni) in R. In questo caso, utilizziamo l'elenco dei geni downregolati al silenziamento di STAT3 nei CAF murini.
  4. Caricare l'elenco degli ortologhi genici topo-umani in R e mappare la firma STAT3 agli ortologhi umani corrispondenti tramite la tabella Biomart.
  5. Carica i dati di espressione genica del tumore primario in R e chiama la funzione GSVA con i parametri come oggetto ssgseaParam, inclusi i dati del tumore primario e un elenco che comprende la firma STAT3.

12. Testare la relazione tra l'espressione della firma genica e le caratteristiche cliniche

  1. Identificare le variabili di interesse. La percentuale stromale rappresenta la proporzione di cellule nel campione tumorale sequenziato appartenenti allo stroma tumorale. Utilizzare le seguenti caratteristiche cliniche spesso associate ai dati omici: dimensioni del tumore, stadio, età del paziente alla diagnosi, stato dei linfonodi, stato delle metastasi, ecc. Per il TCGA sono disponibili stime percentuali stromali precalcolate.
    NOTA: In particolare, le stime stromali disponibili sono: EDec Immunitaria/Stromale = Deconvoluzione epigenomica della percentuale stromale/immunitaria37; Punteggio immunitario = ssGSEA basato sui profili di espressione genica di 141 geni immunitari38; LUMP = Unmetilazione dei leucociti per la purezza, che rappresenta in media 44 siti CpG immuno-specifici non metilati39; Punteggio stromale = ssGSEA basato sui profili di espressione genica di 141 geni stromali38; IHC = stimato mediante analisi di immagini di vetrini colorati con ematossilina ed eosina prodotti dal Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40; ASSOLUTO = basato sui dati somatici del numero di copie41.
  2. Scarica i dati EDEc dai punteggi http://genboree.org/theCommons/documents/569, stromale e immunitario da https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) e i dati sulla purezza del tumore (LUMP, IHC, ABSOLUTE) da TCGAbiolinks. Per altri set di dati, calcolare la percentuale di stroma utilizzando il pacchetto GSVA, calcolando l'ssGSEA per lo stroma e le firme immunitarie ottenute da Yoshihara et al.38.
  3. Calcolare la correlazione tra il vettore numerico della proporzione stromale stimata e il vettore numerico dell'espressione della firma STAT3 nei campioni di tumore primario. Ciò può essere ottenuto con la funzione cor.test in R.
  4. Scarica i dati clinici associati al set di dati trascrittomici dei tumori primari sotto forma di tabella con campioni in righe e caratteristiche cliniche in colonne.
  5. Caricare i dati clinici in R e verificare che i campioni nella matrice trascrittomica e nella tabella dei metadati siano nello stesso ordine della funzione di corrispondenza.
  6. Per le variabili numeriche (ad esempio, la dimensione del tumore), calcolare la correlazione tra il vettore numerico dell'espressione della firma STAT3 nei campioni di tumore primario e il vettore dei valori delle caratteristiche cliniche con la funzione cor.test.
  7. Per le variabili categoriali (ad esempio, lo stato delle metastasi), testare la differenza nell'espressione della firma STAT3 tra due gruppi di campioni (ad esempio, tumori metastatici e non metastatici) con il test della somma dei ranghi di Wilcoxon non parametrico (supponendo che i due gruppi di campioni siano indipendenti). Ciò può essere ottenuto con la funzione wilcox.test in R.

13. Testare la regolazione della firma nello stroma tumorale

NOTA: L'espressione di una firma stromale nei tumori primari analizzati attraverso il sequenziamento di massa dell'RNA ha il vantaggio di fare affidamento su ampie coorti di pazienti con annotazioni cliniche dettagliate. D'altra parte, solo la separazione dello stroma e dell'epitelio consente di definire i cambiamenti di espressione genica in uno dei due compartimenti cellulari del tumore rispetto al tessuto normale42. MetaLCM è una ShinyApp che facilita l'analisi di set di dati trascrittomici di tumori mammari microdissezionati a cattura laser. Attraverso questo strumento, l'utente può cercare robusti geni differenzialmente espressi tra due condizioni attraverso set di dati trascrittomici di tumori mammari microdissezionati con cattura laser e testare la regolazione di firme geniche precedentemente definite nello stroma tumorale. I passaggi seguenti descrivono come utilizzare MetaLCM.

  1. Accedi all'app al link https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. Per avviare l'analisi, selezionare le caratteristiche delle condizioni confrontate.
  2. Scegli la direzione per il confronto. Scegliendo geni sovraregolati, vengono mostrati i geni con maggiore espressione nella condizione 1.
  3. Scegliere la soglia del valore p per l'espressione differenziale e premere Esegui per eseguire l'analisi e ogni volta che le impostazioni vengono modificate.
  4. Per limitare l'analisi a un elenco di geni predefinito, digitare i simboli dei geni separati da virgole o importare un file CSV contenente i simboli dei geni in un'unica colonna.
  5. Premere Invia elenco geni per importare i simboli genetici. Premere Ripristina per ripristinare l'analisi utilizzando tutti i geni. Salvare l'elenco dei geni differenzialmente espressi: quando viene fornito un elenco di geni, viene eseguita la correzione di test multipli solo su quei geni. La tabella comprende la logFC media, il valore p compresso e i singoli valori logFC e p per l'espressione differenziale in ogni set di dati disponibile.
  6. Traccia una mappa di calore con le variazioni di piega dei geni espressi in modo differenziale. La heatmap mostra solo i geni espressi in modo differenziale con il segno completamente coerente di espressione differenziale tra i set di dati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Valutazione in vitro delle attività dei CAF
Il contributo dei fibroblasti associati al cancro (CAF) derivati dal tumore mammario alle caratteristiche aggressive del cancro al seno (BC) è stato studiato utilizzando CAF immortalizzati (iCAFs) generati secondo la fase 3. Gli iCAF sono stati super-attivati come descritto nel passaggio 6, quindi affamati in sDMEM per raccogliere il loro CM, che è stato utilizzato per trattare le cellule 4T1 per 48 ore (vedi passaggio 7.1). Questo ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo studio, presentiamo protocolli ottimizzati per l'immortalizzazione di CAF murini e la caratterizzazione delle loro attività pro-tumorigeniche sia in vitro che in vivo. Piuttosto che isolare selettivamente specifici sottotipi di CAF in base all'espressione del marcatore, abbiamo scelto di conservare l'intera popolazione cellulare per preservare l'eterogeneità. Le cellule sono state caratterizzate funzionalmente nel loro insieme e i loro profili di espressione g...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG16930 e IG24851 a V.P.); il Ministero dell'Università e della Ricerca (MIUR PRIN 2017 e 2022 a V.P.); la Fondazione Truus e Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, donazione a V.P.; Regione Piemonte (deviare). A.S. è stata supportata da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (FIRC) e L.A. è stata supportata dalla Fondazione Umberto Veronesi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Scala del DNA da 1Kb plusThermoFisher Scientifico10787018
Piastra a 24 pozzettiSarstedt833922
Piastra a 96 pozzettiSarstedt833924
Acido aceticoSigma Aldirch695092
AgeI-HFBiolaboratori del New EnglandR3552Conservare a -20 ° C
BetadinaMeda Pharma23907076
Bü rker Camera di conteggio VWR40443703
Cauteria Bassa Temperatura FineTip DispKeelerAX10339KL
CentrifugaEppendorf5810R
Provetta conica 15 mLSarstedt62554502
Provetta conica 50 mLSarstedt62547254
Microprovette Cryopure 2 mLSarstedt72380992
Cristallo violaSigma AldirchCodice: C0775Conservare presso RT, utilizzare in una cappa aspirante 
Piastra di coltura diametro 100 mm Sarstedt833902
Piastra di coltura diametro 60 mm Sarstedt833920
ddH20CasereccioConservare presso RT, utilizzare in una cappa biologica
Calibro digitalePreciva02-301-2
Microscopio digitaleLeicaDM6B
DimetilsolfossidoSigma AldirchD8418Utilizzo in una cappa biologica
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)Gibco11965092Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
EcoRI-HFBiolaboratori del New EnglandR3101Conservare a -20 ° C
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma AldirchE6758Conservare presso RT, utilizzare in una cappa biologica
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16000044Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Puntali filtrati 10 & micro; LSarstedt703010255
Puntali filtrati 100 & micro; LSarstedt703030255
Puntali filtrati 1000 & micro; LSarstedt703060255
Puntali filtrati 20 &; micro; LSarstedt703030265
Puntali filtrati 200 & micro; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 µ m Sarstedt831826
Forbici fini2Biol1406009
Pinza2Biol1102412
GeneticinaGibco10131035Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientifico11668019Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Camere di invasione Matrigel con 8 μ m Membrana in PET Corning354480
Lettore di micropiastre (assorbanza 600 nm)PromegaGM3500
Microprovette 1,5 mLSarstedt7269001
OpportunitàGibco31985047Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Paraformaldeide (PFA)Sigma Aldirch158127Conservare presso RT, utilizzare in una cappa aspirante
pBABE-neo largeTcDNA Addgene1780Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
pCL-AmphoNovus Biologico 18746853Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
pCMV-R8.74Addgene22036Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
pCMV-VSVG Addgene8454Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
Penicillina-Streptomicina (Pen Strepto, 10.000 μ g/mL) Gibco15140122Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Microscopio a contrasto di fase Olimpo BX42
Soluzione salina tamponata con fosfato  (PBS)CasereccioConservare presso RT, utilizzare in una cappa biologica
pLKO.1-Puro Addgene10878Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
Soluzione di poli-L-lisinaSigma AldirchP8920Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Puromicina dicloridrato da  Streptomyces albonigerSigma AldirchP8833
rCutSmart Buffer Biolaboratori del New EnglandB6004Conservare a -20 ° C
Rasoio per roditoriEsculapGT416
Istituto commemorativo di Roswell Park (RPMI)Gibco61870010Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Tamponi assetati a punta tondaSigma AldirchZ744127
BisturiGima27041
Secura Semi Micro BalanceSartoriusSECURA125-1S
Pipetta sierologica 10 mLSarstedt861254001
Pipetta sierologica 2 mLSarstedt861252001
Pipetta sierologica 25 mLSarstedt861256001
Pipetta sierologica 5 mLSarstedt861253001
Punti 5-0Ethicon1866G
Siringa 10 mLPentaferteCodice 00202250E14
Siringa 5 mLPentaferteCodice 00202250E12
Siringa Omnican Insulina 1 mLBraun9151125S
Adesivo tissutale3M VetbondCodice: 1469SB
Inserti Transwell 8 µ m poro Falcone353097
Inserti Transwell Matrigel 8 &; micro; m poro Corning354480
Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenoloGibco15400054
Concentratore centrifugo Vivaspin 20 MWCO 10.000 giorniSigma AldirchZ614602

Riferimenti

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Microambiente tumoraletumore al senoprofilazione dell'espressione genicaanalisi trascrittomicasaggio di invasionesaggio di migrazionegeni target di STAT3microdissezione a cattura laser
Fibroblasti associati al cancro da tumori mammari di topo come strumenti per studi molecolari e computazionali
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.