Articolo metodologico

Isolamento, coltura e caratterizzazione dei fibroblasti associati al cancro alla prostata

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DOI:

10.3791/68367

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1 agosto 2025

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1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce una procedura completa per isolare, espandere e immortalizzare i fibroblasti dalle prostatectomie radicali. Inoltre, descrive i saggi sviluppati per valutare gli effetti funzionali del crosstalk fibroblasto-cellula tumorale, sfruttando sia il trattamento con terreno condizionato che la co-coltura.

Abstract

Lo stroma tumorale può essere modellato attivamente dalle cellule tumorali per adottare proprietà pro-tumorigeniche, rendendolo un punto focale della ricerca sul cancro. Tra i componenti stromali, i fibroblasti associati al cancro (CAF) - spesso il tipo di cellula più abbondante nel microambiente tumorale (TME) - svolgono un ruolo fondamentale nel promuovere la progressione del cancro attraverso le loro interazioni con le cellule tumorali e altri componenti stromali. Chiarire i meccanismi alla base di queste interazioni richiede metodi solidi per isolare e caratterizzare i CAF, che possono anche gettare le basi per lo sviluppo di nuove terapie antitumorali mirate ai CAF. Questo studio presenta un metodo per isolare i fibroblasti sia dal tumore che dalle regioni normali adiacenti di campioni di prostatectomia radicale ottenuti da pazienti con carcinoma prostatico (PCa). Questo approccio consente l'isolamento simultaneo dei CAF e delle loro controparti normali (NF) dallo stesso individuo, fornendo un sistema sperimentale accoppiato. Protocolli dettagliati sono forniti per il mantenimento di CAF e NF primari per analisi in vitro a valle, nonché per la loro immortalizzazione per facilitare studi a lungo termine. Descriviamo anche saggi funzionali progettati per confrontare gli effetti di CAF e NF sui comportamenti delle cellule tumorali, tra cui la proliferazione, la migrazione e la crescita indipendente dall'ancoraggio. Vengono descritti in dettaglio due approcci complementari: il trattamento delle cellule tumorali con terreni condizionati derivati da fibroblasti (CM) e la co-coltura diretta di fibroblasti con cellule tumorali. Insieme, queste metodologie rappresentano un kit di strumenti completo per studiare l'interazione dinamica tra CAF e cellule tumorali, non solo nel PCa ma potenzialmente in una serie di tumori umani. Inoltre, la caratterizzazione molecolare di queste interazioni può rivelare mediatori chiave dell'oncogenesi guidata da CAF, offrendo bersagli promettenti per l'intervento terapeutico.

Introduzione

Il cancro alla prostata (PCa) è il tumore più frequentemente diagnosticato negli uomini in quasi due terzi dei paesi del mondo. Nel 2022 sono stati segnalati circa 1,5 milioni di nuovi casi, con 3.97.000 decessi a livello globale. Queste cifre fanno del PCa il secondo tumore più comune e la quinta causa di mortalità correlata al cancro tragli uomini.

La PCa è una malattia multifocale e biologicamente complessa, caratterizzata da una sostanziale eterogeneità intertumorale 2,3,4, diversi sottotipi molecolari e esiti clinici variabili 5,6, che influenzano in modo significativo la prognosi e la risposta terapeutica7.

Mentre il ruolo critico del microambiente tumorale (TME) nell'inizio e nella progressione del tumore alla prostata è ben noto 8,9, le interazioni molecolari tra le cellule tumorali e il compartimento stromale circostante rimangono non completamente comprese. Sebbene sia ben noto che il microambiente tumorale della prostata (TME) svolge un ruolo critico nell'inizio e nella progressione del tumore, le interazioni molecolari tra le cellule tumorali e lo stroma circostante rimangono non sufficientemente definite. La TME comprende una varietà di cellule stromali, comprese quelle di origine mesenchimale e immunitaria, che si attivano in risposta a segnali derivati dal tumore e successivamente acquisiscono funzioni di promozione del tumore10,11. Tra questi, i fibroblasti associati al cancro (CAF) rappresentano spesso la popolazione stromale più abbondante. I CAF contribuiscono al rimodellamento della matrice extracellulare (ECM), promuovono la crescita tumorale e facilitano l'invasione e la migrazione delle cellule tumorali 4,11,12,13. Attraverso fattori secreti e interazioni dirette cellula-cellula, i CAF influenzano anche la proliferazione, l'invasione e la resistenza alla terapia. In particolare, i CAF sono una popolazione eterogenea. Sebbene generalmente associati a funzioni pro-tumorigeniche, alcuni sottotipi possono esercitare ruoli soppressivi del tumore 14,15. È importante sottolineare che l'assenza di marcatori univoci per i CAF pone sfide per la loro precisa identificazione e la dissezione funzionale dei loro diversi ruoli12,16.

Un approccio robusto per studiare il crosstalk funzionale tra CAF e cellule tumorali prevede l'isolamento di CAF primari e fibroblasti normali (NF) abbinati, quindi la valutazione della loro rispettiva influenza sui comportamenti delle cellule tumorali come la proliferazione, la migrazione, la formazione di colonie e la crescita indipendente dall'ancoraggio 17,18,19. Questo articolo descrive un protocollo raffinato e altamente riproducibile per l'isolamento di CAF e NF da campioni di prostatectomia radicale di pazienti con PCa ad alto rischio. Una componente fondamentale di questo protocollo è l'identificazione e la dissezione accurate del tumore e delle regioni libere da tumore da parte di un uropatologo esperto, che consente la derivazione di CAF e NF dallo stesso paziente. Questo approccio a campioni accoppiati aiuta a controllare l'eterogeneità intertumorale e le variabili specifiche del singolo paziente che possono influenzare i fenotipi dei fibroblasti 20,21,22. Per garantire la disponibilità di una quantità sufficiente di tessuto tumorale, ci concentriamo su campioni di pazienti con un punteggio di Gleason ≥7.

Una caratterizzazione fenotipica affidabile dei fibroblasti isolati richiede l'uso di più marcatori per distinguerli da altri tipi di cellule, in particolare dalle cellule epiteliali, che possono condividere l'espressione di marcatori sovrapposti16. Poiché i fibroblasti primari del PCa vanno tipicamente incontro a senescenza dopo 10-15 passaggi, complicando le analisi a lungo termine, presentiamo anche un protocollo per l'immortalizzazione cellulare attraverso l'espressione stabile della trascrittasi inversa della telomerasi umana (hTERT)23.

Per esplorare gli effetti funzionali di CAF e NF sulle cellule tumorali, abbiamo testato e ottimizzato diverse strategie sperimentali. Dato che i CAF esercitano la loro influenza sia attraverso fattori secreti che attraverso il contatto diretto cellula-cellula24, vengono sviluppati due sistemi di analisi complementari: (1) trattamento di cellule tumorali con terreno condizionato da fibroblasti (CM) e (2) co-coltura diretta di fibroblasti e cellule tumorali. Questi saggi valutano le proprietà chiave delle cellule tumorali, tra cui la proliferazione, la crescita indipendente dall'ancoraggio e la migrazione. Per standardizzare l'influenza dei fattori secreti, i terreni condizionati da CAF e NF sono stati concentrati e quantificati (conCM) in base al contenuto proteico totale.

La dimostrazione di effetti funzionali significativi attraverso questi saggi può supportare l'identificazione di mediatori critici della tumorigenesi guidata da CAF, offrendo potenziali bersagli per l'intervento terapeutico.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto nel pieno rispetto delle linee guida istituzionali per l'uso di campioni clinici, approvate dal Comitato Bioetico dell'Ospedale Città della Salute Molinette di Torino. Tutti i campioni sono stati ottenuti dopo la firma del consenso informato da parte dei pazienti partecipanti. La sezione seguente fornisce un protocollo dettagliato e dettagliato per l'isolamento dei fibroblasti associati al cancro (CAF) e delle loro controparti di fibroblasti normali (NF) corrispondenti. Il protocollo include la dissezione del tumore e delle aree adiacenti non tumorali, il processamento dei tessuti, la coltura cellulare e la caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule isolate. Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili all'interno di una cappa di biosicurezza certificata. Le cellule sono state coltivate a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 utilizzando il Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM) completo, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina, se non diversamente specificato. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite con il freno inserito. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per un elenco completo dei reagenti, dei materiali e delle attrezzature utilizzate nel protocollo. Questa metodologia è stata ottimizzata per i campioni di cancro alla prostata ad alto rischio, con un punteggio di Gleason di 4+3 o superiore.

1. Dissezione chirurgica del campione

NOTA: Questa procedura è stata eseguita su campioni chirurgici raccolti da procedure di prostatectomia radicale25 eseguite su pazienti con carcinoma prostatico di alto grado (PCa) e gestita seguendo protocolli standardizzati, basati su linee guida istituzionali interne e letteratura internazionale e migliori pratiche 26,27,28.

  1. Posizionare la ghiandola prostatica sotto un cappuccio di biosicurezza su un telo sterile e orientarla in base ai punti di riferimento anatomici.
    NOTA: Questa procedura deve essere eseguita da un uropatologo esperto.
  2. Utilizzando una lama sterile, asportare fette di tessuto da aree identificate nel referto della biopsia preoperatoria come neoplastiche o prive di cellule tumorali.
  3. Condurre un'analisi criostatica rapida29 su entrambi i campioni di tessuto, preparando sezioni di tessuto spesse 2,5 μm e colorandole con ematossilina ed eosina (H&E) per verificare la presenza o l'assenza di cellule tumorali nelle regioni selezionate, in conformità con i criteri diagnostici per l'adenocarcinoma prostatico dell'ultima edizione della classificazione dell'OMS30 (vedi Figura 1A).
    NOTA: In caso di discrepanze, ripetere il processo di campionamento fino a ottenere la conferma istologica delle aree neoplastiche e non neoplastiche.
  4. Asportare circa 10 mm2 di campioni dalle regioni neoplastiche e non neoplastiche, metterli in provette coniche da 15 mL contenenti 7 mL di tampone di conservazione dei tessuti ghiacciato e tenerli in ghiaccio per le procedure successive.
    NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 48 ore in questo tampone.

2. Isolamento dei fibroblasti

NOTA: Tutte le seguenti procedure di lavorazione devono essere eseguite su ghiaccio a 4 °C, se non diversamente specificato. Vedere la Figura 1 A per uno schema.

  1. Giorno 1: Pesare i campioni di tessuto.
    NOTA: si ottengono in media 70-100 mg.
  2. Passare alle piastre da 6 cm ed eseguire quattro lavaggi sequenziali, due volte in 4 mL di PBS ghiacciato e due volte in 4 mL di cDMEM ghiacciato, entrambi integrati con 200 U/mL di penicillina, 200 μg/mL di streptomicina (2x), utilizzando una pinza sterile per trasferire il tessuto da una piastra all'altra.
  3. Disgregare meccanicamente il tessuto mettendolo in una piastra di 6 cm su ghiaccio, con 1 mL di DMEM integrato con 100 U/mL di penicillina-G e 100 μg/mL di streptomicina, quindi tritarlo in piccoli frammenti (<1 mm2) usando forbici o lame.
  4. Trasferire in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di cDMEM ghiacciato. Centrifugare a 754 x g per 5 min a 4 °C.
  5. Utilizzare una pipetta da 10 ml per rimuovere con cura il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di cDMEM ghiacciato. Centrifugare nuovamente a 754 x g per 5 min a 4 °C.
  6. Rimuovere il surnatante come sopra e risospendere il pellet in Collagenasi II (1 mg/mL in DMEM), utilizzando 1 mL/100 mg di tessuto. Passare a una microprovetta da 1,5 mL.
    NOTA: A causa della variabilità dei lotti di collagenasi, testare lotti diversi e assicurarsi che ne abbiano abbastanza per eseguire tutti gli isolamenti previsti.
  7. Coprire le provette con pellicola di paraffina e digerire i campioni O/N (8-12 h) a 37 °C con oscillazione continua.
    NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il giorno 2.
  8. Trasferire i campioni in provette coniche da 15 mL e aggiungere 5 mL di cDMEM ghiacciato alla sospensione cellulare per inattivare la collagenasi, quindi centrifugare a 754 x g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: La collagenasi viene smaltita aspirandola in un contenitore contenente detersivo.
  9. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta da 10 mL e risospendere il pellet in 1 mL di tripsina/EDTA allo 0,05%. Incubare per 5 minuti a 37 °C, agitando di tanto in tanto.
  10. Aggiungere 1 mL di DNasi I ai campioni e mescolare bene. Utilizzare una soluzione di 25 mg/mL preparata al momento in PBS.
    NOTA: Il trattamento con DNasi I in questa fase aiuta a ottenere la soluzione a cellula singola.
  11. Centrifugare a 754 x g per 5 min a 4 °C.
  12. Utilizzare una pipetta da 10 ml per aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di cDMEM freddo. Centrifugare a 754 x g per 5 min 4 °C.
  13. Risospendere le cellule in FBS cDMEM al 20%. Piastra e incubazione a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità per almeno 3 giorni. Fare attenzione a non spostare/inclinare il piatto. Per 70-100 mg di tessuto, distribuire la sospensione cellulare in 2 piastre da 3,5 cm, in 2 mL di terreno. Ridimensionare di conseguenza, se necessario.
    NOTA: Meno di 50 mg di tessuto risulteranno in una derivazione cellulare inefficiente. Lo schema di suddivisione e congelamento è illustrato nella Figura 1B.
  14. Dopo 3 giorni, controllare la morfologia/vitalità delle cellule e sostituire 2/3 del terreno per mantenere i fattori di crescita prodotti dalle cellule. Ci vorranno circa 7-10 giorni prima che le cellule raggiungano la confluenza, sostituendo il terreno a giorni alterni.
  15. Una volta confluenti, far passare le cellule in un piatto da 10 cm in FBS cDMEM al 20%.
  16. Sostituire il terreno a giorni alterni, utilizzando il 15% di terreno FBS due volte, poi una volta, il 12,5%, quindi il 10%. Per le analisi FACS, l'estrazione di RNA e proteine e il congelamento degli stock seguono lo schema della Figura 1B.
  17. Dividere le celle quando sono confluenti al 100% circa (circa 10 giorni). Lavare 2-3 volte con abbondante PBS per 5 min ciascuna. Aggiungere l'1% di tripsina/EDTA (2x) e riporre nell'incubatore, controllando il distacco delle cellule ogni pochi minuti.

3. Stato di coltura

  1. Passaggio delle celle solo quando confluenti al 100%, non più di 1:3.
  2. Congelare le aliquote corrispondenti al 50% di una piastra confluente di 10 cm in 0,5 mL di terreno di congelamento ghiacciato (10% DMSO in FBS). Scongelare ogni aliquota in un piatto da 10 cm.
    NOTA: Il tempo medio di raddoppio è di 80-90 ore.

4. Analisi FACS

NOTA: Questo protocollo garantisce una caratterizzazione affidabile della popolazione di fibroblasti e identifica la potenziale contaminazione da cellule epiteliali, endoteliali o immunitarie. L'analisi FACS viene eseguita nel passaggio 2, come illustrato nella Figura 2A.

  1. Raccogliere le cellule e risospenderle in tampone FACS (PBS più 2% FBS) ad una concentrazione di10-6 cellule/mL.
  2. Etichettare le provette per citometria a flusso e aggiungere 1 x 105 cellule in un volume di 100 μL in ciascuna di esse. Per la colorazione con 4 anticorpi, preparare 11 provette per tenere conto sia della colorazione che del gating, come segue (Tabella 1)
    NOTA: 1 provetta, senza anticorpi (controllo non colorato), per valutare l'autofluorescenza cellulare, 1 provetta con controllo dell'isotipo anticorpale, per valutare il legame aspecifico, 4 provette, ciascuna con un singolo anticorpo, per la compensazione; le perle di compensazione possono sostituire le cellule, 4 tubi a fluorescenza meno uno (FMO) per il gating, ciascuno dei quali lascia fuori uno degli anticorpi, 1 tubo con tutti e 4 gli anticorpi (campione effettivo). Vengono utilizzati i seguenti anticorpi marcati in fluorescenza (vedi Tabella dei materiali): (1) Anti-EpCAM-PE (marcatore di cellule epiteliali), (2) Anti-CD31-VioBlue (marcatore di cellule endoteliali), (3) Anti-CD45-FITC (marcatore di cellule immunitarie), (4) Anti-CD90-APC (marcatore di cellule di fibroblasti). Possono essere utilizzati anticorpi coniugati ad altri fluorofori, in base ai filtri del citometro a flusso disponibili. Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare.
  3. Incubare le cellule con bloccanti dei recettori cristallizzabili dei frammenti (FcR), come gli anticorpi purificati anti-CD16/CD32 o il tampone bloccante (PBS 1%-2% BSA). Utilizzare 1-5 μL di reagente bloccante FcR per 100 μL di sospensione cellulare e incubare a 4 °C per 10-15 minuti.
  4. Procedere direttamente con la colorazione senza lavare. Aggiungere alle provette le diluizioni degli anticorpi appropriate o i corrispondenti controlli isotipologici, come specificato nella tabella 1.
  5. Mescolare delicatamente e incubare a 4 °C al buio per 30 minuti.
  6. Lavare con 2 mL di tampone FACS.
  7. Centrifugare per 5 min a 300 x g, a 4 °C.
  8. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone FACS fresco.
  9. Aggiungere il colorante vitale (ioduro di propidio) secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
  10. Acquisire i campioni su un citometro a flusso.
  11. Utilizzare i controlli di compensazione a macchia singola per impostare la matrice di compensazione. Per l'analisi dei dati, applicare la seguente strategia di gating sui grafici di densità FACS:
  12. Dispersione diretta e laterale: grafico FSC-A vs. SSC-A e progettare una regione attorno alla popolazione cellulare principale per escludere i detriti cellulari.
  13. Per l'esclusione del doppietto: grafico FSC-A vs. FSC-W (o FSC-H vs. FSC-A) e progettare una regione per escludere gruppi di celle, che mostreranno una maggiore larghezza rispetto all'area (o un'area aumentata rispetto all'altezza). Seleziona le singole celle ed esegui la stessa procedura, tracciando SSC-A vs. SSC-W (o SSC-H vs. SSC-A) per aumentare la purezza della popolazione della singola cellula.
  14. Tracciare il colorante di vitalità (ad esempio, ioduro di propidio) rispetto a SSC-A e selezionare le cellule vive negative.
  15. Su cellule vive, tracciare CD326 (asse x) rispetto a CD31 (asse y); utilizzare i campioni FMO corrispondenti per impostare con precisione i cancelli. L'FMO consente di tenere conto della diffusione della fluorescenza in un canale specifico causata dagli altri fluorofori.
    1. Osservando il campione di FMO CD326, disegnare una porta del quadrante che includa tutte le celle nei quadranti sinistri (cioè negativa per CD326). Ripetere la stessa procedura utilizzando il campione FMO CD31 per regolare il gate in modo da avere tutte le cellule FMO nei quadranti inferiori (cioè negative per CD31). Utilizzare questo quadrante per analizzare i campioni e selezionare le celle nel quadrante inferiore sinistro (CD31- CD326-).
  16. Ripetere la stessa procedura tracciando CD326 (asse x) rispetto a CD45 (asse y), utilizzando il CD326 FMO e il CD45 FMO per impostare il gate del quadrante. Utilizzare questo quadrante per analizzare tutti i campioni e selezionare le celle nel quadrante inferiore sinistro (CD45- CD326-).
  17. Grafico CD90 vs. SSC-A e utilizzare l'FMO CD90 per impostare una regione che escluda le cellule negative e includa solo CD90+. Utilizzare questa regione per analizzare tutti i campioni, misurando la percentuale di cellule CD90+ . I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A.

5. Immortalizzazione dei fibroblasti

NOTA: L'immortalizzazione delle popolazioni di CAF e NF si ottiene mediante trasduzione stabile con un vettore retrovirale che esprime hTERT. Di seguito sono riportati i protocolli per preparare particelle pseudovirali infettive e trasdurre le cellule.

  1. Produzione di particelle retrovirali
    1. Giorno 1, rivestimento in poli-L-lisina e placcatura delle cellule: rivestire una piastra di 10 cm con 6 mL di soluzione di poli-L-lisina (0,1 mg/mL in H2O), incubare per 5 minuti sotto la cappa TC, aspirare e lasciare asciugare la capsula aperta sotto la cappa prima di impiattare 3 x 10celle da 6 HEK293T.
    2. Giorno 2: Aggiungere 30 μL di reagente di trasfezione mediata da lipidi cationici a 0,75 mL di terreno ottimizzato per lipofezione privo di antibiotici.
    3. Parallelamente, aggiungere 2 μg di pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector e 2 μg di plasmidi pBABE-puro-hTERT ad altri 0,75 mL di terreno ottimizzato per lipofezione privo di antibiotici.
    4. Incubare per 5 minuti a RT.
    5. Mescolare le due diluizioni in una provetta conica da 15 mL e incubare per 20 minuti a RT.
    6. Nel frattempo, sostituire il HEK293T terreno con 6 mL di terreno ottimizzato per la lipofezione integrato con il 10% di FBS.
    7. Distribuire delicatamente i complessi di DNA sulla superficie della piastra e incubare per 6 ore a O/N in un incubatore di CO2 umidificato.
    8. Giorno 3: Sostituire il terreno con 7 mL di cDMEM e incubare per 48 ore.
      NOTA: A partire da questa fase, il lavoro deve essere eseguito in una struttura di coltura tissutale di livello 3 (BSL3) di biosicurezza, seguendo le regole istituzionali.
    9. Il giorno 5, raccogliere il terreno contenente il virus e filtrarlo attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
    10. Aliquotare e conservare a -80 °C.
  2. Trasduzione virale
    1. Giorno 1: Piastra di fibroblasti a basso passaggio al 60% di confluenza in 2 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti.
    2. Giorno 2: Sostituire il terreno con 1 mL del preparato retrovirale pBABE-puro-hTERT precedentemente prodotto contenente 8 μg/mL di polibrene e incubare per 12-16 ore.
    3. Giorno 3: Sostituire il terreno contenente il virus con 2 ml di cDMEM.
    4. Giorno 4: Dopo 24 ore, iniziare due cicli di selezione della puromicina (2 μg/mL) da 48 ore.
      NOTA: La concentrazione deve essere determinata empiricamente per ogni lotto di antibiotico e tipo di cellula e la concentrazione più bassa deve essere selezionata per uccidere tutte le cellule entro 4 giorni dalla selezione.
    5. Giorno 8: Verificare che le cellule di controllo non infette siano tutte morte. Sostituire il terreno con cDMEM e lasciare che le cellule infette crescano fino a renderle confluenti prima di farle passare 1:3. Lascia che le cellule raggiungano la confluenza e si dividano di nuovo 1:3. A questo punto, le celle possono uscire dalla struttura BLS3.
      NOTA: Preparare le aliquote congelate il prima possibile. Per garantire che l'immortalizzazione sia avvenuta, passare le cellule 5-6 volte e segnare la loro morfologia e i tassi di duplicazione, che non dovrebbero cambiare con i passaggi. Confrontare funzionalmente le cellule immortalizzate con le loro controparti primarie, utilizzando i metodi descritti di seguito.

6. Caratterizzazione dei fibroblasti

  1. Analizza fenotipicamente le cellule isolate per l'espressione di marcatori CAF/NF e caratterizza funzionalmente le loro potenziali attività pro-oncogeniche sulle cellule tumorali.
    NOTA: Gli oligonucleotidi qPCR e gli anticorpi ottimizzati per valutare i livelli di espressione dei marcatori sia a livello di RNA che di proteina sono riportati rispettivamente nella Tabella 2 e nella Tabella dei materiali. Attenzione che gli anticorpi contro la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) sono spesso aspecifici. Assicurati di includere controlli positivi e negativi appropriati31,32. Diversi metodi possono essere utilizzati per valutare la diafonia tra fibroblasti e cellule tumorali. Qui vengono descritti due approcci alternativi, che consistono nel trattare le cellule tumorali con terreno condizionato (CM) derivato da CAF o NF, o nella co-coltura di fibroblasti e cellule tumorali. Viene descritta l'efficacia di entrambi gli approcci per migliorare la proliferazione delle cellule tumorali.

7. Preparazione e concentrazione del mezzo condizionato

NOTA: Il terreno condizionato viene concentrato e dosato accuratamente dopo la raccolta per facilitare il confronto tra diverse cellule.

  1. Piastra le celle al 70% di confluenza in un piatto di 15 cm in cDMEM.
  2. Il giorno seguente, passare a 15 mL di terreno di digiuno (DMEM senza FBS) e incubare per 48 ore per produrre il CM.
  3. Raccogliere il CM, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm per eliminare i detriti cellulari e sterilizzare.
  4. Trasferire in provette di concentrazione (MWCO 10.000 Da) e centrifugare 20 minuti a 2000 x g e 4 °C, o secondo le istruzioni del produttore, per ottenere circa 1 mL di CM concentrato (conCM), cioè 15 x concentrazione.
  5. Aliquotare il conCM e conservare a -80 °C.
  6. Quantificare il contenuto proteico del conCM raccolto utilizzando un saggio proteico colorimetrico.
    NOTA: La concentrazione media ottenuta è di 0,5 e 2 μg/μL. Concentrazioni inferiori possono ancora essere utilizzate.

8. Saggio di proliferazione

NOTA: La proliferazione cellulare (utilizzando linee cellulari di PCa umano DU145 o LNCaP) è stata valutata utilizzando uno strumento di analisi di cellule vive in due diversi contesti, trattando le cellule tumorali con conCM o co-coltivandole con CAF o NF. In questo caso, devono essere utilizzate cellule tumorali fluorescenti. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3.

  1. Saggio di proliferazione dopo il trattamento con conCM
    NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per le celle DU145; Celle diverse potrebbero richiedere aggiustamenti.
    1. Piastra delle cellule tumorali in cDMEM in una piastra a 96 pozzetti (750 cellule/pozzetto), considerando almeno 3 repliche per condizione, e incubazione di O/N.
    2. Sostituire cDMEM con un terreno di assenza, integrato o meno, con 50 μg/mL di conCM.
    3. Trasferire la piastra nella camera dello strumento per l'analisi delle cellule vive all'interno dell'incubatore.
    4. Lasciare scaldare a 37 °C per 30 minuti, quindi iniziare la prima scansione.
    5. Utilizzare il canale di contrasto di fase, scegliendo un obiettivo appropriato e il numero di campi/pozzetto desiderati (si consigliano 10x obiettivo e 5 campi/pozzetto) e il tipo di scansione standard. Scansione ogni 6 ore per 4-5 giorni (la durata deve essere determinata empiricamente per condizioni e tipi di cellule).
    6. Eseguire l'analisi secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    7. Calcola per ogni pozzo (repliche tecniche per ogni condizione) la variazione di piega rispetto al suo valore al tempo zero. Generare i grafici corrispondenti e valutare la significatività statistica utilizzando un software appropriato.
  2. Saggio di proliferazione in co-coltura
    1. Co-piastra 750 cellule DU145 che esprimono RFP e CAF o NF con un rapporto 1:3 in cDMEM in una piastra a 96 pozzetti.
    2. Il giorno successivo, passa a FBS DMEM al 2%. Trasferire la piastra nella camera dello strumento di analisi delle cellule vive nell'incubatore e avviare la scansione standard ogni 6 ore per 4 giorni, utilizzando sia il contrasto di fase che il canale arancione.
    3. Eseguire l'analisi della proliferazione secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    4. Calcola per ogni pozzo (repliche tecniche per ogni condizione) la variazione di piega rispetto al suo valore al tempo zero. Generare i grafici corrispondenti e valutare la significatività statistica utilizzando un software appropriato.

9. Saggio di migrazione per la guarigione delle ferite

NOTA: Qui viene presentata una versione automatizzata del classico saggio scratch33 per misurare la migrazione cellulare, utilizzando uno strumento di analisi di cellule vive.

  1. Piastra delle cellule tumorali in una piastra a 96 pozzetti adatta allo strumento di analisi delle cellule vive per ottenere un monostrato confluente.
  2. Il giorno seguente, trattare le cellule con 10 ug/mL di mitomicina C per 2 ore.
    NOTA: Questo passaggio è essenziale per evitare la proliferazione cellulare durante il test, che confonderebbe i risultati.
  3. Applicare il graffio sui pozzetti seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
  4. Lavare con 100 μl di PBS per rimuovere le cellule staccate.
  5. Aggiungere un terreno di assenza, con 50 mg/mL o senza (controllo).
  6. Posizionare la piastra nella camera di analisi delle cellule vive dell'incubatore.
  7. Dopo 30 minuti, programmare il protocollo di scansione raccomandato per la guarigione delle ferite, ogni 4 ore per 1 giorno o più, a seconda delle cellule e delle condizioni.
  8. Analizzare i risultati secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).

10. Crescita indipendente dall'ancoraggio mediante saggio di agar morbido

  1. Piastre CAF o NF al 70% di confluenza in piastre a 12 pozzetti, lasciando tre pozzetti vuoti come controllo.
  2. Il giorno seguente, preparare una soluzione madre di agar morbido 4x (3,6%) aggiungendo 0,45 g di agar a basso punto di fusione a 12,5 mL di PBS in una provetta conica da 50 mL in condizioni sterili.
  3. Sciogliere in forno a microonde. Attenzione all'eccessiva ebollizione che provocherebbe la concentrazione della soluzione.
  4. Raffreddare a 37 °C, quindi preparare una soluzione di lavoro 1x diluendo 1:4 con cDMEM preriscaldato.
  5. Aspirare il terreno dalla piastra a 12 pozzetti e aggiungere 500 μl di soluzione di agar 1x a ciascun pozzetto.
  6. Lasciare solidificare per 20 minuti a 4 °C, conservando il resto della soluzione di agar a 37 °C.
  7. Nel frattempo, tripsinizzare le cellule tumorali e preparare una sospensione cellulare di 2 x 104 cellule/mL.
  8. Miscelare volumi uguali della sospensione cellulare e della soluzione di agar 1x pipettando più volte e dosare 500 μl (cioè 5000 cellule) sopra il primo strato di agar in ciascun pozzetto. Assicurati di preparare almeno il 10% in eccesso di sospensione cellulare.
  9. Lasciare solidificare l'agar in incubazione per 20 minuti a 4 °C.
  10. Aggiungere 1 mL di cDMEM a ciascun pozzetto e rinnovarlo a giorni alterni aspirando delicatamente il terreno dal bordo del pozzetto e aggiungendo il terreno fresco al centro, quasi goccia a goccia per evitare di spostare lo strato morbido di agar.
  11. Incubare fino a quando compaiono colonie facilmente visibili. Le cellule DU145 di solito impiegano circa 12 giorni, con lievi variazioni.
  12. Eliminare il terreno e colorare le colonie aggiungendo 200 μL di soluzione di cloruro di nitroblue tetrazolio (1 mg/mL in PBS). Incubare per una notte a 37 °C in un incubatore umidificato.
  13. Una volta che le colonie sono state colorate, scartare la soluzione colorante e acquisire le immagini utilizzando uno stereomicroscopio. Posizionare la piastra sul tavolino del microscopio e impostare l'ingrandimento al valore più basso (0,8x) per garantire che l'intero pozzetto sia visibile. Utilizzare la manopola di messa a fuoco grossolana per mettere a fuoco le colonie, quindi regolare le impostazioni di illuminazione e modalità prima di acquisire le immagini.
  14. Utilizzare il software appropriato34 per quantificare il numero di colonie e l'area occupata seguendo i passaggi forniti nel File supplementare 1.
  15. Segna il numero e la distribuzione delle dimensioni delle colonie (vedi Figura 4).

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Risultati

Con questo protocollo sono state isolate con successo coppie CAF e NF di 7 pazienti con PCa di alto grado. L'età dei pazienti all'intervento chirurgico e i punteggi di Gleason sono riassunti nella Tabella 3. Per valutare la purezza delle popolazioni di fibroblasti derivate, i CAF e i NF primari sono stati staccati e colorati con gli anticorpi fluorescenti indicati o con ioduro di propidio per valutare l'apoptosi. I risultati rappresentativi della successiva analisi FACS ...

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Discussione

La derivazione e l'analisi di cellule da tessuto PCa forniscono un modello sperimentale rilevante, in particolare considerando che i modelli animali disponibili non replicano completamente l'anatomia della prostata umana e la progressione della malattia37. Le ghiandole prostatiche degli scimpanzé sono anatomicamente simili a quelle degli esseri umani, ma mostrano una progressione lenta e stocastica della malattia, oltre a implicare limitazioni etiche. I cani diffe...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), IG16930 e IG24851 a V.P; il Ministero dell'Università e della Ricerca (MIUR PRIN 2017 e 2022 a V.P.); la Fondazione Truus e Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, donazione a V.P.; Regione Piemonte (deviare). A.S. è stata supportata da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (FIRC) e L.A. è stata supportata dalla Fondazione Umberto Veronesi. Figura 2 è stato creato con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra a 12 pozzettiSarstedt833921
Piastra a 24 pozzettiSarstedt833922
Piastra a 6 pozzettiSarstedt833920
Piastra a 96 pozzettiSarstedt833924
MAb di topo anti-GAPDH (6C5)Sigma AldrichCB1001Fonte: Topo; Diluizione per WB: 1:1000
aSMASigma AldrichA5228 Fonte: Topo; Diluizione per WB: 1:3000
CaveolinaTecnologia di segnalazione cellulareCST3267Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980Citometria a flusso Ab, marcatore cellulare endoteliale
CD326-PE (EpCAM)Milteny Biotec130113-826Citometria a flusso Ab, marcatore cellulare epiteliale
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769Citometria a flusso Ab, marcatore leucocitario Pan
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903Citometria a flusso Ab, marcatore di fibroblasti
Collagene VI (COL6A1)Abcamab182744Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:1000
Provetta conica 15 mLSarstedt62554502
Provetta conica 50 mLSarstedt62547254
Microprovette Cryopure 2 mLSarstedt72380992
Piastra di coltura diametro 100 mm Corning353003
Piastra di coltura diametro 100 mm Corning353025
Piastra di coltura diametro 60 mm Corning353002
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma AldirchD8418Utilizzo in una cappa biologica
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)Gibco11965092Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
FAPAbcamAB53066Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:500
Reagente bloccante FcR, umanoMilteny Biotec130-059-901Bloccante Fc
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16000044Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Puntali filtrati 10 & micro; LSarstedt703010255
Puntali filtrati 100 & micro; LSarstedt703030255
Puntali filtrati 1000 & micro; LSarstedt703060255
Puntali filtrati 20 &; micro; LSarstedt703030265
Puntali filtrati 200 & micro; LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Pinza2Biol1102412
Visualizzazione del materiale FSP1/S100A4Tecnologia di segnalazione cellulareD9F9D (13018)Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:2000
IL6Tecnologia abclonaleCodice A0286Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:1000
ImmagineJIstituto Nazionale di SanitàVersione 1.53cSoftware per l'analisi delle immagini
piastra per incuciti imagelock a 96 pozzettiSartoriousBA-04857
Incucita® SX5SartoriousSX5Strumento per analisi di cellule vive 
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientifico11668019reagente di trasfezione mediata da lipidi cationici
MACS® Soluzione di stoccaggio dei tessutiMilteny Biotec130-100-008
Lettore di micropiastre (assorbanza 600 nm)PromegaGM3500
Microprovette 1,5 mLSarstedt7269001
NcadAbcamab18203Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:1000
Nitro Blu Tetrazolio Sigma Aldirchn5514
Parafilm Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene1771Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
pCL-AmphoNovus Biologico NBP2-29541Conservare a -20 ° C, utilizzo in una cappa biologica
Sensore PDGFRBSanta CruzSC-432Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:1000
Penicillina-streptomicina (PS, 10.000 μ g/mL) Gibco15140122Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Microscopio a contrasto di fase Olimpo BX42
Soluzione salina tamponata con fosfato  (PBS)CasereccioNaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1,8 mM. Autoclave e stoccaggio presso RT
Soluzione di poli-L-lisinaSigma AldirchP8920Conservare a 4 gradi C, utilizzo in una cappa biologica
Puromicina dicloridratoSigma AldirchP8833
Secura Semi Micro BalanceSartoriusSECURA125-1S
Pipetta sierologica 10 mLSarstedt861254001
Pipetta sierologica 2 mLSarstedt861252001
Pipetta sierologica 25 mLSarstedt861256001
Pipetta sierologica 5 mLSarstedt861253001
STAT3CST9139Fonte: Topo; Diluizione per WB: 1:1000
STAT3 Y705CST9131Fonte: Coniglio; Diluizione per WB: 1:1000
StereomicroscopioLeicaMZ125
Siringa 10 mLPentaferteCodice 00202260D12
TermoMixerEppendorph22331
Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenoloGibco15400054
VigoreSanta CruzSC-6260Fonte: Topo; Diluizione per WB: 1:2000
Concentratore centrifugo Vivaspin 20Sigma AldirchZ614602MWCO 10.000 giorni
Forbici Wagner2Biol14070-12

Riferimenti

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

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