Method Article

Sequenziamento degli ampliconi con le tecnologie di sequenziamento a lettura lunga

DOI:

10.3791/68370

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August 29th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento profondo mirato di 18 regioni di resistenza ai farmaci in Mycobacterium tuberculosis utilizzando una piattaforma di sequenziamento a lettura lunga, seguita dall'analisi con una pipeline bioinformatica specifica per la tubercolosi progettata per dati a lettura lunga.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) continua a sottolineare l'urgente necessità di un metodo diagnostico rapido, economico e di facile utilizzo per la tubercolosi (TB) e la tubercolosi resistente ai farmaci (DR-TB). Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), approvate dall'OMS, hanno migliorato significativamente il rilevamento della DR-TB. Tra questi, l'NGS mirato (tNGS) consente il rilevamento mirato delle mutazioni genetiche associate alla resistenza ai farmaci, eliminando la necessità di una diagnostica tradizionale basata sulle colture. Un test tNGS ampiamente utilizzato fornisce test di suscettibilità ai farmaci rapidi e completi, ma è stato ottimizzato principalmente per piattaforme di sequenziamento con elevata precisione. Tuttavia, l'alto costo di questi sistemi di sequenziamento ha limitato l'accessibilità nei paesi a basso e medio reddito, in particolare in tutta l'Africa. Le tecnologie di sequenziamento portatili rappresentano un'alternativa promettente, in quanto offrono flessibilità e requisiti infrastrutturali ridotti. In questo studio, il DNA è stato estratto da isolati di tubercolosi resistenti alla rifampicina (RR-TB), amplificato utilizzando un test tNGS e sequenziato su una piattaforma di sequenziamento portatile. Gli stessi prodotti di amplificazione sono stati anche sequenziati su una piattaforma di sequenziamento a lettura breve ad alta precisione per fungere da riferimento. I dati del sequenziatore portatile sono stati elaborati utilizzando una pipeline bioinformatica progettata per il sequenziamento a lettura lunga, mentre i dati di sequenziamento a lettura breve sono stati analizzati utilizzando un'applicazione basata sul web. L'analisi ha mostrato che l'approccio del sequenziamento a lettura lunga ha identificato con successo le varianti associate alla resistenza ad alta frequenza rilevate dal sequenziamento a lettura breve, ma ha mostrato limitazioni nel rilevare le varianti a bassa frequenza.

Introduction

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La tubercolosi (TBC) continua a essere una delle principali cause di mortalità a livello globale e rappresenta una sfida continua per la salute pubblica, soprattutto nei paesi a basso e medio reddito 1,2. Nonostante le iniziative volte a migliorare le misure di controllo della tubercolosi, i progressi sono stati lenti, in parte a causa delle difficoltà nel raggiungere tecniche diagnostiche rapide, accurate, economiche e complete 3,4,5. Mentre i metodi diagnostici molecolari come i saggi a sonda lineare (LPA) e i test automatizzati di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) hanno accelerato l'identificazione della tubercolosi e della tubercolosi resistente ai farmaci (DR-TB), il loro rilevamento limitato delle mutazioni limita i test di suscettibilità ai farmaci (DST). Questa limitazione è particolarmente significativa nei paesi ad alto carico di tubercolosi 6,7,8,9.

Per affrontare queste limitazioni, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha raccomandato l'uso di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), che si sono rivelate potenti strumenti per la sorveglianza della tubercolosi e il rilevamento della resistenza10,11. Sia l'approccio di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) che quello mirato NGS (tNGS) offrono una copertura mutazionale più ampia, consentendo l'identificazione di varianti associate alla resistenza in più farmaci 8,12,13,14,15. Sebbene il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) fornisca un rapporto DST completo, la sua dipendenza dalla coltura lo rende inadatto per la diagnostica rapida, poiché la coltura può richiedere fino a sei settimane 15,16,17. L'NGS mirato offre un'alternativa migliore poiché non dipende dalla cultura; Il sequenziamento può essere eseguito direttamente da campioni clinici18. Di conseguenza, l'OMS ha raccomandato l'uso di tre test tNGS per la DST: Deeplex Myc-TB assay: questo test rileva la resistenza a rifampicina, isoniazide, fluorochinoloni, aminoglicosidi (amikacina, kanamicina, capreomicina), etambutolo, pirazinamide ed etionamide 19,20,21. Test per la tubercolosi sentinella: mira alla resistenza alla rifampicina, all'isoniazide, ai fluorochinoloni e ai farmaci iniettabili di seconda linea18,20. Dosaggio AQ-TB: identifica la resistenza alla rifampicina, all'isoniazide, ai fluorochinoloni e ai farmaci iniettabili di seconda linea. Questi saggi sono stati ottimizzati per l'uso sulla piattaforma a lettura breve grazie alla sua elevata precisione20. Le piattaforme a lettura lunga ONT MinION, d'altra parte, forniscono dati in tempo reale, portabilità e il potenziale per un'implementazione conveniente 22,23. Tuttavia, l'uso diffuso di NGS è limitato dalle esigenze di infrastruttura e costi, in particolare con i sistemi a lettura breve10.

Il test Deeplex è il più completo dei tre test raccomandati. Il test è stato originariamente progettato per eseguire PCR multiplex su 18 regioni associate alla resistenza a 13 farmaci anti-TB. Tuttavia, l'OMS lo ha raccomandato per 10 farmaci anti-TB, indicando una sensibilità e una specificità sufficienti. Questo studio lo ha ottimizzato per l'uso con ONT MK1B MinION, una piattaforma di sequenziamento a lettura lunga. Il sistema di celle a flusso portatile e riutilizzabile di questa piattaforma riduce sia l'infrastruttura che i costi potenzialmente di sequenziamento per campione 4,22,23. Sebbene siano stati sviluppati altri saggi compatibili con la lettura lunga, tendono ad avere un ambito DST limitato, in genere mirato solo a una gamma ristretta di geni di resistenza. Al contrario, il test offre un'ampia copertura del bersaglio, rendendolo uno strumento diagnostico più completo per l'ora legale decentralizzata24,25. Nella Tabella 1 viene fornito un elenco dettagliato dei bersagli genomici amplificati dal test e delle corrispondenti associazioni farmacologiche, che evidenzia le capacità diagnostiche del test25.

Prima dell'estrazione del DNA, i campioni devono essere decontaminati e inattivati in condizioni di biosicurezza di livello 3 (BSL-3), seguendo le necessarie precauzioni di sicurezza 25,26,27. L'amplificazione interna e i controlli esterni dovrebbero essere incorporati in ogni corsa, con la contaminazione monitorata attraverso controlli negativi e valutazioni di laboratorio di routine25. Importanti metriche di qualità, tra cui la profondità di lettura, l'ampiezza della copertura e il successo dell'amplificazione, devono essere valutate dopo il sequenziamento. Per il sequenziamento mirato, l'OMS consiglia una profondità di lettura minima di 100x per ciascun amplicone e un'adeguata copertura di tutte le regioni di resistenza ai farmaci mirate per consentire il rilevamento di varianti minori presenti al ≥5%28. L'Organizzazione Mondiale della Sanità approva questi metodi di sequenziamento mirato per identificare la resistenza ai farmaci di prima e seconda linea, supponendo che siano istituiti sistemi di garanzia della qualità e che tutte le regioni target siano sufficientemente coperte28.

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Protocol

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Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del progetto TS ELiOT, che ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato etico per la ricerca umana (HREC) dell'Università di Stellenbosch (N21/09/093) il 20 ottobre 2021. Inoltre, ha ottenuto l'autorizzazione dalla Western Cape Health Research per l'uso di strutture governative. I campioni sono stati raccolti attraverso uno sforzo di collaborazione con l'NHLS Green Point e l'Università di Stellenbosch, con il numero di approvazione SU HREC N09/11/296. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del campione

  1. Inattivazione del calore
    1. Incubare le colture MGIT a 80 °C per 1 ora per ottenere la completa inattivazione del calore in condizioni BSL-3.
    2. Procedere con l'estrazione del DNA utilizzando il metodo InstaGene29.
  2. Estrazione del DNA
    1. Inserire 5 mL di coltura MGIT inattivata termicamente in una provetta da 15 mL.
    2. Centrifugare a 4000 x g per 30 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Rimuovere con cautela il surnatante mediante pipettaggio, lasciando il sedimento.
    4. Aggiungere 200 μl di reagente per l'estrazione del DNA basato sulla chelazione al sedimento e incubare a 56 °C per 15 minuti.
    5. Trasferire la soluzione in una provetta da 2 mL con tappo a vite e aggiungere a ciascuna tre perle di vetro da 2 mm di diametro.
    6. Agitare per 10 s per diffondere le cellule e posizionare le provette in un incubatore a bagno secco a 100 °C per 8 minuti.
    7. Omogeneizzare i campioni utilizzando l'omogeneizzatore a microsfere con le seguenti impostazioni: 3 cicli di 20 s a 4,0 m/s.
    8. Centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a RT e trasferire con cura 130 μl di surnatante (liquido contenente DNA) in una provetta da 1,5 mL, evitando sedimenti e detriti.
    9. Risospendere le perle mediante movimento rapido o vortice e aggiungere 156 μL di perle alla provetta da 1,5 mL contenente il DNA estratto.
    10. Pipettare lentamente su e giù 10 volte per miscelare e incubare a RT per 5 minuti.
    11. Posizionare le provette su una griglia magnetica per 5 minuti per separare le perle legate al DNA.
      NOTA: Un surnatante trasparente dovrebbe apparire sopra una pallina compatta di perline magnetiche scure sul lato del tubo rivolto verso il magnete, indicando la disponibilità per la rimozione del surnatante.
    12. Pipettare il surnatante senza disturbare le perline.
    13. Aggiungere 100 μl di etanolo all'80% appena preparato al pellet di perline mentre si trova sulla griglia e lasciare agire per 30 s, quindi rimuovere l'etanolo. Ripetere la fase di lavaggio.
    14. Asciugare all'aria il pellet di perline a RT per 5 minuti. Assicurarsi che il pellet di perline appaia opaco e che non rimanga liquido visibile prima di procedere al passaggio successivo.
    15. Rimuovere la provetta dalla rastrelliera magnetica.
    16. Aggiungere 25 μl di acqua priva di nucleasi (NFW) direttamente alle perle essiccate e risospendere pipettando delicatamente su e giù 10 volte.
    17. Incubare a RT per 5 min.
    18. Rimettere la provetta nella rastrelliera magnetica per altri 5 minuti.
    19. Trasferire con cura il DNA eluito (surnatante) in una nuova provetta da 1,5 mL.
    20. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando il reagente di quantificazione dsDNA basato sulla fluorescenza ad alta sensibilità.
      NOTA: Il DNA può essere conservato in un congelatore a -20 °C o procedere con la PCR.
  3. Amplificazione (PCR)
    1. Multiplex PCR e pulizia post-PCR, seguendo le istruzioni del produttore25.
    2. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando il reagente di quantificazione dsDNA basato sulla fluorescenza ad alta sensibilità.
  4. Elettroforesi
    1. Preparare un gel di agarosio al 2% sciogliendo la polvere di agarosio in 1 tampone TAE attraverso il riscaldamento a microonde fino a completo scioglimento.
    2. Aggiungere 5 μl di colorante di gel di DNA fluorescente non tossico all'agarosio fuso e mescolare accuratamente.
    3. Versare la miscela di gel in una vaschetta di colata di gel dotata di pettine per formare dei pozzetti.
    4. Lasciare solidificare il gel a RT.
    5. Una volta solidificato, rimuovere il pettine e posizionare il vassoio del gel nella vasca per elettroforesi riempita con 1x tampone TAE.
    6. Caricare 5 μL di una scala di DNA kb mescolata con 5 μL di tampone di carico nel primo pozzetto.
    7. Per ogni prodotto della PCR, miscelare 5 μl di prodotto con 5 μl di tampone di caricamento e caricare nei singoli pozzetti.
    8. Far funzionare il gel a 100 V per 1 ora.
    9. Visualizzazione delle bande di DNA utilizzando il sistema di documentazione su gel con transilluminazione.

2. Preparazione della libreria ONT

  1. Preparazione finale
    1. Calcolare 100 ng di ciascun campione di ampliconi in base alla concentrazione e trasferire il volume richiesto in una provetta PCR pulita.
    2. Per calcolare la massa totale (in ng) degli ampliconi in un dato campione, moltiplicare la concentrazione del campione (ng/μL) per il suo volume rimanente (μL) dopo il controllo di qualità (QC).
      NOTA: Ad esempio, se un campione ha una concentrazione di 2 ng/μL e un volume residuo di 1 μL dopo il QC, la massa totale dell'amplicone è:
      Massa totale = 2 ng/μl × 1 μl = 45 ng
      Per preparare 10 ng di ampliconi per il sequenziamento, utilizzare la formula di diluizione:
      C1V1 = C2V2
      Dove: C1 = 45 ng, V1 = sconosciuto, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Pertanto, il μL del campione iniziale di amplicone dovrebbe essere utilizzato per ottenere 10 ng di DNA per il sequenziamento.
    3. Regolare il volume totale di ciascun campione a 12,5 μl utilizzando NFW.
    4. Miscelare delicatamente i campioni pipettandoli su e giù 10 volte e centrifugarli brevemente.
    5. Aggiungere 1,75 μl di tampone di reazione per la riparazione finale e la coda A e 0,75 μl di miscela di enzimi per la riparazione e la coda A a ciascun campione.
    6. Miscelare accuratamente pipettando su e giù 10 volte e centrifugare brevemente.
    7. Incubare le provette in un termociclatore a 25 °C per 30 minuti, quindi a 65 °C per 30 minuti.
      NOTA: In questa fase, nel caso in cui l'utente decida di interrompere il processo, è consigliabile utilizzare le perle per la purificazione del DNA preparato all'estremità. Il DNA purificato può quindi essere conservato a 4 °C per una durata massima di sette giorni.
  2. Legatura nativa del codice a barre
    1. Scongelare e preparare le microsfere magnetiche per la purificazione del DNA e la selezione delle dimensioni, le perle paramagnetiche per la pulizia del DNA, l'EDTA e i codici a barre nativi (NB01-96) secondo le istruzioni del produttore, quindi posizionarle sul ghiaccio.
    2. Nelle nuove provette per PCR, aggiungere in sequenza: 2,75 μL di acqua priva di nucleasi, 1 μL di DNA preparato all'estremità, 1,25 μL di codici a barre nativi (NB01-96) e 5 μL di miscela di enzimi di legatura del DNA.
    3. Miscelare ogni reazione pipettando delicatamente 10 volte, centrifugare brevemente con una microcentrifuga e incubare per 20 minuti a RT.
    4. Aggiungere 1 μl di EDTA in ciascun pozzetto, mescolare accuratamente pipettando e centrifugare brevemente.
    5. Raggruppare i campioni con codice a barre in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
    6. Risospendere le microsfere di purificazione del DNA mediante vortice e aggiungere 0,7 volte il volume totale del campione aggregato (ad esempio, per 23 campioni con un volume totale di 253 μl, aggiungere 177,1 μl di perline).
    7. Mescolare la soluzione mediante pipettaggio e incubare su un HulaMixer per 10 minuti a RT.
    8. Preparare 2 ml di etanolo all'80% mescolando 1600 μl di etanolo puro con 400 μl di NFW.
    9. Posizionare la provetta su una griglia magnetica per 5 minuti fino a quando l'eluato non sarà limpido e incolore.
    10. Rimuovere ed eliminare il surnatante senza disturbare il pellet.
    11. Lavare le perle con 700 μl di etanolo all'80% appena preparato senza disturbare il pellet, quindi rimuovere e scartare l'etanolo.
    12. Ripetere la fase di lavaggio con etanolo.
    13. Centrifugare brevemente la provetta, rimetterla nella rastrelliera magnetica e rimuovere l'etanolo residuo.
    14. Lasciare asciugare le perline all'aria per 30 s.
    15. Rimuovere la provetta dal rack magnetico, risospendere le perle in 35 μL di acqua priva di nucleasi con un leggero movimento e incubare a 37 °C per 10 minuti.
    16. Rimettere la provetta nella rastrelliera magnetica fino a quando l'eluato non è limpido e incolore.
    17. Trasferire 35 μl di eluato in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL per le fasi successive.
      NOTA: In questa fase, la libreria può essere conservata a 4 °C durante la notte.
  3. Legatura e pulizia dell'adattatore
    1. Preparare il kit di reagenti per la legatura rapida del DNA secondo le istruzioni del produttore e metterlo sul ghiaccio.
    2. Miscelare l'adattatore nativo (NA) e la ligasi rapida mediante pipettaggio, quindi porre sul ghiaccio.
    3. Scongelare il tampone di eluizione (EB) a RT, vortice, centrifuga e posizionarlo sul ghiaccio.
    4. Scongelare il tampone a frammenti corti (SFB) a RT, vortice, centrifuga e posizionare sul ghiaccio.
    5. In una provetta da microcentrifuga a basso legame da 1,5 mL, miscelare quanto segue: 30 μL di campione aggregato con codice a barre, 5 μL di Native Adapter (NA), 10 μL di tampone di reazione di legatura rapida e 5 μL di DNA ligasi T4 ad azione rapida.
    6. Pipettare delicatamente per mescolare, centrifugare brevemente e incubare per 20 minuti a RT.
    7. Risospendere le perle di pulizia del DNA mediante vortice e aggiungere 20 μl (0,4x) di perline alla reazione.
    8. Mescolare delicatamente pipettando e incubare su un HulaMixer per 10 minuti a RT.
    9. Pellettare le perle su una rastrelliera magnetica e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
    10. Lavare le perle aggiungendo 125 μl di tampone a frammenti corti (SFB), risospendere sbattendo, centrifugare brevemente e rimetterle nel rack magnetico.
    11. Pellettare le perle e aspirare il surnatante; Ripetere una volta la fase di lavaggio.
    12. Centrifugare brevemente, rimettere la provetta nel rack magnetico e aspirare l'eventuale surnatante residuo.
    13. Rimuovere la provetta dal rack magnetico e risospendere le perle in 15 μL di tampone di eluizione (EB).
    14. Centrifugare brevemente e incubare a 37 °C per 10 minuti per eluire il DNA.
    15. Posizionare la provetta sulla rastrelliera magnetica, pellettare le perle fino a quando l'eluato è limpido e incolore e aspirare 15 μl di eluato in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL.
    16. Quantificare 1 μl di eluato.
    17. Diluire la libreria a 20 fmol (calcolare utilizzando il calcolatore NEB) e utilizzare 12 μl della libreria preparata da 20 fmol per il sequenziamento sulla cella a flusso R10.4.1.
      NOTA: La libreria può ora essere conservata a -20 °C, consentendo un uso ripetuto.
  4. Adescamento e caricamento della cella a flusso di sequenziamento dei nanopori
    1. Scongelare il tampone di sequenziamento (SB), le perle di libreria (LIB), il cavo della cella di flusso (FCT) e il lavaggio della cella di flusso (FCF) a RT, mescolarli mediante vortice e farli girare.
    2. Preparare la miscela di priming con cella a flusso combinando 5 μl di albumina sierica bovina (BSA, 50 mg/mL), 30 μl di Flow Cell Tether (FCT) e 1170 μl di Flow Cell Flush (FCF), mescolando la soluzione mediante inversione e pipettaggio.
    3. Aprire la porta di adescamento della cella di flusso, aspirare ~20 μL di tampone per rimuovere le bolle d'aria, caricare 800 μL della miscela di adescamento nella porta di adescamento senza introdurre bolle d'aria e attendere 5 minuti.
    4. Preparare la libreria mescolando 37,5 μl di tampone di sequenziamento (SB), 25,5 μl di librerie (LIB) o librerie (LIS) e 12 μl di 20 fmol di DNA in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, mescolando accuratamente mediante pipettaggio.
    5. Adescare nuovamente la cella di flusso sollevando delicatamente il tappo della porta del campione della cella di flusso, caricando 200 μl della miscela di adescamento nella porta di adescamento senza introdurre bolle d'aria e preparando la libreria per il caricamento.
    6. Miscelare delicatamente la libreria preparata mediante pipettaggio e caricare 75 μl della libreria nella porta del campione della cella a flusso di sequenziamento in senso gocciolato, assicurandosi che ogni goccia fluisca nella porta prima di aggiungere la successiva.
    7. Chiudere il tappo della porta del campione della cella di flusso, assicurandosi che il tappo entri nella porta del campione della cella di flusso, quindi chiudere la porta di adescamento.
    8. Collegare il dispositivo di sequenziamento portatile a un computer (con un'alimentazione ininterrotta) e avviare il sequenziamento utilizzando un software di controllo e analisi del dispositivo di sequenziamento.
  5. Parametri del software
    NOTA: Questa applicazione software, sviluppata da ONT, viene utilizzata per la gestione completa delle esecuzioni di sequenziamento e la generazione di report dettagliati.
    1. Per avviare il processo di sequenziamento, selezionare l'opzione Avvia seguita da Avvia sequenziamento.
      NOTA: Verrà quindi richiesto di designare una cartella per l'archiviazione dei file e di fornire un nome per l'esecuzione della sequenza, ad esempio "sequencing_run_1". Successivamente, fai clic su Continua con le impostazioni per selezionare il nome del kit appropriato, ad esempio library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, e personalizzare il tempo di esecuzione desiderato, ad esempio 20 ore (il tempo di esecuzione massimo è 72 ore).
    2. Quindi, scegli il tipo di file di output, selezionando tra opzioni come POD5 per le letture di output non elaborate e FASTQ per gli output basecalled. Successivamente, selezionare il modello FAST-Basecalling.
    3. Si prega di notare che alcune delle impostazioni predefinite includono la scansione frequente dei pori ogni 1,5 ore, una lunghezza di lettura minima di 200 bp e un punteggio di qualità minimo di 8. Infine, rivedi le impostazioni e inizia il processo di lettura.

3. Analisi post-sequenziamento

  1. Requisiti di sistema
    NOTA: Guida per la configurazione dell'ambiente e l'analisi dei dati di sequenziamento dell'amplicone di Mycobacterium tuberculosis utilizzando la pipeline ONT-TB-NF. Le istruzioni si rivolgono sia agli utenti Windows (tramite WSL) che a macOS.
    1. Utilizzare quanto segue: - Sistema operativo: Windows 10/11 (con WSL2) o macOS; Memoria: Minimo 8 GB di RAM (consigliati 16 GB); Archiviazione: almeno 50 GB di spazio libero su disco; Internet: Necessario per scaricare pacchetti e dati; Autorizzazioni: Possibilità di installare software e gestire gli ambienti.
  2. Assicurarsi della configurazione dell'ambiente seguente: Utenti Windows (tramite WSL2). Abilitare WSL2.
    1. Aprire PowerShell come amministratore ed eseguire: wsl - install.
    2. Riavvia il computer quando richiesto.
  3. Installa Ubuntu
    1. Dopo il riavvio, avvia Microsoft Store, cerca Ubuntu e installa la versione preferita (ad esempio, Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Avvia Ubuntu dal menu Start .
    3. Creare un nuovo nome utente e password UNIX quando richiesto.
    4. Elenchi di pacchetti di aggiornamento: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. Utenti macOS
    1. Installa Homebrew (se non è già installato): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Installa i pacchetti richiesti: brew install git wget
  5. Installazione di Conda o Mamba
    1. Visita la pagina di download di Miniconda per scaricare il programma di installazione corretto per il sistema operativo.
    2. Per installare Miniconda, esegui il programma di installazione e segui le istruzioni sullo schermo. Al termine dell'installazione, riavviare il terminale.
    3. Configurazione dei canali Conda:
      conda config --add canali predefiniti
      conda config --add canali bioconda
      conda config --add canali conda-forge
    4. Installazione di Mambaforge (Mamba)
      Per Linux:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Per macOS:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Installa Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
    6. Segui le istruzioni per completare l'installazione e riavvia il terminale per attivare Mamba.
  6. Configurazione della pipeline ONT-TB-NF
    1. Crea un nuovo ambiente Conda: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. In alternativa, usa Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Attiva l'ambiente: conda attiva ont_tb_env
    4. Installa Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. Clonare il repository ONT-TB-NF: GIT CLONE https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Estrarre le immagini Docker necessarie (se si usa Docker)
      Tirare Docker HKUBAL / Clair3: V0.1-R12
      docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. Esecuzione della pipeline
    1. Concatenare i file Basecalled FASTQ di ciascun campione in modo indipendente utilizzando il comando seguente.
      gatto *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /percorso/di/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /percorso/del/amplicon_regions.letto \
      discussioni 16 \
      output_dir /absolute/path/to/output_directory
  8. File di output e interpretazione
    1. Al termine dell'esecuzione, assicurarsi che la pipeline generi gli output seguenti nella directory di output specificata:
      1. Allineato Legge: file *.bam.
      2. Varianti Call: *.vcf file contenenti SNP e indel.
      3. Rapporti riepilogativi: file *.csv o *.tsv che riassumono le mutazioni di resistenza ai farmaci e altre metriche rilevanti.
      4. Rapporti di controllo qualità: file *.htmL generati da strumenti come MultiQC.
      5. Log: log dettagliati dell'esecuzione della pipeline.
      6. File intermedi: memorizzati nella directory work/ (possono essere eliminati dopo l'esecuzione riuscita).
        NOTA: Nel caso in cui si riscontrino errori di autorizzazione, è essenziale verificare di possedere le autorizzazioni necessarie per leggere e scrivere file, nonché per eseguire script. Per quanto riguarda le questioni ambientali, assicurarsi che l'ambiente Conda appropriato sia attivato prima di eseguire la condotta. Per coloro che utilizzano i profili Docker, è imperativo confermare che Docker sia installato e operativo. Inoltre, è necessario monitorare meticolosamente le risorse di sistema per evitare limitazioni di memoria o archiviazione durante l'esecuzione. Una panoramica di queste metodologie è presentata nella Figura 1.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo di estrazione del DNA selezionato è stato scelto per la sua efficienza e resa superiore rispetto ad altre tecniche rapide. Ha prodotto costantemente DNA genomico (gDNA) di alta qualità e l'integrazione di una fase di pulizia basata su microsfere ha contribuito a ridurre al minimo i tempi di elaborazione riducendo al contempo i costi per campione. Ciò è stato ottenuto eliminando la necessità di ulteriori valutazioni del controllo di qualità, come le misurazioni spettrofotometric...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La piattaforma di sequenziamento a lettura lunga ha dimostrato notevoli vantaggi in questo studio, in particolare la sua capacità di ottenere un sequenziamento rapido con un'ampiezza di copertura costantemente elevata. In tutti gli isolati sequenziati con successo, è stata raggiunta un'ampiezza di copertura del 99,9%, indicando una rappresentazione quasi completa delle regioni genomiche associate alla resistenza. La profondità media di copertura in tutti i geni bersaglio è stata di 4462X...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo esprimere la nostra sincera gratitudine al SAMRC Centre for Tuberculosis dell'Università di Stellenbosch per aver fornito le risorse e le strutture essenziali. Siamo anche profondamente grati allo studio TS ELiOT per aver fornito i campioni che erano parte integrante di questo studio.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL & Tubi Lo-binding da 1,5 mL o 2 mLEppendorfEP0030108051-250EA
Scala da 1kbThermo Fisher ScientificSM0311
Tubi a tappo a vite da 2 mLSpecialità Scientifiche IncP2TUB056C-0001.5ST
Perle di vetro sterili da 2 mmSigma-AldrichZ273627-1EA
Sferato XP AMPureBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
Camera di elettroforesiThermo Fisher ScientificA25977
Alcol etilico, puroSigma-AldrichE7023-500ML
Omogeneizzatore FastPrepMP Biomedici116005500
Punte delle pipette a filtro (10 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-10-R
Punte per pipette a filtro (1000 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Punte delle pipette filtranti (20 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-20-R
Punte di pipette filtro (200 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-200-R
Cella di flusso  Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114
Blocco riscaldamentoEppendorf5382000031
Matrice InstaGeneBio-RadBBRD7326030
Rack magnetico Thermo Fisher Scientific 12321D
MicrocentrifugaEppendorf 5406000046
TirapiediOxford Nanopore TechnologiesMK1B
Kit di codifica a barre nativa V14 Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367
Modulo di Legatura Rapida NEBNextNEBE6056
NEBNext Ultra II Modulo di riparazione estrema/dA-tailingNEBE7546
Acqua priva di nucleasi (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipette (P10, P20, P200 e P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Tubi per il saggio dei QubitThermo Fisher ScientificQ32856
Kit di test HS per Qubit dsDNAThermo Fisher ScientificQ33231
Fluorometro a qubitThermo Fisher ScientificD33226
Ceppo di gel sicuro di DNA SYBRThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Universal Hood III transilluminatore (Sistema Molecular Imager Gel Doc XR)Bio-Rad170-8170
Miscelatore a vorticeLasecWMBB0L0E0216

References

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