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Articolo metodologico

Campionamento ambientale di microbi fotosintetici e dei loro virus: dal campo al laboratorio

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DOI:

10.3791/68379

⸱

3 luglio 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo i metodi di campionamento dalle zone eufotiche degli ecosistemi marini e d'acqua dolce per isolare i cianofagi (e i loro ospiti) e i processi post-campionamento che arricchiscono i singoli genotipi e caratterizzano le dinamiche di interazione virus-ospite.

Abstract

Il campionamento ambientale dei microrganismi fotosintetici e dei loro virus svolge un ruolo fondamentale nella comprensione della biodiversità marina e d'acqua dolce contemporanea e delle dinamiche degli ecosistemi, nonché degli impatti dei fattori legati ai cambiamenti climatici (ad esempio, l'aumento delle temperature e l'acidificazione) sulle traiettorie evolutive delle specie e sulla composizione della comunità. Sfortunatamente, la diversità della virosfera non supporta un unico campionamento universale e un flusso di lavoro sperimentale. In effetti, ogni sistema virale ha caratteristiche uniche, che richiedono modifiche ai protocolli standard in virologia per raggiungere gli obiettivi di ricerca. Sebbene la scoperta e la caratterizzazione dei virus richiedano approcci specifici per il sistema bersaglio, per tutti i virus gli obiettivi della ricerca sono simili: isolare il virus; determinare la gamma di ospiti; confermare l'infezione produttiva; e caratterizzare il virus, l'ospite e le dinamiche virus-ospite. Le descrizioni robuste dei sistemi virus-ospite consistono in minima parte nel chiarire la morfologia, la fisiologia, la biochimica e i profili omici. Ulteriori informazioni possono essere ottenute manipolando il sistema modificando fattori come la molteplicità dell'infezione, la temperatura, il pH, l'interruttore dell'ospite, l'evoluzione diretta o l'applicazione di farmaci per osservare la risposta del sistema virus-ospite. Il nostro laboratorio studia i virus in tutti i domini della vita (Archaea, Bacteria ed Eukarya). In questo rapporto, descriviamo in dettaglio i metodi per il campionamento di microbi fotosintetici dalla zona eufotica di ambienti d'acqua dolce e marini, con particolare attenzione all'isolamento dei batteriofagi (cioè i cianofagi) dei cianobatteri. I cianobatteri sono specie fondamentali per la produzione primaria e il ciclo dei nutrienti in questi ecosistemi acquatici. Il flusso di lavoro descritto si estende dal campionamento delle acque a diverse profondità alla caratterizzazione delle caratteristiche del sistema virus-ospite utilizzando colture di terreni liquidi e solidi, metodi molecolari/genetici avanzati e approcci analitici. I metodi descritti sono adattabili alla scoperta di batteriofagi e virus in sistemi virus-ospite in tutti i domini della vita.

Introduzione

Caratterizzare le dinamiche di infezione e le relazioni evolutive dei cianofagi e dei loro ospiti è la chiave per comprendere gli stati attuali e futuri degli ecosistemi marini e d'acqua dolce. Tecniche avanzate di sequenziamento ad alto rendimento e moderni metodi analitici consentono il sequenziamento rapido dei genomi dei cianofagi (e dell'ospite) per studiare le relazioni virus-ospite 1,2. Tuttavia, i flussi di lavoro iniziano con il campionamento ambientale per isolare e identificare i virus e i loro ospiti 3,4,5. A causa della diversità della virosfera, non esiste un unico protocollo per il campionamento e la caratterizzazione di tutti i virus e batteriofagi. In effetti, ogni sistema virus-ospite ha le sue caratteristiche uniche. Ciononostante, gli obiettivi di base sono simili indipendentemente dal sistema virale esplorato: isolare il virus; determinare la gamma di ospiti; dimostrare un'infezione produttiva in uno o più ospiti; Caratterizzare le dinamiche del virus, dell'ospite e dell'infezione virus-ospite utilizzando approcci qualitativi e quantitativi. Una comprensione avanzata del sistema virale può essere esaminata perturbando il sistema. La modifica di parametri come la molteplicità dell'infezione (MOI)6, la temperatura, il pH, il ceppo ospite o l'applicazione di farmaci per determinare la risposta del sistema, fornisce ulteriori informazioni sulla natura delle dinamiche virus-ospite. Una manipolazione più avanzata, come l'evoluzione diretta, può fornire ulteriori informazioni sulla potenziale traiettoria evolutiva del sistema e su come gli endpoint co-evolutivi possono avere un impatto sulla più ampia comunità microbica e sull'ecosistema.

In questo studio, presentiamo un modello (ma facilmente adattabile) protocollo per il campionamento ambientale di microbi fotosintetici come cianobatteri e microalghe, che svolgono un ruolo critico nel ciclo dei nutrienti e nella produzione primaria in ecosistemi marini, d'acqua dolce e altri ecosistemi acquatici 7,8,9,10,11 . Il flusso di lavoro si concentra sull'isolamento degli ospiti dalle zone eufotiche degli ambienti marini e d'acqua dolce e dei loro virus e batteriofagi, che sono i fattori chiave di questi ecosistemi12. Sia i virus che i batteriofagi hanno un impatto sulle strutture della popolazione eucariotica e procariotica e influenzano pesantemente la diversità e la produttività degli ecosistemi13. Pertanto, l'obiettivo qui è fornire un protocollo di campionamento e un flusso di lavoro post-campionamento che faciliti l'arricchimento di host e virus per l'indagine: dinamiche single-virus/single-host, multi-virus/single-host, single-virus/multi-host e multi-virus/multi-host; -substrati omici alla base delle dinamiche di infezione virus-ospite; e, potenziali traiettorie co-evolutive ed endpoint evolutivi che influiscono sul sistema virus-ospite in studio e sull'ecosistema più ampio da cui sono stati estratti i virus e l'ospite.

In particolare, descriviamo un flusso di lavoro per il campionamento ambientale, la pre-elaborazione sul campo dei campioni (cioè prima che raggiungano il laboratorio), la post-elaborazione per l'isolamento di batteriofagi (e virus), l'arricchimento di colture di microrganismi di specie miste verso l'identificazione di ospiti permissivi, lo sviluppo di isolati di singole colonie di ospiti putativi, confermando una buona fede relazione virus-ospite (cioè infezione produttiva) e caratterizzazione delle proprietà fondamentali dell'infezione (ad esempio, virulenza). I test di infezione non solo consentono di calcolare la virulenza relativa (VR)14 e la resilienza dell'ospite (RR)15, ma includono anche passaggi per l'estrazione di campioni di coltura in punti temporali chiave per lo studio dei substrati -omici che sono alla base della fisiologia osservata (ad esempio, le dinamiche di interazione virus-ospite). Infine, discutiamo le potenziali insidie, la risoluzione dei problemi e le soluzioni, nonché i modi per modificare i passaggi selezionati per mirare a taxa specifici. Il flusso di lavoro è applicabile ai cianofagi-cianobatteri, ai phycodnavirus-microalghe e ai sistemi termofili fusellovirus-archaeal16,17, dimostrando la sua utilità nella caratterizzazione dei virus in tutti e tre i domini della vita: batteri, eucaria e archei.

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Protocollo

1. Campionamento ambientale

NOTA: Questo protocollo descrive il campionamento offshore per i microbi fotosintetici dalla zona eufotica entro 5 miglia dalla costa al largo della costa della California meridionale. Tuttavia, il protocollo è stato adattato per campionare da laghi, laghi ghiacciati o sorgenti termali geotermiche (Figura 1).

  1. Campionamento ambientale offshore lungo la costa meridionale della California
    NOTA: Una nave da 6 m, a V profonda, con console centrale (cioè barca) con due motori fuoribordo da 150 CV è stata caricata con attrezzature di ricerca (Tabella dei materiali). Tre siti sono stati selezionati per il campionamento della zona eufotica: (a) Sito 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; b) sito 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; e (c) Sito 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. In ogni sito, a mezzogiorno sono stati estratti 20 litri di campioni d'acqua da tre diverse profondità in ciascun sito: < 3 m (campione di superficie), 6 m e 14 m.
    1. Gruppo pompa di trasferimento: una volta raggiunto ogni sito di campionamento, aprire l'ancora dell'imbarcazione e registrare le coordinate GPS dal sistema di navigazione. Assemblare il sistema di campionamento.
      1. In breve, montare un'estremità di un tubo in PVC blu flex-plus con diametro interno di 2,54 cm (50 piedi) su un filtro di aspirazione da 2,54 cm per evitare che detriti di grandi dimensioni entrino nel sistema di pompaggio. Fissare la giunzione filtro-tubo con del nastro adesivo. Montare l'estremità opposta del tubo al collettore di aspirazione della pompa di travaso in acciaio inox da 1 hp.
      2. Collegare una sezione di 10 piedi di un tubo flessibile in gomma resistente al collasso con diametro interno di 2.54 cm all'uscita della pompa. Collegare il cavo elettrico della pompa di travaso al generatore inverter da 3800 W alimentato a gas. Una volta assemblata, adescare la pompa di trasferimento e verificare che il sistema di pompaggio sia operativo (Figura 1, riga superiore).
    2. Ponderazione del tubo di trasferimento: Fissare un'estremità di una corda marina in nylon lunga 25 m e con un diametro di 1,25 cm all'occhiello di un'ancora a fungo da 14 kg. Utilizzare del nastro adesivo per fissare la corda al tubo in PVC blu ogni 3 m con il filtro di aspirazione posizionato a circa 1 m sopra l'ancoraggio per evitare che il filtro si incastri nella sabbia o colpisca le rocce sott'acqua. Utilizzare l'ancora per immergere il tubo di trasferimento (tubo in PVC blu) e per evitare che forti correnti sotterranee creino un ampio angolo tra l'imbarcazione e il tubo, che darebbe profondità del campione imprecise. Abbassare il gruppo ancoraggio/fune e tubo in profondità.
    3. Estrazione di campioni di acqua di mare: una volta che la punta del tubo con il filtro si trova alla profondità desiderata, accendere il generatore e la pompa. Adescare la pompa o scuotere il tubo di trasferimento per far sì che l'acqua inizi a pompare dalla profondità. Una volta che un flusso d'acqua costante viene trasferito dalla profondità, scaricare 1-2 volumi di tubi nell'oceano per garantire che l'acqua dalla profondità desiderata scorra attraverso la pompa. Raccogliere i campioni d'acqua in brocche d'acqua da 20 L (Figura 1, fila in alto, all'estrema destra).
    4. Trasporto dei campioni alla stazione sul campo: riempire le brocche d'acqua da 20 L a circa 18 L per consentire lo scambio di gas (ad esempio, O2/CO2) tra i campioni d'acqua e lo spazio di testa durante il trasporto. Prima di tappare le brocche d'acqua, registrare la temperatura, il pH e la salinità dai campioni di acqua grezza. Quindi, tappare e posizionare le brocche d'acqua su un letto di ghiaccio nel deposito sottocoperta e coprire con un foglio leggero per evitare la sovraesposizione alla luce solare e alle alte temperature.
  2. Pre-trattamento sul campo di campioni d'acqua
    NOTA: All'arrivo in una struttura a terra (ad esempio, camera d'albergo/sala conferenze/stazione sul campo), sono state intraprese una serie di fasi di pre-trattamento per proteggere il contenuto microbico all'interno dei campioni d'acqua e per separare diverse frazioni dei campioni di acqua di mare in base alla dimensione delle particelle.
    1. Assemblaggio del sistema di filtrazione: Fissare un'estremità di un pezzo lungo 1 m di tubo in vinile trasparente con diametro interno di 9,525 mm all'ingresso della punta del tubo sulla porta del vuoto di una pompa per vuoto a membrana dell'aria portatile. Fissare l'estremità opposta dello stesso tubo a un gruppo ventosa con filtro da 1,0 L, 0,45 μm. Utilizzare in sequenza gruppi di coppe filtranti da 0,45 μm e 0,22 μm per separare diverse frazioni del campione di acqua di mare come descritto di seguito.
    2. Per verificare la presenza di perdite o filtri difettosi/strappati, filtrare 0,25 L di acqua di mare attraverso la coppa del filtro a membrana in polietersulfone (PES) da 0,45 μm. Un sistema che non perde mostrerà l'aspirazione tra il filtro e la griglia una volta che il campione di acqua di mare è stato completamente filtrato.
    3. Filtrazione attraverso il gruppo del filtro a membrana PES da 0,45 μm: per isolare i microrganismi fotosintetici (ad es. microalghe e cianobatteri), l'obiettivo è filtrare 2 L di campione di acqua di mare attraverso il contenitore del filtro a membrana PES da 0,45 μm utilizzando due bicchieri da 1 L (o quattro bicchieri da 500 mL). Etichettare in modo appropriato tutti i flaconi di filtrato con la dimensione del filtro, la profondità da cui è stato prelevato il campione, la data e il designatore del sito di campionamento. Infine, chiudere a vite e coprire i flaconi contenenti filtrato da 0,45 μm con un panno o un manicotto semitrasparente per evitare un'eccessiva luce solare.
      NOTA: Non lasciare che il filtro nella coppa del filtro funzioni a secco. Tenere sempre un sottile strato di liquido sul filtro. Il filtro accumulerà detriti biologici (ad es. cellule). Se il filtro si ostruisce con detriti, svitare con cautela il gruppo della tazza e mettere da parte la tazza del filtro usata, ma non gettare la tazza intasata. Collegare un nuovo filtro da 0,45 μm e continuare.
    4. Filtrazione attraverso il gruppo della coppa del filtro a membrana PES da 0,22 μm: per isolare i virus eucariotici di grandi dimensioni, utilizzare 1 L del filtrato da 0,45 μm del passaggio precedente (passaggio 1.2.3) e filtrare attraverso una coppa del filtro da 0,22 μm. Etichettare in modo appropriato il flacone dell'ultrafiltrato con le dimensioni del filtro, la profondità da cui è stato prelevato il campione, la data e il designatore del sito di campionamento. Infine, chiudere a vite e coprire il flacone contenente 0,22 μm di ultrafiltrato (filtrando il filtrato da 0,45 μm).
      NOTA: Non lasciare che il filtro nella coppa del filtro funzioni a secco. Tenere sempre un sottile strato di liquido sul filtro. Il filtro accumulerà detriti biologici, che contengono campioni biologici. Se il filtro si ostruisce, svitare il gruppo tazza e mettere da parte la tazza del filtro usata. Non gettare la tazza intasata. Collegare un nuovo filtro da 0,22 μm e continuare.
    5. Biomassa concentrata da un filtro da 0,45 μm: versare 48 mL di filtrato (da filtrazione a 0,22 μm) in ciascuna delle due provette da centrifuga coniche sterili in polipropilene da 50 mL. Utilizzare un bisturi sterile per tagliare uniformemente lungo il bordo più esterno del filtro da 0,45 μm esaurito all'interno del gruppo della tazza. Utilizzare una pinza sterile per rimuovere il filtro umido e carico di biomassa. Tagliatelo a metà. Arrotolare metà della carta da filtro in una provetta conica da 50 ml. Ripetere con la seconda metà della membrana filtrante e il secondo tubo. Avvitare i tappi dei tubi e fissarli con pellicola trasparente. Etichettare il tubo.
    6. Concentrare la biomassa virale di grandi dimensioni da un filtro da 0,22 μm: versare 14 mL di ultrafiltrato in ciascuna delle due provette da centrifuga coniche sterili in polipropilene da 15 mL. Utilizzare un bisturi sterile per tagliare lungo il bordo esterno del filtro da 0,22 μm usato all'interno del gruppo della coppa. Utilizzare una pinza sterile per rimuovere il filtro umido e carico di biomassa. Tagliatelo a metà. Arrotolare e inserire metà della carta da filtro in una delle provette coniche da 15 mL. Ripetere l'operazione per la seconda metà della membrana filtrante e la seconda provetta conica da 15 mL. Avvitare i tappi delle provette e fissarli con una pellicola trasparente (ad es. Parafilm). Etichettare ogni provetta con le dimensioni del filtro (ad esempio, 0,22 μm), il sito, la profondità e la data.
    7. Conservare il filtrato rimanente da 0,45 μm e il filtrato rimanente da 0,22 μm per la spedizione al laboratorio. Ripetere l'intero processo di filtrazione (passaggi da 1.2.2 a 1.2.6) per ogni profondità e sito di campionamento.
      NOTA: L'ultrafiltrato viene utilizzato in laboratorio come base multimediale (con minerali nativi e altri nutrienti).
      Microscopia del campione grezzo (opzionale): prendere una provetta conica da 50 mL con un filtro da 0,45 μm e agitare delicatamente. Utilizzare un contagocce di plastica (o pipettatore) per prelevare 30-50 ml di acqua di mare dalla provetta conica da 50 ml e preparare un vetrino da microscopio in vetro con il campione e un vetrino coprioggetto. Utilizzando un microscopio da campo e un computer, visualizzare il contenuto del vetrino del microscopio per rilevare e registrare le caratteristiche dei microrganismi osservati (Figura 2D).

2. Elaborazione del campione per concentrare virus/batteriofagi e arricchire gli ospiti

NOTA: Questo protocollo descrive le prime fasi di elaborazione necessarie una volta che i campioni raggiungono il laboratorio dal sito sul campo. Il trasporto in aereo rispetto al veicolo stradale può richiedere considerazioni diverse. La vitalità ambientale del campione diminuirà con bruschi cambiamenti di temperatura, pH, salinità, esposizione o mancanza di esposizione alla luce, concentrazione di gas disciolti (ad esempio, CO2 e O2) e tempo tra l'estrazione ambientale e l'elaborazione in laboratorio.

  1. Centrifuga, concentrazione e conservazione di virus e batteriofagi
    NOTA: Una volta che i campioni arrivano in laboratorio, l'elaborazione entro 8 ore dall'arrivo può ridurre al minimo la perdita di microbi vitali a causa del lasso di tempo tra l'estrazione del sito del campione e l'arrivo in laboratorio. I passaggi forniti di seguito forniranno aliquote di sospensione concentrata di batteriofago (o virus) (cioè scorte di lavoro) per la conservazione e l'uso a lungo termine.
    1. Ultrafiltrato concentrato: per ogni profondità di campionamento per sito, spedire i restanti ~800 mL di ultrafiltrato al laboratorio. Utilizzare un filtro centrifugo 3K NMWL da 15 mL e centrifugare a 6000 x g per 10-20 minuti per concentrare 50-100 mL di ultrafiltrato fino a 1,0-1,5 mL. Preparare le griglie per l'imaging TEM come descritto in precedenza16 per valutare se sono presenti particelle simili a virus (VLP) nell'ultrafiltrato concentrato risultante. Se vengono rilevate VLP, dividere il concentrato in aliquote da 100 mL. Conservare a 4 °C (o -20 °C per una conservazione a lungo termine).
    2. Concentrazione di particelle dal filtro da 0,22 μm: utilizzare un bisturi sterile per raschiare delicatamente i detriti dai filtri da 0,22 μm nell'ultrafiltrato all'interno dei tubi da 50 mL in cui sono stati trasportati i filtri. Utilizzare un gruppo coppetta spin-concentratore NMWL da 10K per concentrare 50-200 mL di sospensione fino a un volume di ~3 mL di retentato campione. Preparare le griglie per l'imaging TEM come descritto in precedenza16 per determinare se sono presenti VLP dal filtrato da 0,45 μm che potrebbero essere state catturate sulla superficie del filtro da 0,22 μm. Se vengono rilevate VLP, dividere il concentrato in aliquote da 100 mL e conservare a 4 °C (o -20 °C per la conservazione a lungo termine).
  2. Retentato di concentrazione e arricchimento di spin da filtri da 0,45 μm.
    NOTA: Le colture miste di microrganismi possono contenere ospiti per i virus e i batteriofagi isolati sopra (passaggi 2.1.1 e 2.1.2). La concentrazione di spin e l'arricchimento di colture miste forniscono materiali di lavoro da cui sviluppare colture pure di ospiti putativi (vedi passaggio 3).
    1. Concentrazione di sospensioni miste: per ogni profondità di campionamento per sito, rispedire al laboratorio ~100 mL di ultrafiltrato con un filtro da 0,45 μm carico di detriti cellulari. Utilizzare un bisturi sterile per raschiare i detriti dal filtro da 0,45 μm nell'ultrafiltrato nelle provette da 50 ml in cui sono stati trasportati. Centrifugare il campione a 2000 x g per 10 minuti, 4 °C per pellettare la biomassa. Risospendere il pellet in 5 mL di terreno BG-11 diluito1:8 mediante triturazione delicata con una pipetta.
    2. Retentato arricchente da filtro da 0,45 μm: Preparare sei colture parallele in fiasche di Erlenmeyer da 250 mL contenenti 50 mL di terreno BG-11 (3 flaconi) e una miscela di ultrafiltrato dal sito del campione (40 mL) più BG-11 (10 mL). Inoculare in ogni matraccio 0,5 mL di concentrato cellulare (dal punto 2.2.1). Incubare con lieve agitazione in un fotobioreattore per un minimo di 7-10 giorni a 25 °C con intensità della luce impostata a 20-40 mmol di fotoni/m2/s.19 Una volta che la crescita è robusta (ad esempio, OD730nm = 0,8), centrifugare a 2000 x g, 10 min, 4 °C per pellettare. Risospendere il pellet in 10 mL di terreno BG-11 diluito 1:8 mediante triturazione delicata con una pipetta. Preparare 10-20 aliquote da 0,5 mL di sospensione cellulare in provette criogeniche con tappo a vite per la conservazione a -80 °C.

3. Sviluppo di colture pure monotipo di ospiti microbici

NOTA: Questo protocollo descrive le procedure per l'isolamento e la purificazione di presunti ospiti microbici per virus e batteriofagi da colture miste elaborate da campioni ambientali raccolti. Più fenotipi di ospiti possono essere isolati e purificati, aumentando così la probabilità di rilevare ospiti permissivi per i virus e i batteriofagi presenti nei campioni d'acqua conservati (passaggi 2.1.1-2.1.2).

  1. Striature delle piastre e selezione di isolati di singole colonie
    NOTA: Colture pure multiple a genotipo singolo sono sviluppate da colture miste per aumentare la probabilità di isolare un ospite suscettibile e permissivo di virus o batteriofagi catturati durante il campionamento ambientale e per studiare la gamma di ospiti di virus e batteriofagi.
    1. Sviluppare isolati di colonie singole (SCI) come descritto di seguito.
      1. Preparare le piastre di agar BG-1120. Scongelare con ghiaccio, un'aliquota della sospensione miscelata conservata a -80 °C (dal punto 2.2.2). Utilizzare un ansa sterile per striare i concentrati cellulari sulle piastre di agar BG-11 utilizzando le tecniche standard20. Incubare le piastre striate in un fotobioreattore per ~10 giorni a 25 °C con un'intensità luminosa di 20-40 mmol di fotone/m2/s o fino a quando le colonie non compaiono sulle piastre.
      2. Preparare ~10 colture di semi in provette da 20 mL con 5 mL di terreno BG-11 e/o 5 mL di una miscela di ultrafiltrato dal sito di campionamento e BG-11. Prelevare una lesione midollare dalla piastra con uno stuzzicadenti sterile e inoculare ogni provetta singolarmente facendo cadere uno stuzzicadenti in ogni provetta. Incubare con lieve agitazione in un fotobioreattore per un minimo di 10-15 giorni a 25 °C con intensità della luce impostata a 20-40 mmol di fotone/m2/s o fino a quando non viene rilevata la crescita (ad esempio, OD730nm = 0,4-0,8).
        NOTA: Se sono presenti più fenotipi di colonie (ad es. morfologia, trasparenza, colore) sulla prima piastra di striature, selezionare le singole colonie per l'inoculazione da una gamma di fenotipi di colonie.
    2. Sviluppo di colture pure di ceppi da lavoro: una volta rilevata una crescita positiva della coltura del seme, ripetere le procedure di striatura fino a quando non appare un solo fenotipo di colonia sulle piastre (Figura 3B e Figura 4B). Aumentare le colture di semi a colture da 50 mL in palloni deflettori da 250 mL (Figure 3C e Figura 4C) come descritto sopra (passaggio 2.2.2). Preparare ~20 aliquote da 0,5 mL di sospensione di cellule SCI e pipettare in provette criogeniche con tappo a vite da 1,0 mL per la conservazione a -80 °C.
      NOTA: Per lo sviluppo di colture pure di cianobatteri, possono essere necessari antibiotici o antimicotici (ad es. imipenem, cicloesimide) per ridurre la contaminazione della coltura21. La procedura di placcatura è un punto cardine in cui può essere mirato l'isolamento di cianobatteri o microalghe. I parametri della luce durante l'incubazione possono variare in termini di intensità luminosa o cicli di accensione-spegnimento.
  2. Caratterizzazione di un singolo genotipo e stoccaggio delle scorte di lavoro
    NOTA: Per confermare l'isolamento e l'arricchimento dei singoli genotipi di ospiti putativi, le colture pure sono caratterizzate morfologicamente e geneticamente.
    1. Caratterizzazione morfologica: Una volta che i cicli di coltura liquida e di lavoro su piastra di terreni solidi hanno portato a un fenotipo a singola cellula, caratterizzare i morfotipi microbici sia mediante microscopia ottica (Figura 2A-C) che, se disponibile, microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e/o microscopia elettronica a scansione (SEM; Figura 3A e Figura 4A). Al microscopio ottico (ad es. ingrandimento 60x-100x) si può osservare un'organizzazione cellulare unicellulare, coloniale, filamentosa, a spirale, ramificata o tricoma, verde, marrone chiaro o trasparente. Ciò indicherà una possibile assegnazione tassonomica.
    2. Caratterizzazione genetica: convalidare l'isolamento di un singolo genotipo di microrganismo mediante estrazione di DNA dalle colture pure putative, seguita da un sequenziamento parziale del genoma. Nei cianobatteri, il gene 16S rRNA è spesso un bersaglio (Figura 5A)22. Un'analisi filogenetica 16S può identificare il raggruppamento tassonomico22. Nelle microalghe, l'rRNA 18S è spesso preso di mira23. Per gli isolati di interesse o per i nuovi isolati, può essere perseguito il sequenziamento dell'intero genoma.

4. Sviluppo di sospensioni di virus/batteriofagi a genotipo singolo

NOTA: Questo protocollo descrive le procedure per l'isolamento e la purificazione di sospensioni virali e batteriofagiche multiple a genotipo singolo da campioni ambientali.

  1. Diluizione e TEM di concentrati VLP
    NOTA: Utilizzando i saggi TEM e di placca basati su piastra24, si ottiene la conferma che le VLP sono batteriofagi (o virus) in buona fede che infettano le cellule ospiti.
    1. Microscopia elettronica a trasmissione di filtrati (0,45 μm e 0,22 μm): utilizzare concentrati da 0,45 μm e 0,22 μm di filtrazione di campioni di acqua grezza (vedere passaggio 2.1) per preparare le griglie TEM16 e l'immagine per esaminare l'eterogeneità delle particelle virali (cioè la diversità dei morfotipi). Diluire i campioni che risultano in griglie con un'elevata confluenza (ad esempio, il 90%) prima di completare i passaggi successivi per ottenere una confluenza del 30%-50%. Il conteggio manuale delle particelle o l'uso di software di imaging possono essere impiegati per stimare la confluenza cellulare sulle griglie.
      NOTA: Un'elevata confluenza sulle griglie può comportare lo sgombero dei prati ospiti su piastre di media solidi piuttosto che l'emergere di singole placche che possono essere selezionate. Pertanto, la diluizione dei campioni prima dei saggi della placca può far risparmiare tempo. In alternativa, è possibile testare più piastre da prato ospite per le interazioni ospite-virus utilizzando diluizioni seriali di concentrati VLP.
    2. Rilevamento dell'attività di batteriofagi (o virus) sui prati ospiti: su piastre di agar BG-11, coltivare prati ospiti putativi di cianobatteri (o microalghe) da ceppi di lavoro (passaggio 3.1.2). Pipettare 0,5 mL di sospensione VLP in 4,5 mL di terreno sul prato (Figura 6A, a sinistra) e agitare delicatamente fino a quando l'intera superficie del prato non è ricoperta di sospensione. Incubare in un fotobioreattore per 3-10 giorni a 25 °C con un'intensità luminosa di 20-40 mmol di fotoni/m2/s o fino a quando le placche sono visibili sulle piastre (Figura 6A, a destra).
  2. Raschiatura di placche e sviluppo di sospensioni di virus o batteriofagi a genotipo singolo
    NOTA: Raschiando i singoli fenotipi della placca e propagando i batteriofagi in colture liquide dell'ospite, vengono confermate le interazioni ospite-batteriofago (o ospite-virus) in buona fede, consentendo lo sviluppo di stock di lavoro di batteriofagi (o virus) per i saggi di infezione. Le scorte di batteriofago (o virus) devono essere titolate con uno dei diversi metodi (ad esempio, qPCR, saggi di placca) per procedere con i saggi di infezione a una molteplicità definita di infezione (MOI).
    1. Isolamento e propagazione di un genotipo di batteriofago (o virus): una volta che le singole placche possono essere viste sulle piastre (a causa di un'adeguata diluizione del concentrato di VLP), utilizzare un ansa sterile per raschiare una singola placca. Agitare l'anello in una coltura di semi da 10 mL dell'ospite (Figura 6B, a sinistra). Incubare con un leggero agitamento (ad es. 70-120 giri/min) in un fotobioreattore per 3-10 giorni a 25 °C con un'intensità luminosa impostata a 20-40 mmol di fotone/m2/s o fino a quando non cala una ODdi 730 nm o non vengono rilevati detriti cellulari sul fondo della provetta, che indica la morte/lisi cellulare (Figura 6B, a destra)25.
      NOTA: Se le placche si formano sui prati ospiti ma non ci sono segni di infezione nella coltura liquida, le placche potrebbero essere state formate da una batteriocina26 piuttosto che da un batteriofago (o virus). La TEM può supportare i saggi su piastra indicando la morte cellulare per infezione batteriofago (o virale).
    2. Quantificazione del titolo per i ceppi di lavoro di batteriofagi (o virus): l'isolamento dei batteriofagi (o virus) si ottiene utilizzando i metodi di filtrazione e di concentrazione di spin descritti sopra. Quantificare i titoli per le sospensioni di batteriofagi (o virus) mediante saggi seriali di diluizione su placca27. In alternativa, eseguire l'estrazione del DNA e il sequenziamento dell'intero genoma del virus e la filogenetica (Figura 5B) per sviluppare primer per condurre la titolazione basata sulla qPCR dei batteriofagi per stabilire le scorte di lavoro per i successivi saggi di infezione.
      NOTA: La propagazione di genotipi di singoli batteriofagi (o virus) può essere aumentata a 50 mL o 100 mL di colture se i volumi del titolo o del working stock sono troppo bassi per le esigenze sperimentali. Considerare la natura del sistema virus-ospite (ad esempio, alta virulenza o bassa virulenza), la molteplicità di infezioni (MOI) pianificate per i test di infezione e quanti test di infezione saranno completati per un progetto durante lo sviluppo di scorte di batteriofago (o virus). Non è consigliabile scongelare e ricongelare le scorte di virus. Scongelare e utilizzare una scorta virale completa da repliche della stessa preparazione allo stesso titolo per ogni esperimento. Altre tecniche di titolazione possono integrare i metodi descritti, tra cui la ionizzazione elettrospray/spettrometria di massa (ESI/MS)28.

5. Saggi di infezione

NOTA: Questo protocollo descrive i saggi di infezione ospite-fago (o ospite-virus) che vengono utilizzati per: caratterizzare qualitativamente la virulenza, l'intervallo dell'ospite e il fenotipo di infezione (un indicatore della strategia di replicazione) su terreni solidi; e valutare quantitativamente la cinetica di crescita, la virulenza del virus14 e la resilienza dell'ospite15 in coltura liquida.

  1. Determinazione della virulenza relativa del batteriofago (o del virus) e dell'intervallo dell'ospite su terreni solidi
    NOTA: Tutti i saggi sui terreni solidi, compresi i saggi spot-on-lawn, i saggi su placca di diluizione seriale su piastra singola e i saggi su piastra di resistenza dell'ospite, forniscono dati qualitativi sui parametri di infezione batteriofago-ospite come la virulenza del virus, l'intervallo dell'ospite e la strategia di replicazione. I saggi di crescita delle colture liquide consentono misure più quantitative e la modellazione delle dinamiche virus-ospite.
    1. Saggi spot-on-lawn: per determinare la gamma di ospiti, preparare prati di più ospiti putativi isolati da campioni ambientali o da ceppi acquisiti da altri laboratori o collezioni di colture. Sui prati, posizionare 2 μL di sospensione di batteriofago (o virus) sul prato con una pipetta. Su una regione separata della stessa piastra, individuare lo stesso volume di Triton X-100 e acqua nanopura (18MW) come controlli positivi e negativi, rispettivamente16. Condurre più saggi spot-on-lawn con un determinato batteriofago (o virus) su più ospiti per valutare la gamma di ospiti del batteriofago16. I fenotipi della placca offrono informazioni sulla strategia di replicazione del batteriofago (o virus). Le placche che hanno bordi netti e che sgombrano fino all'agar indicano una replicazione litica, mentre le placche con bordi diffusi o un alone possono indicare una replicazione non litica16,17.
      NOTA: In alternativa, i saggi seriali di diluizione della placca su piastra singola indicano se esiste una relazione lineare tra le dimensioni della placca e il titolo del batteriofago. Usa un pennarello sul retro del piatto per dividere il piatto in una griglia o in sezioni di torta. Quindi, utilizzando lo stesso volume (cioè 2 mL) ma con diluizioni della sospensione batteriofago (ad esempio, 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), condurre il saggio spot-on-lawn su una singola piastra ospite.
    2. Saggi di resistenza dell'ospite: per determinare se una serie di batteriofagi può produrre infezione su un determinato ospite, preparare un prato ospite su un piatto come descritto sopra. Usando un pennarello sul retro del piatto, suddividere il piatto in una griglia o in sezioni di torta. Quindi, individuare 2 ml di ciascuna sospensione di batteriofago (o virus) in una sezione della griglia (o torta), utilizzando Triton X-100 e acqua nanopura come controlli. Se tutte le sospensioni di batteriofago (o virus) vengono aggiunte a titoli uguali, valutare qualitativamente la virulenza relativa tra ceppi di batteriofagi (o virus) sull'ospite (ad esempio, placca più grande = virus più virulento).
  2. Quantificazione della virulenza, della resilienza e della crescita nei saggi di infezione da coltura liquida
    NOTA: I risultati qualitativi iniziali forniscono una base per individuare specifiche coppie batteriofago-ospite e condurre analisi più quantitative delle dinamiche delle interazioni virus-ospite. Nella coltura liquida, viene generata una curva di crescita dell'ospite infetto che viene confrontata con la crescita dell'ospite non infetto (di controllo).
    1. Eseguire il test di infezione da singolo virus/singolo ospite in coltura liquida come descritto di seguito.
      1. Stabilire colture liquide parallele (~6-12) di un microrganismo (ad esempio, un cianobatterio) che si è dimostrato suscettibile e permissivo mediante saggi su piastra in terreni solidi (fase 5.1) in: 1,0 L (320 mL di coltura), 500 mL (160 mL di coltura) o 250 mL (80 mL di coltura) - fiasche di coltura deflettore, come descritto in precedenza17. In un momento predefinito (tipicamente 0,5 o 1 tempo di raddoppio dell'ospite), inoculare un sottogruppo di colture parallele a densità cellulare equivalente (ad esempio, OD730nm = 0,08) in triplicato con sospensione batteriofagomica utilizzando il volume appropriato richiesto per produrre una molteplicità di infezione (MOI) preselezionata con titolo di materiale lavorante disponibile.
      2. Lasciare altre colture parallele (anche in triplice copiato) non inoculate (cioè non infette) come controlli. Facoltativamente, inoculare una terza serie di colture parallele con un diverso ceppo di batteriofago (o virus) per confronti tra coppie batteriofago-ospite selezionate. Lasciare che le colture crescano in un fotobioreattore per 3-10 giorni a 25 °C con un'intensità della luce impostata a 20-40 mmol di fotoni/m2/s.
      3. Generare curve di crescita dell'ospite effettuando letture OD730nm a intervalli di tempo regolari (ad esempio, 8 ore) da colture (di controllo) infettate e non infette da batteriofagi (Figura 7A). Utilizzare la verifica TEM di colture di controllo non infette (Figura 7C) e l'infezione produttiva in colture cellulari ospiti (Figura 7D). Gli effetti citopatici 29,30 sono facilmente osservabili nella maggior parte delle cellule infette, mentre le cellule non infette non mostrano segni di trasformazione morfologica o stress.
    2. Analisi di base per i saggi di infezione da coltura liquida: dai saggi di infezione da coltura liquida a virus singolo/ospite singolo (SVSH), è possibile derivare diverse metriche di base, come ad esempio: tasso di crescita specifico massimo (μmax)31, virulenza relativa del batteriofago (o del virus)14 e resilienza relativa dell'ospite15- per una descrizione più quantitativa delle dinamiche batteriofago-ospite o virus-ospite (Figura 7B). Le metriche standard segnalabili includono il tasso di crescita (spesso riportato come tasso di crescita specifico massimo o μmassimo) e la virulenza relativa (VR)14 rispetto a un controllo ospite non infetto e/o a un batteriofago separato sullo stesso ospite. Possono essere riportate anche altre metriche come la capacità di carico del sistema (Nasintoto) e la resilienza relativa dell'ospite (RR)15 .

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Risultati

L'uso di un generatore elettrico portatile alimentato a benzina, di una pompa di trasferimento dell'acqua e di tubi resistenti al collasso è un modo efficace per estrarre campioni d'acqua dall'oceano, dai laghi, dai laghi ghiacciati e da altri ambienti acquatici (ad esempio, lagune) a profondità selezionate (Figura 1, tre righe in alto). Sono necessarie attrezzature alternative per le acque acide ad alta temperatura di sorgenti termali geotermiche, piscine e...

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Discussione

La virosfera è vasta e diversificata, quindi richiede diversi approcci sperimentali per lo studio di diversi sistemi virali. Ciò include diverse strategie per isolare i virus e i loro ospiti da ambienti diversi e diversi metodi di lavorazione per garantire che colture pure di ospiti e dei loro virus possano essere prodotte da campioni grezzi. Queste colture pure possono essere utilizzate nei saggi di infezione SVSH, sia su terreni solidi che in colture liquide, in modo da ottenere le car...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato in parte dalla sovvenzione OISE n. 1856091 (PI-Ceballos) della National Science Foundation (NSF) degli Stati Uniti e dalla sovvenzione n. 2119968 (PI-Ceballos) della National Science Foundation (NSF). Gli autori ringraziano i contributi del Dr. Chinnapong Wangnai e del Dr. Chakrit Tachaapaikoon della King Mongkut's University of Technology di Thonburi (Thailandia), che hanno fornito rispettivamente la videografia e il supporto sul campo per il campionamento ambientale. Gli autori ringraziano anche il Dr. Jorge Armando Leiva Sanabria dell'Università del Costa Rica - Guanacaste per la sua assistenza nell'ottenere i permessi di campionamento dai Parchi Nazionali in Costa Rica e nell'assistenza nella raccolta dei campioni dalle piscine geotermiche. Gli autori ringraziano anche Enrique Marroquin, Jr. (Università della California Merced) e Alexia Maceda (Università del Maine, Orono, ME, USA), che hanno assistito al campionamento al largo della costa della California meridionale e dei laghi nel nord del Minnesota, rispettivamente. Gli autori ringraziano e riconoscono il supporto tecnico della signora Socheata Hour, che ha calcolato i parametri di infezione per il set di dati φSBL14-SWII.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pompa di trasferimento in acciaio inossidabile da 1 HP Utilitech, Charlotte, Carolina del Nord, Stati UnitiN/A
Tubi da 1,5 mlwww.eppendorf.com30123611
Concentratore di centrifuga NMWL Centricon Plus 70 da 10Kwww.sigmaaldrich.comUFC701008
250 mL di fiasche di Erlenmeyer sconcertate www.sigmaaldrich.comCLS4450250
Generatore inverter da 3800 watt WEN Products, West Dundee, IL, Stati UnitiWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 mL di matracci di Erlenmeyer sconcertati www.sigmaaldrich.comCLS4450500
Brocche d'acqua da 5 galloni www.homedepot.comN/A
80 piedi di lunghezza, 0,5 " diametro, nylon https://facomex.mx/producto/combo/N/A
Una console centrale a V profonda 26 piedi Sailfish 2660 con due motori fuoribordo Yamaha da 150 CV.https://yamahaoutboards.com/N/A
Acetato di ammonio (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Acido borico (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Centrifuga 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Acido citrico (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Nitrato di cobalto(II) esaidrato [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Tubo flessibile in gomma resistente al collasso swanhose.comCELTF58050
Solfato di rame(II) pentaidrato (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Provette da centrifuga Corning da 50 mLwww.sigmaaldrich.comCLS430291
Fosfato dipotassico (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Acido etilendiamminotetraacetico disodico (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume e spettrofotometro e florometrowww.denovix.comN/A
Nastro adesivo www.homedepot.comN/A
Provette Eppendorfwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Etanolowww.sigmaaldrich.com64175
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Citrato ferrico di ammonio (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Tubi in PVC blu Flex-plus www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Agitatore per incubatore impilabilewww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Microscopia elettronica Microscope_Transmission elettronica da banco (TEM)delongamerica.comN/A
Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Cloruro di manganese (II) tetraidrato (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Ancora a fungo rivestita in vinile nero/30 libbrewww.homedepot.comN/A
Piastre di Petri in polistirolowww.sigmaaldrich.comP5481
Tazza filtrante a membrana in polietersulfone (PES) con 0,22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Coppa del filtro a membrana in polietersulfone (PES) con 0,45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Potassio etil xantogenato (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Carbonato di sodio (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Sodio dodecil solfato [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Molibdato di sodio diidrato (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Nitrato di sodio (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(idrossimetil)metil]-2-amminoetanosolfonico (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100 www.sigmaaldrich.comT8787
Trizma cloridrato (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Pompa a vuoto/pressione Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, Stati UnitiEW-79204-00
Tubi in vinile www.homedepot.comN/A
Solfato di zinco eptaidrato (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

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