Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Sommario

Questo protocollo combina la chiarificazione ottica e l'immunomarcatura per l'imaging confocale a volume completo di organoidi retinici a montaggio intero. Preserva la struttura 3D, consentendo la visualizzazione dettagliata dei percorsi neuronali chiave, migliorando lo studio della maturazione retinica, l'organizzazione spaziale e le sue potenziali applicazioni nella modellazione delle malattie e nella medicina personalizzata.

Abstract

Gli organoidi retinici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane sono intricate strutture 3D che imitano la retina umana, offrendo una potente piattaforma per lo studio dello sviluppo retinico, dei meccanismi della malattia e delle potenziali strategie terapeutiche. Inoltre, poiché derivano dai pazienti, stanno diventando sempre più popolari in quanto sono molto promettenti come strumento per la medicina personalizzata. A differenza delle colture cellulari 2D convenzionali, gli organoidi retinici preservano l'architettura 3D nativa della retina, consentendo una rappresentazione più realistica e consentendo studi più rilevanti dal punto di vista fisiologico. Tuttavia, la loro complessità strutturale, l'elevata densità cellulare e la composizione diversificata presentano sfide significative per la caratterizzazione.

Per affrontare queste sfide e migliorare la nostra comprensione della maturazione degli organoidi retinici preservando il contesto 3D, abbiamo combinato metodi di chiarificazione ottica con l'immunomarcatura per visualizzare l'intera struttura degli organoidi a montatura intera con la microscopia confocale. Per questo, abbiamo impiegato un metodo di schiaritura compatibile con obiettivi a bassa e alta apertura numerica, facilitando l'imaging a pieno volume e catturando determinate regioni di interesse con risoluzione cellulare. Utilizzando questo approccio, abbiamo identificato la morfologia e la distribuzione in 3D dei tre principali percorsi neuronali responsabili della trasmissione dell'informazione visiva: fotorecettori a cono e bastoncello, cellule bipolari e ganglionari. I nostri risultati gettano maggiore luce sulle tecniche di visualizzazione per affrontare l'organizzazione spaziale delle cellule retiniche all'interno dell'organoide.

Introduzione

Organoidi retinici

Gli organoidi retinici sono strutture 3D complesse che imitano la retina umana, offrendo una preziosa piattaforma per lo studio dello sviluppo retinico, dei meccanismi della malattia e delle potenziali strategie terapeutiche¹. Mantengono la naturale architettura 3D della retina, dimostrano fedeltà trascrittomica e competenza funzionale, riproducendo la fototrasduzione e la connettività sinaptica². Inoltre, imitano da vicino lo sviluppo in vivo ^3,4, consentendo una rappresentazione più realistica rispetto alle colture cellulari piatte. In studi precedenti, Isla-Magrané et al. hanno stabilito un protocollo in due fasi per ottenere organoidi multioculari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) per modellare le caratteristiche cellulari dell'occhio umano in fase di sviluppo ^5,6. A causa della scarsità di tessuto fetale, la ricerca sullo sviluppo dell'occhio umano è stata limitata agli studi anatomici.

Gli organoidi retinici ottenuti con questo protocollo hanno mostrato una stratificazione adeguata e contenevano tutti i principali sottotipi di cellule retiniche, come i fotorecettori, le cellule bipolari, le cellule ganglionari, le cellule amacrine e orizzontali e la macroglia, insieme a caratteristiche morfologiche chiave e una corretta organizzazione spaziale e connessioni. I modelli di organoidi, sebbene rappresentino una potenziale soluzione, presentano una variabilità significativa, rendendo difficile ottenere risultati coerenti. Pertanto, vi è un urgente bisogno di impiegare una varietà di tecnologie avanzate in modelli umani più affidabili. Ad oggi, questi organoidi sono stati studiati solo utilizzando sezioni istologiche, poiché la loro complessa composizione cellulare, densità e dimensioni ostacolano la penetrazione della luce, con conseguenti scarse prestazioni di imaging ottico negli strati più profondi, limitando così un'analisi completa.

Imaging a montaggio intero

Le tecniche istologiche tradizionali, che comportano il sezionamento e la colorazione dei tessuti fissati, possono fornire informazioni dettagliate su regioni specifiche, ma non riescono a catturare l'architettura complessiva e le relazioni spaziali all'interno dell'intero organoide. Per superare questa limitazione, l'imaging a montatura intera emerge come uno strumento prezioso per lo studio degli organoidi retinici. L'imaging a montaggio completo consente la visualizzazione dell'intero organoide nella sua forma 3D intatta, preservando la distribuzione spaziale dei tipi di cellule e dei componenti della matrice extracellulare. Questo approccio è particolarmente utile per studiare la composizione cellulare all'interno e tra gli organoidi, fornendo una comprensione più completa dei loro processi di sviluppo e dell'organizzazione funzionale. Tuttavia, a causa della loro densità cellulare e compattazione, gli organoidi retinici sono opachi (Figura 1, non chiarita). L'opacità intrinseca dei campioni provoca la dispersione della luce, che ostacola la visualizzazione dettagliata delle strutture interne utilizzando la microscopia. Qui, le tecniche di pulizia ottica emergono come uno strumento potente.

Tecniche di schiarificatura ottica

La chiarificazione ottica si riferisce a trattamenti fisico-chimici che rendono trasparenti i campioni biologici spessi omogeneizzando i gradienti dell'indice di rifrazione (RI) del tessuto in modo che corrispondano a quelli dell'agente di pulizia e rimuovendo le sostanze che assorbono la luce⁷. Questi metodi riducono drasticamente la dispersione della luce e aumentano la trasparenza. Questa trasformazione ci consente di vedere attraverso l'intero organoide retinico, consentendo un'analisi completa della sua intricata organizzazione cellulare e morfologia attraverso tecniche di imaging a montatura intera. In pratica, ciò si ottiene impregnando il campione con una sostanza ad alta RI e rimuovendo lipidi e pigmenti.

Sono disponibili diversi metodi di chiarificazione, che differiscono in vari aspetti (ad esempio, grado di trasparenza, compatibilità con tecniche microscopiche, campioni e molecole fluorescenti, fattibilità, durata), ma nessuno si distingue come il miglior protocollo comune⁸. Sono classificati in quattro gruppi principali: (1) immersione semplice, (2) idrofobici a base di solventi organici, (3) a base di iperidratazione e (4) a base di trasformazione tissutale o inclusione di idrogel, come ben riassunto da Avilov et al⁷. Tutti i metodi includono una fase per la corrispondenza dell'RI, di solito immergendo il campione in una soluzione che corrisponde all'RI media del tessuto. Nei metodi idrofobici, i lipidi e l'acqua vengono rimossi immergendo il campione in una concentrazione crescente di solventi organici (come metanolo o propanolo).

Il protocollo presentato è un metodo ottimizzato che integra la chiarificazione ottica con l'immunomarcatura per facilitare la visualizzazione 3D a montaggio intero di organoidi retinici con microscopia confocale, consentendo l'imaging a volume completo preservando l'integrità strutturale. Questo approccio consente l'identificazione dei tipi chiave di cellule retiniche all'interno dell'organoide, fornendo ai ricercatori un potente strumento per studiare la maturazione e l'organizzazione spaziale degli organoidi retinici in un contesto fisiologicamente rilevante.

Protocollo

1. Preparazione di anticorpi secondari fluorescenti su misura

NOTA: Questo approccio funge da alternativa all'uso di anticorpi fluorescenti commerciali (vedere la discussione per i vantaggi della preparazione di anticorpi secondari fluorescenti). Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per coniugare i fluorofori agli anticorpi primari nel caso in cui sia necessario eseguire l'immunofluorescenza diretta e l'anticorpo primario fluorescente non sia disponibile in commercio. Il controllo del rapporto fluoroforo/anticorpo regolando la quantità di fluoroforo nella reazione di marcatura produce anticorpi coniugati più luminosi. Tuttavia, gli anticorpi secondari su misura sono meno stabili e la concentrazione del coniugato risultante è 10 volte inferiore a quella degli anticorpi fluorescenti commerciali. Questo protocollo è adattato dal lavoro descritto da Bálint et al⁹.

1. Sciogliere 1 mg di fluoroforo in DMSO anidro e aliquotare in provette per ottenere un finale di 0,02 mg di fluoroforo per provetta. Rimuovere tutto il DMSO utilizzando un concentratore a vuoto di velocità, in funzione per 1 ora e 30 minuti. Conservare le aliquote a -20 ºC al riparo dalla luce. Per Alexa Fluor 405, l'H₂O ultrapuro è il solvente appropriato per la produzione di aliquote.
2. Per eseguire la reazione di marcatura, sciogliere un'aliquota del fluoroforo in 1-10 μL di DMSO (o H₂O ultrapuro per Alexa Fluor 405).
   NOTA: La quantità esatta di DMSO viene determinata attraverso precedenti test di coniugazione di controllo. Questi test vengono eseguiti quando si deve utilizzare un nuovo lotto di un fluoroforo (o quando si esaurisce un precedente lotto di fluoroforo) o quando un nuovo fluoroforo viene utilizzato per la prima volta nella coniugazione. Il test di coniugazione di controllo prevede l'esecuzione di reazioni di marcatura con quantità variabili di fluoroforo per determinare il rapporto ottimale fluoroforo/anticorpo nel coniugato. Nel nostro caso, il rapporto ottimale è tipicamente compreso tra 3 μl e 5 μl.
3. Incubare 50 μL di IgG secondarie (o primarie), 6 μL di 1 M NaHCO₃ e 1-5 μL di fluoroforo per 40 minuti a temperatura ambiente (RT) su una piattaforma oscillante, al riparo dalla luce.
4. Mentre la reazione è in corso, preparare le colonne di esclusione dimensionale di purificazione rimuovendo i coperchi e lasciando passare il tampone. Equilibrare la colonna (una per ogni reazione di marcatura) facendo scorrere 3 x 2-3 mL di PBS attraverso la colonna. Nel caso in cui l'ultima fase di equilibratura finisca prima della fine dell'incubazione, riposizionare i coperchi per evitare che si secchino e attendere che la reazione di marcatura finisca.
   NOTA: Le colonne di esclusione dimensionale di purificazione funzionano per gravità. Assicurarsi che la colonna non si asciughi in nessun momento, altrimenti la reazione di purificazione non funzionerà correttamente.
5. Al termine della reazione (passaggio 1.3), aggiungere 140 μL di PBS alla reazione di marcatura per rendere il volume di circa 200 μL e vorticarlo. Aggiungere questa soluzione al centro della colonna, lasciare che il campione entri nella colonna e, dopo che l'ultima goccia è stata eluita, spingere aggiungendo 550 μl di PBS. Quando il liquido smette di cadere, eluire aggiungendo 300 μL di PBS e raccogliere in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
6. Calcolare la concentrazione di anticorpi e i rapporti di marcatura misurando l'assorbanza del campione a 280 nm e l'assorbanza dei fluorofori utilizzati. Applicare la legge di Beer-Lambert per determinare la concentrazione (in molarità) come segue:
   
   Dove A sta per l'assorbanza, ε per il coefficiente di estinzione molare e CF₂₈₀ è una misura dell'assorbanza che il fluoroforo specifico ha a 280 nm che funge da fattore di correzione. Quindi, la concentrazione dell'anticorpo è:
   
   E il rapporto di etichettatura è:
   
7. Conservare gli anticorpi marcati a 4 ºC, al riparo dalla luce, per un massimo di 6 mesi.

2. Marcatura in immunofluorescenza

1. Fissare gli organoidi con paraformaldeide (PFA) al 4% a RT per 45 minuti.
   NOTA: FACOLTATIVO: Incubare gli organoidi con una soluzione di recupero dell'antigene (fasi 2.2 e 2.3) per migliorare l'immunoreattività degli antigeni.
2. Preparare 40 mL di soluzione per il recupero dell'antigene mescolando 0,117 mg di citrato di sodio tribasico diidrato in H₂O ultrapuro e regolare a pH 9.
3. Incubare gli organoidi con la soluzione di recupero dell'antigene agitando lievemente (30 giri/min) a 60 °C per 1 ora.
4. Permeabilizzare gli organoidi con PBST (PBS con Triton X-100 all'1%) agitando leggermente a RT per 4 ore.
5. Bloccare gli organoidi con una soluzione bloccante (albumina sierica bovina (BSA) al 2% con Triton X-100 allo 0,1%) a RT per una notte (o per 1 giorno).
   NOTA: Le concentrazioni di anticorpi primari e secondari dipendono dall'anticorpo specifico. Per l'immunofluorescenza di campioni a montaggio intero, utilizziamo una concentrazione più elevata rispetto ai campioni sezionati. Incubiamo l'anticorpo primario a 10 μg/mL che, nella maggior parte dei casi, corrisponde a 1:100 dal magazzino (Tabella 1). Incubiamo i nostri anticorpi secondari su misura a 20-50 μg/mL.
6. Incubare gli organoidi con gli anticorpi primari diluiti in soluzione di lavaggio (0,1% BSA con 0,1% Triton X-100) a 4 °C per 2 giorni agitando leggermente.
7. Lavare gli organoidi per 3 x 15 minuti in soluzione di lavaggio agitando leggermente a RT.
8. Incubare gli organoidi con gli anticorpi secondari diluiti in soluzione di lavaggio a 4 °C per 2 giorni agitando leggermente.
9. Lavare gli organoidi per 3 x 15 minuti in soluzione di lavaggio agitando leggermente a RT.
   NOTA: Dopo l'immunomarcatura, i coloranti fluorescenti di scelta possono essere incubati. Normalmente utilizziamo marcatori di nuclei fluorescenti, come DAPI (1:1.000) e DRAQ5 (1:500), o falloidina (1:100) per visualizzare la rete di filamenti di actina.
10. Incubare gli organoidi con i coloranti fluorescenti diluiti in soluzione di lavaggio a RT per 1 ora agitando leggermente.
11. Lavare gli organoidi per 3 x 15 minuti in soluzione di lavaggio agitando leggermente a RT.

3. Pulizia ottica con FluoClear BABB

NOTA: L'1-propanolo potrebbe compromettere i contenitori di plastica, in particolare per l'esposizione a lungo termine. Per sicurezza, usa contenitori di vetro.

1. Fase di disidratazione
   1. Preparare soluzioni di 1-propanolo in H₂O ultrapuro alle percentuali indicate (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) e quindi regolare a pH 9,5 con trimetilammina.
      ATTENZIONE: La trietilammina è tossica se inalata. Lavorare sotto una cappa aspirante. Le soluzioni possono essere riutilizzate se conservate correttamente (contenitore ben sigillato). Regolare il pH prima dell'uso.
   2. Incubare i campioni con il gradiente crescente di soluzioni di 1-propanolo (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) per 2 ore ciascuno a 30 °C con lieve agitazione.
   3. Incubare i campioni con 100% 1-propanolo per una notte a 30 °C con una leggera agitazione.
2. Passaggio di compensazione
   ATTENZIONE: BABB è una potente miscela di solventi nota per la sua capacità di dissolvere o danneggiare in modo significativo molte materie plastiche. Per sicurezza, utilizzare contenitori di vetro con coperchi compatibili e lavorare all'interno di una cappa aspirante.
   1. Preparare il BABB mescolando l'alcol benzilico (BA) e il benzoato di benzile (BB) in un rapporto 1:2.
   2. Immergere i campioni in BABB a RT durante la notte.
   3. Prima dell'imaging, aggiornare il BABB.
      NOTA: Per organoidi di ~1 mm di diametro, BABB induce un effetto di chiarificazione che è evidente in decine di minuti. A seconda delle dimensioni e della natura del campione, il grado di chiarificazione potrebbe essere diverso e/o richiedere un tempo di esposizione più lungo alla soluzione di chiarifica. Si consiglia di acquisire immagini prima e dopo l'immersione BABB per migliorare il protocollo di chiarificazione.
   4. Conservare i campioni chiariti BABB con la soluzione BABB a lungo termine a 4 °C. Proteggere dalla luce per preservare la fluorescenza.

4. Acquisizione di immagini a montaggio intero

1. Utilizzando una pipetta di vetro, posizionare l'organoide in una capsula di Petri con fondo di vetro con una goccia di BABB. Assicurarsi che il campione entri in contatto con la superficie del vetro di copertura.
   ATTENZIONE: Fare attenzione che la goccia di BABB contenente il campione non entri in contatto con i bordi in plastica del piatto, altrimenti scioglierà la plastica, compromettendo il campione e la qualità dell'imaging.
2. Utilizzando un microscopio a scansione laser confocale invertito dotato di obiettivi a basso e alto ingrandimento, è possibile acquisire immagini Z-stack per ottenere una visione 3D completa del campione con dettagli cellulari.
   NOTA: Per questo studio sono stati utilizzati un obiettivo ad aria con apertura numerica (NA) 10x e un obiettivo NA 1.4 63x, con una dimensione del passo rispettivamente di 3,5 μm e 1 μm.

5. Elaborazione delle immagini

1. Ricalibrare la dimensione del passo dell'acquisizione Z-stack considerando la mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) tra la soluzione di chiarificazione e il mezzo di immersione.
   1. Calcolare la dimensione del passo ricalibrata come segue:
      
      Per un campione incorporato in BABB, ripreso con un obiettivo ad aria con una dimensione del passo di 3,5 μm, sarà il seguente:
      
   2. Utilizzando ImageJ, modificare la profondità del voxel (fare clic su Immagine | Proprietà...) per la dimensione del passo ricalcolata.
2. Crea proiezioni di immagini dello Z-stack.
   1. Utilizzando ImageJ, ispezionare in profondità lo Z-stack (fare clic su Immagine | Pile | Viste ortogonali). Appariranno le viste XY, XZ e YZ dell'organoide retinico.
   2. Salvare le regioni di interesse desiderate (fare clic su File | Salva con nome...).
3. Crea un'animazione del rendering 3D dello Z-stack utilizzando il software di elaborazione (vedi la Tabella dei Materiali).
   1. Selezionare i canali da visualizzare abilitando le relative caselle di controllo.
   2. Regolare i piani Z per visualizzare l'interno del campione (abilitare Clipping nella casella di controllo).
   3. Registra l'animazione utilizzando l'editor di filmati (abilita Editor di filmati nella casella di controllo). Trascina e rilascia e ingrandisci e rimpicciolisci direttamente usando il mouse. Fare clic su Aggiungi per includere una clip diversa per l'animazione. Se si regolano i piani Z, abilitare l'opzione Clip piani ( fare clic su Impostazioni... | selezionare la casella Ritaglia piani ).

Risultati

Figura 1: Confronto tra tre metodi di compensazione. A sinistra: immagini in campo chiaro di campioni (A) non cancellati e (B-D) cancellati. A destra: Z-stack con viste ortogonali xz e yz di 90 organoidi retinici DIV colorati con il marcatore nucleare DRAQ5 (giallo) acquisito con un microscopio confocale a scansione laser dotato di un obiettivo d'aria 10x (RI = 1,00). (A) Organoide retinico non chiarito (N = 3). Gli organoidi retinici fissati con PFA non sono abbastanza trasparenti per la visualizzazione 3D. (B) organoide chiarificato con fruttosio/glicerolo (N = 3). (C) organoide chiarificato con ECi (N = 3). (D) Organoide FluoClear autorizzato con BABB (N = 3). Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: BF = campo chiaro; CLSM = microscopio confocale a scansione laser; RI = indice di rifrazione; PFA = paraformaldeide; ECi = cinnamato di etile; BABB = alcool benzilico/benzoato di benzile; DIV = giorni in vitro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Confronto dei metodi di chiarificazione ottica per studi di immunofluorescenza in organoidi neuroretinici

Qui, presentiamo i risultati di tre metodi di chiarificazione per dimostrare l'efficacia di FluoClear BABB nel rendere trasparenti gli organoidi retinici. Nella Figura 1, osserviamo organoidi retinici chiariti con fruttosio/glicerolo (Figura 1B), ECi (Figura 1C) e FluoClear BABB (Figura 1D). I metodi di chiarificazione testati sono stati scelti perché è stato dimostrato^{che tutti 10,11} sono compatibili con la colorazione in immunofluorescenza e preservano la fluorescenza dalle proteine endogene (ad esempio, GFP presente nelle GCaMP).

Il fruttosio/glicerolo¹² è un protocollo di chiarificazione per immersione semplice e non tossico che non richiede disidratazione, riducendo significativamente il tempo di lavorazione rispetto ad altri metodi. È stato riportato che è efficace per la trasparenza di organoidi derivati da vari tessuti: vie aeree, reni, fegato e cancro al seno umano¹².

ECi (Ethyl Cinnamate)¹¹ è un aroma alimentare e additivo approvato dalla FDA per cosmetici^13,14, è considerato innocuo e ha dimostrato di essere un eccellente reagente di pulizia per i tessuti dei mammiferi. È noto per la sua rapida capacità di schiarimento e la minima distorsione dei tessuti. È classificato come metodo di chiarificazione idrofobica, ma rispetto ai solventi a base di BABB, non è tossico e preserva la fluorescenza dalle proteine fluorescenti più a lungo (fino a 14 giorni). Come è comune nella maggior parte dei protocolli di clearing, l'ECi richiede una fase di disidratazione precedente. Per ottenere risultati ottimali, questa fase si ottiene immergendo il campione in soluzioni con concentrazioni di alcol progressivamente crescenti. Poiché l'ECi non è dannoso, una volta che il campione è stato eliminato, può essere manipolato in modo sicuro e conservato in contenitori di plastica. Tuttavia, le fasi di disidratazione vengono eseguite utilizzando l'1-propanolo, un solvente organico che deve essere manipolato sotto una cappa aspirante e conservato in contenitori di vetro.

FluoClear BABB¹⁰ è una variante di un protocollo idrofobico basato su alcol benzilico/benzil benzoato (BABB) come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. È noto per essere molto tossico e corrosivo, quindi deve essere maneggiato con cura. FluoClear BABB è stato descritto come una versione migliorata che preserva meglio GFP e RFP rispetto alle versioni precedenti e consente l'uso di 1-propanolo o terz-butanolo come agenti di disidratazione.

Per valutare le prestazioni dei tre metodi di chiarificazione, abbiamo analizzato i piani Z con un microscopio confocale dotato di un obiettivo ad aria NA0.4 10x, che fornisce un ampio campo visivo (FoV) di 2,5 x 2,5 x 2,56 mm per catturare l'intero volume dell'organoide retinico. Abbiamo utilizzato organoidi retinici in uno stadio intermedio di maturazione (90 giorni in vitro (DIV)) che contengono tutti i neuroni retinici (cellule ganglionari, cellule bipolari e fotorecettori), raggiungendo la densità cellulare e la compattazione e quindi essendo opachi. Come spiegato nell'introduzione, la chiarifica ottica si ottiene quando l'RI viene abbinato su tutto l'oggetto da riprendere. Pertanto, i mezzi di immersione utilizzati per l'imaging avranno un impatto drastico sulla trasparenza ottenuta. La tabella 2 descrive in dettaglio l'indice recitazionale dei mezzi di immersione e le soluzioni di chiarificazione testate.

	Soluzione	Indice di rifrazione
Mezzi di immersione	Aria	1
	Acqua	1.33
	Glicerolo	1.45
	Olio	1.51
Soluzioni di compensazione	Fruttosio/Glicerolo	1.468
	Eci	1.558
	FluoClear BABB	1.56

Tabella 2: Indice di rifrazione (RI) dei mezzi di immersione più utilizzati per la microscopia ottica e le metodologie di chiarificazione ottica testate per la chiarificazione di organoidi retinici. Abbreviazione: RI = indice di rifrazione.

Confrontando le immagini confocali risultanti (Figura 1, pannello a destra), il trattamento con fruttosio/glicerolo ha portato al minimo miglioramento della trasparenza, limitando la visualizzazione degli strati retinici e impedendo la visualizzazione del nucleo dell'organoide. ECi ha ottenuto una migliore trasparenza, consentendo la visualizzazione degli strati retinici, ma ancora una visualizzazione limitata del nucleo dell'organoide retinico a causa della diffusione della luce che ostacolava il rilevamento della fluorescenza dalle parti interne del campione. FluoClear BABB ha fornito il massimo miglioramento in termini di trasparenza, consentendo una chiara visualizzazione sia del nucleo che della corteccia dell'organoide retinico a una risoluzione più elevata con un'intensità di fluorescenza simile.

Vale la pena ricordare che entrambi i protocolli ECi e FluoClear BABB hanno indotto un notevole restringimento del campione, come illustrato dalle corrispondenti immagini in campo chiaro di ciascun organoide retinico cancellato (Figura 1, pannello a sinistra). Il restringimento del campione è dovuto alle precedenti fasi di disidratazione che rimuovono l'acqua, e questo è il motivo per cui il protocollo Fruttosio/Glicerolo non riduce il campione. Questo restringimento, tuttavia, rappresenta un'opportunità unica per un'esplorazione più approfondita. Sebbene comprima le dimensioni complessive dell'organoide e potenzialmente sottovaluti le distanze interne, aumenta anche la compattezza. Questa compattezza isotropa, relativamente uniforme in tutte le direzioni, ci consente di sfruttare obiettivi ad alto ingrandimento con un potere risolutivo superiore (a causa del loro NA più grande) che altrimenti immaginerebbero solo lo strato cellulare più esterno a causa delle loro distanze di lavoro (WD) più brevi. Ad esempio, un obiettivo pneumatico 10x NA 0,4 offre un WD di 2,53 mm, mentre un obiettivo a olio 63x NA 1.4 con una risoluzione significativamente migliore ha un WD di soli 0,14 mm. Utilizzando organoidi più compatti e autorizzati con BABB, possiamo superare efficacemente questa limitazione e ottenere immagini ad alta risoluzione di strutture più profonde, come lo strato di cellule gangliari situato all'interno dell'organoide (Figura 2).

Figura 2: Ricostruzioni 3D di un organoide retinico (200 DIV) purificato con FluoClear BABB ripreso con un microscopio confocale a scansione laser. Il microscopio era dotato di un obiettivo ad aria (A) 10x NA 0.4 e (B) di un obiettivo ad olio 63x NA 1.5. La chiarificazione e l'imaging consentono la visualizzazione dell'intero organoide e, allo stesso tempo, l'immagine con dettagli precisi di alcune regioni di interesse. DRAQ5 (nuclei), opsina B+GR (coni) e TUJ1 (neuroni). Abbreviazioni: DIV = giorni in vitro; BABB = alcool benzilico/benzoato di benzile; NA = apertura numerica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In conclusione, la nostra scelta per il clearing è ricaduta su FluoClear BABB in quanto offriva una visualizzazione superiore dell'intero organoide retinico con un'alta risoluzione e un rapporto segnale/rumore. È importante sottolineare il restringimento indotto da BABB, compattando isotropicamente l'organoide. Questa compattezza ci ha permesso di sfruttare obiettivi ad alto ingrandimento per l'esplorazione dettagliata di strutture più profonde. Infine, la compatibilità di BABB con gli obiettivi a immersione in olio ha garantito una dispersione minima della luce e immagini di alta qualità in tutti gli ingrandimenti.

Identificazione e distribuzione spazio-temporale delle cellule retiniche all'interno degli organoidi durante la maturazione

Seguendo la metodologia qui descritta, e impiegando l'imaging whole-mount su organoidi immunomarcati con gli anticorpi specifici descritti nella Tabella 1, abbiamo studiato come la neuroretina viene modellata da organoidi in diversi punti di maturazione, dai primi stadi di sviluppo (40 DIV) a stadi più maturi (fino a 250 DIV), esibendo una struttura 3D ben definita. Questo approccio ci ha permesso di visualizzare la formazione e l'organizzazione delle varie componenti retiniche descritte in questa sezione.

Anticorpo	Specificità	Obiettivi	Posizione in Retina	[ ]finale (diluizione)	Ospite	#RRDI
Anti-GFP	Valentina	Valentina	Celle GCaMP6s-positive	10 μg/mL (1:1.000)	Ch	AB_300798
Chx10	Omeobox 2 dell'ipotalamo ventromediale (Vsx2)	Fattore di trascrizione	Neuroblasti e cellule bipolari	10 μg/mL (1:2)	Ms	AB_10842442
Opsina B	Blu Opsin	Segmento esterno dei coni blu	Coni blu	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_177457
Opsin RG	Opsina verde e rosso	Segmento esterno dei coni verdi e rossi	Coni verdi e rossi	10 μg/mL (1:100)	Ch	AB_11213279
RECUPERO	Recupero	Proteina legante il calcio	Fotorecettori	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_2253622
RHO (RET-P1)	Rhodopsin	Segmento esterno delle aste	Aste	63 μg/mL (1:100)	Ms	AB_260838
TUJ1	Beta-tubulina di classe III neurone-specifica	Isoforma della tubulina beta-III	Neuroni	50 μg/mL (1:200)	Ms	AB_2315514

Tabella 1: Anticorpi primari testati in organoidi retinici provenienti da diversi stadi di maturazione. Abbreviazioni: pollo = ch; Topo = Ms; Coniglio = Rb.

L'immunomarcatura con diversi marcatori ha permesso l'identificazione delle cellule conformi a questa struttura stratificata. TUJ1 è una beta-tubulina di classe III neurone-specifica (Tabella 1), tipicamente utilizzata in campioni sezionati per marcare le cellule gangliari retiniche (RGC)¹⁵ a causa della sua abbondanza. TUJ1 è presente in tutti i neuroni retinici¹⁶ e fin dalle prime fasi del differenziamento neurale¹⁷. L'espressione di TUJ1 è stata riscontrata in tutti gli stadi di maturazione nella corteccia dell'organoide, consentendo il follow-up dell'organizzazione delle cellule retiniche in strati. Nella Figura 3, possiamo osservare che nelle prime fasi di sviluppo (40 DIV), TUJ1 è distribuito uniformemente in un unico strato sottile e uniforme. A partire da 90 DIV, la regione apicale dell'organoide diventa più densa e compatta, poiché si popola di molte più cellule che si accumulano nella regione apicale. A 170 DIV, l'organoide retinico ha acquisito una struttura retinica stratificata in 3D con uno strato apicale discreto. A 200 DIV, possiamo vedere che ci sono altri corpi cellulari che estendono lunghe proiezioni, che sono molto meno numerose, che si trovano più in profondità all'interno dell'organoide. Infine, a 250 DIV, è evidente la struttura in tre strati nucleari, corrispondenti a: (1) lo strato nucleare esterno (ONL) conformato da fotorecettori maturi, (2) lo strato nucleare interno (INL) popolato principalmente da cellule bipolari e (3) lo strato di cellule gangliari (GCL) formato da RGC, come indicato in Figura 3 (in basso a destra).

Figura 3: Organizzazione neuronale dopo la maturazione degli organoidi retinici in una struttura stratificata a strati. Proiezioni Z-stack di immagini confocali di organoidi retinici FluoClear BABB colorati con TUJ1. A 40 DIV, non si formano strutture stratificate. A partire da 170 DIV, la neuroretina si stratifica in strati. Sono indicati gli strati nucleari retinici: ONL, INL e GCL (punte di freccia gialle). Barre di scala = 25 μm (sinistra) e 10 μm (destra). Abbreviazioni: BABB = alcool benzilico/benzil benzoato; DIV = giorni in vitro; ONL = strato nucleare esterno, INL = strato nucleare interno; GCL = strato di cellule ganglionari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Con questa metodologia, potremmo anche riportare l'assemblaggio di fasci di assoni. Come si vede nelle regioni ingrandite (Figura 4), abbiamo osservato fasci di fibre che si estendono dal nucleo interno dell'organoide verso la periferia, proiettandosi verso regioni distanti (fino a 1 mm). È interessante notare che la formazione di queste fibre è avvenuta in diverse fasi di maturazione. Man mano che l'organoide cresce, le fibre si ispessiscono, diventano più complesse e raccolgono più proiezioni cellulari (Figura 4 [250 DIV] e Video Supplementare S1). Le RGC sono le prime cellule a differenziarsi durante lo sviluppo retinico e, quindi, possono organizzare le loro proiezioni fin dalle primissime fasi di sviluppo. Le RGC possono avviare l'estensione dei neuriti anche prima di stabilire la loro posizione finale all'interno dell'organoide. I nostri risultati sono in linea con i precedenti rapporti¹⁸ che dimostrano la formazione di una struttura simile al nervo ottico in co-colture di organoidi retinici e cerebrali.

Figura 4: Assemblaggio di proiezioni neuronali a vari stadi di maturazione. Le fibre si estendono dai piani interni dell'organoide retinico verso la periferia. La formazione di queste fibre è avvenuta in diversi stadi di maturazione, da 40 DIV al punto di maturazione più vecchio studiato (250 DIV). Barre di scala = 25 μm (riga superiore) e 100 μm (riga inferiore). Abbreviazioni: DIV = giorni in vitro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel sito apicale degli organoidi retinici, alcuni fotorecettori maturano in bastoncelli, che contengono rodopsina nei segmenti esterni per rilevare la visione monocromatica in condizioni di scarsa illuminazione, mentre altri maturano in coni, che esprimono opsine blu, verdi e rosse e sono responsabili del colore e della visione ad alta acuità in condizioni di luce intensa. La Figura 5 (in alto) illustra la popolazione di fotorecettori a cono all'interno dell'organoide retinico che esprimevano opsine blu e/o verdi/rosse (OPSINA B e GR, Tabella 1). Queste cellule presentano una morfologia allungata con le diverse opsine distribuite in tutto il corpo cellulare, escluso il nucleo. In particolare, la punta esterna di queste cellule appare più luminosa, potenzialmente simile al segmento esterno del fotorecettore contenente i dischi. Per visualizzare sia i coni blu che quelli verde/rosso utilizzando un singolo canale per la rilevazione della fluorescenza, gli anticorpi secondari contro l'opsina blu (OPSIN B, coniglio) e l'opsina verde/rossa (OPSIN GR, pollo) sono stati marcati con lo stesso fluoroforo, ottimizzando l'uso del canale e semplificando il processo di imaging evitando la sovrapposizione spettrale. Un sottogruppo di cellule fotorecettrici nella Figura 5 (in basso) esprimeva rodopsina (RHO, Tabella 1 e Video Supplementare S2), indicando inequivocabilmente la loro identità come bastoncelli. Questi bastoncelli condividono la morfologia allungata precedentemente descritta, con il nucleo posizionato centralmente e il corpo cellulare ricco di opsina orientato verso la periferia dell'organoide.

Figura 5: Organoidi retinici provenienti da fasi successive di sviluppo. Parte superiore: coni maturi, parte inferiore: bastoncelli. Proiezione Z di immagini confocali di organoidi retinici FluoClear BABB-cleared colorati con TUJ1 (neuroni), DRAQ5 (nuclei), opsina-B+GR (coni) e RHO (bastoncelli). I disegni schematici sono mostrati come riferimento. Barre della scala = 100 μm (sinistra) e 10 μm (destra). Abbreviazioni: DIV = giorni in vitro; BABB = alcool benzilico/benzil benzoato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le cellule bipolari e la loro distribuzione spazio-temporale sono state identificate tracciando l'espressione di Chx10 (nota anche come Vsx2) su 250 DIV di maturazione (Figura 6). Chx10 (Tabella 1) è un fattore di trascrizione critico per la proliferazione delle cellule progenitrici e la determinazione delle cellule bipolari nella retina in via di sviluppo^19,20. Come gene omeobox, è espresso nelle prime fasi di sviluppo nei neuroblasti e nella retina matura si trova esclusivamente nelle cellule bipolari. La Figura 6 mostra la distribuzione delle cellule Chx10-positive all'interno dell'organoide in via di sviluppo. Inizialmente, si osservano numerose cellule Chx10-positive che si estendono dalla periferia neuroretinica verso il centro. Man mano che l'organoide matura, queste cellule diventano meno abbondanti e si trasferiscono nell'INL, dove risiedono le cellule bipolari.

Figura 6: Espressione di Chx10 su 250 DIV di maturazione. Immagini confocali a proiezione Z di un organoide retinico FluoClear BABB colorato con DRAQ5 (nuclei) e Chx10 (neuroblasti e cellule bipolari mature). Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: DIV = giorni in vitro; BABB = alcool benzilico/benzil benzoato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Infine, dimostriamo che la GFP endogena dei marcatori di calcio GCaMP viene preservata dopo la purificazione con questa metodologia. Nella Figura 7, possiamo osservare la neuroretina di 70 organoidi retinici DIV infettati con Ad5-CMV-GCaMP6 e immunomarcati con anti-GFP (Tabella 1) per migliorare la fluorescenza dopo la fissazione a lungo termine.

Figura 7: GCaMP endogena conservata nel metodo di clearing FluoClear BABB. Un organoide retinico di 70 DIV infettato con Ad5-CMV-GCaMP6s immunomarcato con anti-GFP (cellule che esprimono GCaMP), Chx10 (neuroblasti e cellule bipolari in stadio iniziale) e DRAQ5 (nuclei). Barre di scala = 100 μm (sinistra) e 25 μm (destra). Abbreviazioni: BABB = alcool benzilico/benzil benzoato; DIV = giorni in vitro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare S1: Ricostruzione 3D di un organoide retinico che presenta un assemblaggio di proiezioni neuronali. Proiezione Z di immagini confocali di organoidi retinici FluoClear BABB-cleared a 250 DIV colorati con TUJ1 (neuroni) rappresentati in viola e DRAQ5 (nuclei) in giallo. Abbreviazioni: BABB = alcool benzilico/benzil benzoato; DIV = giorni in vitro. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare S2: Ricostruzione 3D dei bastoncelli allineati sulla superficie di un organoide retinico nelle ultime fasi di sviluppo (200 DIV). Proiezione Z di immagini confocali di organoidi retinici FluoClear BABB-cleared a 200 DIV colorati con RECOV (fotorecettori) rappresentati in verde e RHO (bastoncelli) in viola. Abbreviazioni: DIV = giorni in vitro; BABB = alcool benzilico/benzil benzoato. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Il protocollo qui descritto facilita lo studio della distribuzione spazio-temporale delle cellule che formano l'organoide retinico nei diversi stadi di maturazione, preservandone la naturale architettura 3D, aspetto critico per la comprensione di questi modelli nell'ambito della futura medicina personalizzata. Fornisce una visione dettagliata dell'architettura retinica a livello di strati distinti e singoli tipi di cellule, consentendo la visualizzazione delle strutture subcellulari preservando il contesto 3D globale.

L'alternativa all'imaging a montaggio intero è la post-elaborazione del campione per l'esecuzione di imaging su sezioni convenzionali (paraffinate o crioconservate). Mentre il sezionamento fornisce informazioni preziose sulla localizzazione di proteine e strutture, questi dati sono limitati a un singolo piano, limitando la comprensione delle connessioni cellulari spaziali. Di conseguenza, caratteristiche come la proporzione di coni e bastoncelli o la formazione di fasci assonali in regioni specifiche potrebbero non essere rappresentate in modo accurato, complicando l'interpretazione in tre dimensioni. Gli organoidi retinici sono altamente eterogenei, con regioni diverse che potenzialmente contengono diversi tipi di cellule e/o che mostrano vari gradi di complessità e differenziazione. L'imaging a montaggio intero risolve questo problema in quanto consente di analizzare i gradienti di eterogeneità a livello globale senza fare affidamento sulla selezione di un sottoinsieme di sezioni che potrebbero non rappresentare l'intero campione.

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM)21,22,23 potrebbe essere utilizzata come alternativa alla microscopia confocale a scansione laser. In LSFM, il campione viene illuminato con un sottile foglio di luce di pochi micron di spessore e tutta la fluorescenza generata dalla sezione ottica illuminata viene rilevata utilizzando una telecamera. LSFM è una tecnica di rilevamento basata su un ampio campo che rappresenta una strategia altamente efficiente per la visualizzazione rapida di grandi volumi (campioni su scala centimetrica) con effetti minimi di fotosbiancamento e fototossicità. Tuttavia, gli organoidi possono mostrare una significativa aberrazione sferica perché la luce che passa attraverso le superfici curve viene rifratta in modo diverso a seconda dell'angolo di incidenza. In questi esperimenti, questa distorsione ha prodotto una perdita di messa a fuoco, portando alla sfocatura e compromettendo la risoluzione delle strutture più profonde. Per l'imaging dei nostri organoidi retinici (circa 1 mm di diametro), la microscopia confocale a scansione laser si è rivelata l'approccio più efficace.

Questo protocollo è adattato alle nostre esigenze sperimentali. Può essere utilizzato come guida di partenza per i ricercatori che si avventurano nell'imaging a montaggio intero di organoidi retinici otticamente chiariti e dovrebbe essere adattato se questi differiscono. In questa sezione vengono descritti in dettaglio i passaggi critici, le modifiche e i limiti della metodologia.

Un passaggio critico è la decisione sul protocollo di compensazione. È necessario considerare molti criteri. Innanzitutto, considera la tipologia del campione. Eliminare le ossa non è la stessa cosa che eliminare il tessuto cerebrale, così come eliminare gli organoidi retinici differisce dall'eliminare gli organoidi gastrici, poiché ciascuno richiede un approccio distinto. Per visualizzare organoidi chiarificati di un tipo diverso, è essenziale esaminare la letteratura per identificare i protocolli che sono stati ottimizzati specificamente per il campione di interesse. Il fruttosio/glicerolo è un metodo di chiarificazione rapido e non tossico che si è dimostrato utile per eliminare organoidi derivati da diversi tessuti (organoidi tumorali delle vie aeree umane, del colon, dei reni, del fegato e della mammella e organoidi della ghiandola mammaria di topo)¹² ma non è stato adatto per rendere trasparenti gli organoidi retinici umani. Per quanto ne sappiamo, nessuno studio riporta l'applicazione di fruttosio/glicerolo al tessuto neurale/organoide. Pertanto, concludiamo che questo metodo di pulizia non è appropriato per chiarire i tessuti neurali. Sono necessarie ulteriori indagini per chiarire le ragioni alla base di questa incompatibilità.

Un altro fattore critico da considerare è il FoV richiesto, in quanto influisce direttamente sulla strategia di imaging e sulla scelta dei componenti ottici. I FoV di grandi dimensioni si ottengono in genere con obiettivi a basso ingrandimento, spesso progettati per l'uso senza mezzi di immersione (ad esempio, aria, RI = 1,00). Questi obiettivi presentano una maggiore discrepanza dell'RI durante l'imaging di campioni autorizzati da BABB (RI = 1,56), con conseguenti spostamenti nella messa a fuoco in profondità che devono essere corretti durante la post-elaborazione. Al contrario, gli obiettivi a immersione in olio (RI = 1,51) presentano una minore discrepanza dell'RI con soluzioni di chiarificazione come BABB (RI = 1,56) e, pertanto, non richiedono una ricalibrazione.

I metodi di immersione semplici di solito non raggiungono un'elevata trasparenza e non sono adatti per l'acquisizione di immagini di alta qualità di campioni a montaggio intero. I protocolli di pulizia dei tessuti influenzano l'efficace risoluzione attraverso il rigonfiamento o il restringimento dei campioni. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, il gonfiore o il restringimento possono essere utili. I protocolli che espandono il campione possono migliorare la risoluzione dei dettagli più fini nello stesso sistema ottico incapace di mostrare gli stessi dettagli prima. Il restringimento può essere desiderato per visualizzare campioni di grandi dimensioni che altrimenti non entrerebbero nella camera del campione o non si adatterebbero alle distanze di lavoro dell'obiettivo. Tuttavia, poiché il restringimento comprime il campione e può distorcere le distanze interne, questa tecnica non è adatta per la valutazione dimensionale o la misurazione precisa delle distanze intercellulari.

Un altro fattore importante da considerare è la compatibilità con le proteine fluorescenti. Per lo più protocolli basati su solventi organici estinguono le proteine fluorescenti poiché richiedono temperature elevate o degradano le proteine fluorescenti durante l'incorporamento con soluzioni di corrispondenza RI. Fortunatamente, la maggior parte dei metodi è compatibile con le tecniche di immunomarcatura. Tuttavia, la compatibilità di ciascun epitopo dovrebbe essere confermata sperimentalmente.

Inoltre, la penetrazione di grandi molecole di IgG attraverso il tessuto può essere ostruita, diminuendo l'efficienza di colorazione e limitando la visualizzazione della struttura mirata alla superficie del campione. La colorazione di campioni a montaggio intero con anticorpi potrebbe richiedere diversi giorni (o addirittura settimane), a seconda delle dimensioni e della natura del campione, aumentando sostanzialmente la durata del protocollo.

Infine, la compatibilità con lo strumento ottico è obbligatoria. La maggior parte dei metodi a base di solventi organici (ad eccezione dell'ECi) sono molto corrosivi e non sono chimicamente compatibili con le camere di campionamento e gli obiettivi di immersione commerciali. Inoltre, alcune soluzioni di clearing hanno un'RI che non corrisponde alla portata richiesta dagli obiettivi disponibili (solitamente acqua).

Ci sono alcuni passaggi nel protocollo che richiedono un'attenzione particolare. FluoClear BABB, come metodo di pulizia idrofobica, richiede una precedente fase di disidratazione. Il pH svolge un ruolo importante nel preservare la fluorescenza delle proteine endogene come la GFP. Quindi, è fondamentale assicurarsi che le soluzioni alcoliche abbiano il pH regolato correttamente. La disidratazione è la chiave per una completa pulizia. I risultati ottimali si ottengono incubando i campioni con un gradiente crescente di soluzioni alcoliche.

La dimensione del campione gioca un ruolo importante nel consentire agli anticorpi di raggiungere i loro obiettivi specifici. Gli anticorpi potrebbero non riuscire a penetrare in modo omogeneo e rimanere all'esterno del campione. In tal caso, prendere in considerazione il passaggio a un altro tipo di detersivo (Tween-20 o saponina), aumentando la concentrazione e il tempo di incubazione del detersivo e degli anticorpi. Se questi aggiustamenti sono insufficienti, strategie alternative possono migliorare la permeabilizzazione degli anticorpi. Per l'immunomarcatura a montaggio intero di campioni di grandi dimensioni (su scala centimetrica), i ricercatori hanno scoperto che la SDS può facilitare una penetrazione più profonda degli anticorpi²⁴. La SDS induce una perdita parziale della struttura terziaria degli anticorpi, linearizzando efficacemente la proteina e permettendole di penetrare più in profondità nel tessuto. Quindi, il lavaggio della SDS ripristina le proprietà di legame dell'antigene degli anticorpi, consentendo una colorazione più uniforme dei tessuti più spessi e riducendo il gradiente comunemente osservato di marcatura più forte sulla superficie del campione.

La preparazione dei propri anticorpi secondari fluorescenti offre diversi vantaggi, in quanto fornisce una maggiore flessibilità nella progettazione dell'immunomarcatura, consentendo la selezione della specifica combinazione fluoroforo-anticorpo secondario, aumentando il numero di colori che possono essere utilizzati nello stesso campione. Inoltre, il rapporto fluoroforo/anticorpo può essere regolato, in modo che siano generalmente più luminosi. Tuttavia, è necessario considerare alcuni aspetti. Gli anticorpi secondari su misura sono generalmente meno stabili di quelli disponibili in commercio e devono essere utilizzati freschi. La maggior parte mantiene la propria affinità con il ligando per 3-6 mesi a 4 °C, ma la stabilità deve essere determinata sperimentalmente, poiché alcune combinazioni potrebbero degradarsi più rapidamente. Inoltre, alcuni accoppiamenti anticorpo-fluoroforo possono alterare l'affinità dell'anticorpo per il suo epitopo, determinando una marcatura aspecifica parziale o completa. Per garantire l'affidabilità, si consiglia di testare prima gli anticorpi secondari su misura utilizzando controlli, come le cellule in coltura, prima di applicarli a campioni sperimentali.

Questo protocollo ottimizzato integra la pulizia ottica con l'immunomarcatura per facilitare l'imaging confocale di organoidi retinici a montaggio intero. Preserva l'integrità strutturale e consente l'identificazione dei principali tipi di cellule retiniche all'interno dell'organoide. Pertanto, il protocollo fornisce ai ricercatori un potente strumento per studiare la maturazione degli organoidi retinici e l'organizzazione spaziale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo 10x NA0.40 DRY	Leica	HC PL APO CS2	-
Obiettivo OLIO 63x NA1.40	Leica	HC PL APO CS2	-
anticorpo anti-GFP	Abcam	ab13970	-
Alcool benzilico (BA)	Sigma Aldrich	13162	-
Benzoato di benzile (BB)	Sigma Aldrich	W213802	-
piastra di Petri in vetro inferiore	MatTek	P35G-1.5-14-C	-
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	Codice: A7030	-
Anticorpo Chx10	Sta Cruz Biotech	SC-365519	-
Colonne di filtrazione su gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25	Sigma Aldrich	17-0853-02	-
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	-
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	-
DRAQ5	Thermofisher	62251	-
Colorante (acido carbossilico, estere succinimidilico)	Invitrogen o Abberior	-	-
ImmagineJ/Figi	NIH	v1.50i	-
Microscopio confocale a scansione laser invertito	Microsistemi Leica	TCS SP8 STED 3X-FALCON	-
Software di elaborazione 3D LAS X	Microsistemi Leica	-	-
mQ H2O	-	-	Acqua ultrapura dal sistema di depurazione dell'acqua Synergy
NaHCO3	Acros Organics	424270010	-
IgG secondarie non marcate	Jackson Immunoresearch	-	-
Anticorpo blu Opsina	Milliporo	AB5407	-
Anticorpo Opsina RG	Millipore	AB5745	-
Paraformaldeide (PFA) 4%	Termo scientifico	J199943-K2	-
Soluzione PBS	Gibco	18912-014	-
Sonde per marcatura falloidina	Thermofisher	-	-
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	10010023	-
Anticorpo RECOV	Millipore	AB5585-I	-
Anticorpo RHO (RET-P1)	Sigma Aldrich	O4886	-
Citrato di sodio tribasico diidrato	Sigma Aldrich	Visualizzazione del materiale C8532	-
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	-
Anticorpo TUJ1	Covance	MMS-435P	-