Method Article

Microscopia elettronica a trasmissione come tecnica di visualizzazione per l'analisi della plasticità sinaptica circadiana nella corteccia del barile del topo

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presentato descrive l'uso della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per quantificare i cambiamenti circadiani nella corteccia del barile del topo, concentrandosi principalmente sul numero di sinapsi e sulla morfologia della spina dendritica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'esame della plasticità sinaptica circadiana richiede l'alloggiamento di topi in diverse condizioni di illuminazione (ciclo luce/buio, LD 12:12 e oscurità costante, DD), fornendo l'accesso alle ruote da corsa e sacrificandoli in quattro punti temporali definiti entro 24 ore, all'inizio e a metà del giorno/giorno soggettivo e all'inizio e al centro della notte/notte soggettiva. I cervelli vengono quindi fissati correttamente per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La corteccia cilindrica, con la sua precisa organizzazione somatotopica, fornisce un modello ideale per tale analisi. Per ottenere l'area cerebrale richiesta, i cervelli vengono tagliati tangenzialmente con un vibratomo, quindi le sezioni contenenti la corteccia del barilotto vengono selezionate e incorporate in resina Polybed. Dai blocchi preparati contenenti le canne selezionate, vengono tagliate sezioni ultrasottili consecutive. La densità sinaptica, eccitatoria e inibitoria, viene analizzata da micrografie elettroniche utilizzando il metodo del dissettore stereologico. Inoltre, le immagini TEM vengono utilizzate per le ricostruzioni 3D delle spine dendritiche. I cambiamenti nella forma delle spine dendritiche indicano il rimodellamento dei neuroni durante il giorno. Il numero di sinapsi eccitatorie raggiunge il picco durante il sonno (giorno) nei topi, mentre le sinapsi inibitorie raggiungono il picco durante la loro fase di attività (nel cuore della notte).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I ritmi circadiani sono generati dagli orologi circadiani in quasi tutti i processi di un organismo. Negli animali e nell'uomo, sono stati rilevati a livello molecolare, cellulare e dell'intero organismo, nonché nel loro comportamento. Il sistema circadiano di un organismo è costituito dall'orologio circadiano principale (pacemaker) e dagli orologi periferici. Tutti gli orologi circadiani generano oscillazioni circadiane attraverso l'espressione ciclica dei geni dell'orologio, che sono controllati dalle loro proteine. Il meccanismo molecolare dell'orologio genera ritmi circadiani con un periodo di ~1 giorno (più lungo o più breve di 24 ore), ma in condizioni giorno/notte, il periodo dei ritmi endogeni è sincronizzato a 24 ore. Molti ritmi circadiani sono stati rilevati nella fisiologia del sistema nervoso degli invertebrati e dei vertebrati; Tuttavia, alcuni studi hanno dimostrato che sono presenti anche nella plasticità sinaptica e neuronale, cioè cambiamenti nel numero e nella struttura delle sinapsi e dei dendriti 1,2,3,4.

La corteccia somatosensoriale del topo fornisce un sito eccellente per studiare la plasticità sinaptica durante il giorno grazie alla sua organizzazione ben definita e al collegamento diretto con l'attività locomotoria animale 5,6,7,8,9. Nello strato IV della corteccia somatosensoriale, ci sono strutture neurali distinte (barili) che sono molto evidenti anche in un cervello non colorato10,11. La loro disposizione rispecchia la morfologia e l'organizzazione dei baffi sul muso dell'animale, permettendo la mappatura precisa degli stimoli sensoriali. Le botti grandi sono organizzate in cinque file regolari, ciascuna contenente da quattro a sette botti. Le file di canne che corrispondono a grandi baffi sono contrassegnate da lettere maiuscole dalla A alla E e rappresentano i baffi disposti dalla zona degli occhi verso il basso lungo il muso. Ogni barilotto è costituito da due aree principali: la cavità, la parte centrale riempita di neuropil, e la parete chiamata lato, che è dominata dai corpi delle cellule stellate. I barili sono separati l'uno dall'altro da aree di minore densità cellulare, chiamate setti. Ogni canna riceve impulsi da uno specifico baffo situato sul lato controlaterale del muso dell'animale10,12.

La suddivisione in apposite botti, disposte in file regolari, permette una rapida e facile identificazione dell'area selezionata10,13. La selezione dei barili della fila B per l'analisi dei cambiamenti circadiani si basa su studi di plasticità dipendente dall'attività 14,15,16,17. La fila B è caratterizzata da confini somatotopici ben definiti e contiene solo quattro grandi barili distinti, semplificando la sua posizione nei campioni. A causa della sua posizione centrale, l'attività neuronale della fila B è correlata con i comportamenti naturali del topo come l'esplorazione ambientale e l'attività locomotoria. Per contare le sinapsi sulle spine dendritiche e sugli alberi, è importante selezionare le parti centrali dei fusti, dove i corpi cellulari sono radi 12,15,18.

L'immunoistochimica combinata con l'imaging al microscopio confocale è una tecnica che ha svolto un ruolo cruciale nel chiarire i meccanismi chiave della plasticità sinaptica nei topi. Sebbene l'utilizzo della microscopia confocale fornisca immagini ad alta risoluzione con una fluorescenza di fondo ridotta e una migliore chiarezza della struttura cellulare, soffre di fotosbiancamento e richiede una complessa preparazione del campione, che può modificare lo stato dei tessuti biologici. La sua dipendenza dai marcatori fluorescenti può limitare i tipi di proteine che possono essere studiate contemporaneamente a causa della loro sovrapposizione. La microscopia a immunofluorescenza confocale fornisce un mezzo per marcare proteine specifiche, i loro livelli di espressione e la localizzazione associati all'attività sinaptica utilizzando anticorpi per rilevare antigeni bersaglio in sezioni di tessuto fisse. Sebbene questo metodo offra specificità e flessibilità per studiare varie proteine coinvolte nella neurotrasmissione, è limitato dalla sua incapacità di fornire dati in tempo reale sui processi dinamici a causa della fase di fissazione coinvolta. L'incoerenza nel legame degli anticorpi potrebbe anche portare a risultati inaffidabili 19,20,21.

L'uso della microscopia elettronica al posto dei metodi di immunofluorescenza con la microscopia ottica consente una risoluzione significativamente più elevata e una maggiore precisione sia nella selezione della localizzazione che nella distinzione delle strutture neurali. Le sezioni di microscopia elettronica a trasmissione seriale (TEM) aiutano a visualizzare la struttura sinaptica a livello ultrastrutturale e hanno il vantaggio di essere utilizzate per studiare la formazione o l'eliminazione delle sinapsi. La TEM consente ai ricercatori di analizzare le proprietà fisiche delle sinapsi e i cambiamenti nella densità e nella struttura che sono chiamati plasticità delle sinapsi. Sebbene la preparazione dei campioni e l'imaging siano laboriosi, la TEM fornisce una comprensione più dettagliata dei cambiamenti che si verificano durante l'apprendimento, la formazione della memoria e l'elaborazione delle informazioni sensoriali e durante il giorno, l'anno e l'età degli animali.

Il nostro metodo mira a studiare le dinamiche circadiane della densità sinaptica e della morfologia utilizzando un approccio basato su un minimo di quattro punti temporali combinato con il metodo del dissettore stereologico basato su immagini TEM seriali. Il metodo del dissettore stereologico consente una stima affidabile dei numeri delle sinapsi anche quando si utilizzano solo alcune sezioni seriali ultrasottili 22,23,24,25,26. L'organizzazione somatotopica ben definita della corteccia del barile garantisce una precisa selezione anatomica delle sedi di studio, mentre la TEM seriale consente la differenziazione dei tipi di sinapsi (eccitatoria e inibitoria) e delle loro posizioni (sulle spine dendritiche e sulle aste). Questo metodo fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la neuroplasticità diurna e circadiana, consentendo l'esplorazione di come i fattori ambientali e interni influenzano le dinamiche sinaptiche. I singoli componenti del nostro metodo ne consentono l'applicazione per l'analisi dei cambiamenti di neuroplasticità in una gamma molto più ampia di studi, non necessariamente limitati ai cambiamenti circadiani.

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Protocol

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Tutte le procedure sperimentali che hanno coinvolto gli animali sono state approvate dall'apposito comitato etico istituzionale e condotte in conformità alla Direttiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo e del Consiglio sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici, nonché alle normative nazionali. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e per ridurre il numero di animali utilizzati.

1. Preparazione dei tessuti cerebrali

  1. Sacrifica i topi in quattro diversi punti temporali ogni 6 ore per un ciclo di 24 ore, sia in condizioni di luce/buio (LD 12:12) che di oscurità costante (DD) (Figura 1). In condizioni LD 12:12, fare riferimento all'ora Zeitgeber (ZT), dove ZT0 corrisponde all'inizio della fase di luce e ZT12 all'inizio della fase di buio. Nell'oscurità costante, fare riferimento al tempo circadiano (CT), dove CT0 rappresenta l'inizio del giorno soggettivo e CT12 denota l'inizio della notte soggettiva.
    NOTA: I punti temporali sono ZT0/CT0 (inizio del giorno, giorno soggettivo), ZT6/CT6 (metà del giorno, giorno soggettivo), ZT12/CT12 (inizio della notte, notte soggettiva) e ZT18/CT18 (metà della notte, notte soggettiva).
  2. Perfondere e fissare cervelli di topo con il 2,5% di glutaraldeide e il 2% di paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4).
  3. Estrarre ogni cervello dal cranio e lasciarlo in una soluzione fissativa (2,5% di glutaraldeide e 2% di paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4) per 24 ore a 4 °C.
  4. Per preparare il cervello per il sezionamento, tagliare il cervelletto e dividere il cervello in due emisferi (Figura 2A, B).
  5. Scegli una semisfera (destra o sinistra) e orientalo in modo che le sezioni siano tagliate tangenzialmente alla corteccia del barile. Montare l'emisfero selezionato sul mandrino del vibratomo e incollarlo saldamente (Figura 2C).
  6. Tagliare sezioni a 60 μm di spessore (velocità della sezione del vibratomo: 7,10 e frequenza: 5,00) (Figura 2D) e quindi trasferire le sezioni nella miscela di tampone fosfato 0,1 M e soluzione fissativa (rapporto 1:5).
  7. Esaminare le sezioni al microscopio ottico con ingrandimento 4x e raccogliere solo quelle con la corteccia del campo a barile visibile per il passaggio successivo (Figura 2E). Utilizzare la slitta concava per assicurarsi che la sezione rimanga costantemente nel liquido.

2. Fissazione e sezionamento del cervello

  1. Usa un pennello e trasferisci delicatamente i fazzoletti in una piccola capsula di Petri di vetro. Successivamente, sciacquare le sezioni cerebrali nel tampone cacodilato 0,1 M (BC, pH 7,4) per 3 x 5 minuti.
  2. Fissare le sezioni in tetrossido di osmio all'1% (OsO4) a 0,1 M BC con ferricianuro di potassio all'1,5% e lasciare a +4 °C per 1 ora.
    NOTA: Preparare la soluzione di OsO4 immediatamente prima dell'uso poiché OsO4 è instabile e la sua attività diminuisce nel tempo.
  3. Sezioni post-fissate in OsO4 all'1% in soluzione 0,1 M BC per 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Eseguire tutti questi passaggi indossando guanti protettivi e sotto la cappa aspirante con ventilazione ben funzionante poiché l'OsO4 è molto tossico.
    I rifiuti devono essere conservati in una bottiglia separata con un tappo ermetico. Evitare che il prodotto entri negli scarichi.
  4. Dopo il fissaggio, sciacquare le sezioni in acqua distillata per 2 x 5 minuti.
  5. Nella fase successiva, incubare sezioni cerebrali per 40 minuti nella soluzione di etanolo al 70% contenente l'1% di acetato di uranile. Dopo la miscelazione, utilizzare una siringa con filtro (25 mm) e versare lentamente 2 mL di soluzione in ciascuna capsula di Petri con i fazzoletti.
  6. Disidratare i tessuti in concentrazioni crescenti di alcol: etanolo al 70%, 80% e 90% per 5 minuti ciascuno e etanolo al 100%, 3 x 5 minuti ciascuno.
    NOTA: È possibile lasciare i fazzoletti in etanolo al 70% per una notte a +4 °C.
  7. Lavare i fazzoletti in ossido di propilene 2 x 10 min.
    NOTA: L'ossido di propilene è una sostanza chimica altamente corrosiva; Utilizzarlo con cautela indossando guanti protettivi e lavorando sotto la cappa aspirante. L'uso di un contenitore di vetro (piastra di Petri in vetro) è fondamentale per questo passaggio.
    L'ossido di propilene è un liquido e un vapore estremamente infiammabili. I rifiuti devono essere conservati in un contenitore di vetro separato e ben chiuso. Non lasciare che il prodotto entri negli scarichi; c'è il rischio di esplosione.
  8. Sostituire l'ossido di propilene con una miscela di resina Polybed e ossido di propilene (rapporto 1:1). Versare almeno 2 mL della soluzione in ciascuna capsula di Petri con le sezioni, coprire con un coperchio e incubare per 40 minuti.
  9. Infine, incorporare le sezioni cerebrali nella miscela di resina Polybed e ossido di propilene (rapporto 3:1). Utilizzare almeno 2 ml di miscela per capsula di Petri, coprirla e lasciare agire per 1,5 ore.
    NOTA: Assicurarsi che i tessuti siano completamente immersi e assicurarsi che non galleggino sopra il liquido.
  10. Tagliare la pellicola Aclar in pezzi delle dimensioni di un vetrino. Utilizzando una pipetta di plastica, applicare un piccolo volume di resina sulla pellicola Aclar e trasferire le sezioni cerebrali dalla capsula di Petri alla resina con un pennello. Incorporare ogni sezione tra due film di Aclar e incubare per 48 ore in un forno a 65 °C per polimerizzare.

3. Imaging e sezionamento della corteccia cilindrica

  1. Fotografare le sezioni cerebrali con un microscopio ottico con un ingrandimento dell'obiettivo 2x (Figura 2F).
  2. Raccogli tutte le immagini e importale nel software di grafica.
    1. Per aprire le immagini, fai clic su File |Apri e seleziona le immagini utilizzando Maiusc |Apri. Le immagini si apriranno in finestre separate.
    2. Inizia a impilare le immagini dalla corteccia (il pezzo più piccolo) e continua fino a quando tutte le sezioni sono allineate correttamente.
    3. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Layer 1 |Duplica il livello su ogni immagine. Nella finestra di dialogo, immettete il numero dell'immagine come nome, scegliete un'immagine come file di destinazione e fate clic su OK. Ripeti questi passaggi per tutte le immagini, duplicandole nello stesso file di destinazione.
    4. Allinea le immagini per ricostruire il campo del barile, garantendo il corretto ordine anatomico. Usa lo strumento Sposta per posizionare manualmente ogni livello, quindi fai clic su Modifica |Trasformazione |Ruota o Capovolgi per regolare l'orientamento, se necessario. Per ottimizzare l'allineamento, utilizzare Modifica | Trasformazione | Distorce e sposta gli angoli dell'immagine in modo che corrispondano alle strutture anatomiche in modo indipendente. Per facilitare l'allineamento, impostate il metodo di fusione del livello superiore su Sovrapposizione nel pannello Livelli .
    5. Confronta i punti di riferimento anatomici come i contorni dei cilindri e i vasi sanguigni per garantire il corretto posizionamento. Per salvare la pila, fare clic su File |Salva con nome, assegna un nome al file e scegli il suo formato (PSD o TIFF); quindi, fare clic su OK.
  3. Esaminare in sequenza le sezioni multiple contenenti il campo di barile, identificando i barili visibili in ciascuna sezione.
  4. Delinea manualmente ogni canna visibile su un ulteriore strato comune, garantendo la ricostruzione dell'intero campo della canna. Per creare un livello aggiuntivo, fare clic su Livello |Nuovo |Layer, assegna un nome al layer e fai clic su OK. Seleziona lo strumento Pennello dalla barra degli strumenti e sul nuovo livello, disegna manualmente ogni barilotto visibile.
    1. Per una maggiore precisione, utilizzare lo zoom e regolare le dimensioni del pennello in base alle esigenze. Per ingrandire e rimpicciolire l'immagine, utilizzare lo strumento Zoom o premere Ctrl + "+" / Ctrl + "-". Per modificare la dimensione del pennello, fai clic con il pulsante destro del mouse sulla tela mentre lo strumento Pennello è attivo e sposta il cursore Dimensioni .
  5. Identificare la canna selezionata in base a questa ricostruzione.
  6. Trova il barile selezionato al microscopio ottico in base al modello del campo del barile (cinque file, ciascuna con da quattro a sette barili) e alla disposizione dei vasi sanguigni che indicano la sua posizione all'interno del campo del barile.
  7. In ogni sezione con una corteccia a botte visibile, identificare la canna selezionata sotto uno stereomicroscopio e ritagliarla insieme a quella adiacente usando una lama di rasoio.
  8. Rimuovi il pezzetto dalla sezione, incollalo su un blocco di resina e mettilo via ad asciugare. Successivamente, taglia la resina in eccesso che circonda il tessuto.
    NOTA: Assicurati di posizionare il pezzo di tessuto sulla superficie della resina.
  9. Utilizzare un ultramicrotomo e un coltello diamantato per tagliare sezioni consecutive ultrasottili (3-6 sezioni, 65 nm di spessore) (Figura 3A) e raccogliere su griglie di nichel a fessura singola rivestite di formvar (2 x 0,75 mm).
  10. Una volta asciutti, confrontare i campioni con acetato di uranile al 2% per 3 minuti e citrato di piombo allo 0,03% per 1,5 minuti.
    NOTA: Per contrasto, è importante lavare le griglie alcune volte e lasciarle asciugare completamente dopo ogni passaggio. Utilizzare siringhe con filtri per acetato di uranile e citrato di piombo.
  11. Scattare immagini consecutive dall'incavo del cilindro selezionato (ad esempio, B2) con una tensione di accelerazione TEM (80 kV con ingrandimenti 4K o 8K, a seconda dell'area e del volume necessari per l'analisi.
    NOTA: Di solito, viene analizzato almeno un volume totale di 100 μm3 per animale.

4. Analisi delle immagini

NOTA: La creazione e l'allineamento di pile di immagini GST può essere eseguita allo stesso modo utilizzando sia software gratuiti (come GIMP) che commerciali (ad esempio, Photoshop). Anche le ricostruzioni possono essere eseguite allo stesso modo utilizzando sia software commerciali (ad esempio, 3D Studio Max) che programmi completamente gratuiti, come Blender.

  1. Per stimare la densità delle sinapsi, impilare un minimo di tre immagini TEM nel software di grafica (Figura 6). Maggiore è il numero di immagini seriali, maggiore è l'accuratezza dei calcoli.
    1. Per aprire le immagini, fai clic su File |Apri e seleziona le immagini utilizzando Maiusc |Aperto; Le immagini si apriranno in finestre separate.
    2. Per ogni immagine, fai clic con il pulsante destro del mouse su Livello 1 |Duplica livello. Nella finestra di dialogo, immettete il numero dell'immagine come nome, scegliete un'immagine come destinazione e fate clic su OK. Ripeti gli stessi passaggi per tutte le immagini e duplicale nella stessa destinazione.
    3. Per salvare la pila, fai clic su File |Salva con nome, assegna un nome al file, scegline il formato (PSD o TIFF) e fai clic su OK.
  2. Per allineare le immagini TEM, selezionate il livello superiore dell'immagine e impostate il metodo di fusione su Sovrapposizione nel pannello Livelli . Utilizzare Modifica |Trasformazione |Ruota o lo strumento Capovolgi per regolare l'orientamento dell'immagine. Utilizzare lo strumento Sposta per allineare le strutture.
    1. Per regolazioni più precise, utilizzare Modifica |Trasformazione | Distorci per spostare gli angoli dell'immagine in modo indipendente. Per aumentare la precisione, tieni premuto Ctrl e trascina i singoli punti d'angolo. Utilizzare le modifiche alle dimensioni e alla forma dei mitocondri e delle guaine mieliniche assonali tra le immagini TEM successive per verificare la corretta sequenza delle immagini.
  3. Utilizzare un metodo di dissezione per contare le sinapsi.
    1. Aggiungi un livello alla pila di immagini EM facendo clic su Livello |Nuovo |Strato |Va bene. Assicurati che il nuovo livello sia trasparente (senza riempimento dello sfondo).
    2. Per definire l'area di analisi, fare clic su Layer |Nuovo |Strato |Va bene; quindi seleziona lo strumento Rettangolo , vai su Livello |Stile livello |Traccia, impostare il colore, lo spessore (Dimensione) e la posizione del tratto (Interno consigliato), fare clic su OK e disegnare un rettangolo. Seleziona Riempimento: 0%. Contrassegna tutte le sinapsi presenti nelle immagini TEM che non attraversano due bordi selezionati adiacenti del rettangolo (ad esempio, la destra e il basso o l'alto e la sinistra).
    3. Aggiungere un nuovo livello per le annotazioni facendo clic su Livello |Nuovo |Strato |Va bene. Usa lo strumento Pennello per contrassegnare le sinapsi sul nuovo livello. Usa lo strumento Zoom e lo strumento Mano per una marcatura precisa.
    4. Scegli un colore per contrassegnare le sinapsi eccitatorie e uno diverso per le sinapsi inibitorie. Per modificare il colore, fare clic sulla casella del colore di primo piano nella barra degli strumenti, selezionare un colore nella finestra Selettore colore e fare clic su OK.
  4. Se le immagini TEM contengono strutture di grandi dimensioni (ad esempio, fibre nervose mielinizzate, dendriti di grandi dimensioni o parti del corpo cellulare), utilizzare una griglia con più quadrati. Ciò consente l'esclusione di eventuali piazze completamente occupate da strutture di grandi dimensioni.
    1. Aggiungere un nuovo livello trasparente facendo clic su Livello |Nuovo |Strato |Va bene. Abilita la visualizzazione griglia facendo clic su Visualizza |Mostra |Griglia e abilita l'aggancio alla griglia facendo clic su Visualizza |Aggancia a |Griglia.
    2. Impostare la spaziatura della griglia facendo clic su Modifica |Preferenze |Guide, griglia e sezioni. Seleziona lo strumento Linea , imposta la modalità su Forma o Pixel, imposta lo spessore della linea (ad esempio, 1 px) e disegna linee verticali e orizzontali lungo la griglia visibile per coprire l'intera area dell'immagine.
  5. Definisci le sezioni "superiore" e "inferiore" per ogni pila di immagini. Conta solo le sinapsi assenti nell'ultima immagine ma presenti nelle immagini precedenti. Ciò consente un'identificazione accurata delle sinapsi senza sovrastimarne il numero.
  6. Utilizzare la scala sull'immagine e calcolare il volume del campione (pila di immagini TEM). Misura l'area in cui vengono contate le sinapsi e moltiplica per il numero di immagini TEM nella pila e lo spessore delle sezioni ultrasottili.
  7. Dividi il numero di sinapsi per il volume per determinare la densità delle sinapsi per unità di volume.
  8. Utilizzare tutte le immagini TEM contenenti una spina dendritica (di solito 10-12 micrografie elettroniche consecutive) per ricostruire una spina dendritica e le sinapsi che forma.
    1. Aprire la pila di immagini nel software di grafica. Seleziona lo strumento Ritaglia , contrassegna l'area contenente il dorso dendritico nella pila e premi Invio. L'area selezionata verrà ritagliata in tutti i livelli visibili. Rendene visibile solo uno alla volta, nasconde gli altri livelli usando l'icona a forma di occhio nel pannello Livelli .
    2. Salva ogni immagine ritagliata separatamente facendo clic su File |Salva con nome, assegna un nome al file, scegli un formato (consigliato JPG) e fai clic su OK. Ripeti per ogni livello della pila.
      NOTA: Prima di trasferire le immagini a un software di ricostruzione 3D, è meglio contrassegnare gli elementi che vengono ricostruiti con i colori.
    3. Aggiungi un nuovo livello per l'annotazione facendo clic su Livello | Nuovo |Strato | Va bene.
    4. Impostate l'opacità del livello su 30-50% nel pannello Livelli .
    5. Seleziona lo strumento Pennello , scegli un colore diverso per ogni struttura (ad esempio, spina dendritica, sinapsi) e contrassegna gli elementi. Lavora solo sul nuovo livello per preservare l'immagine originale. Al termine, unisci il livello di annotazione con l'immagine, fai clic con il pulsante destro del mouse sul livello superiore e unisci Giù. Ripetere questi passaggi per ogni immagine TEM contenente una sezione trasversale della spina dendritica.
  9. Trasferisci le immagini TEM con sezioni trasversali visibili della spina dendritica al software di ricostruzione 3D. Per eliminare l'oggetto Cubo predefinito, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto ed eliminarlo. Per allineare la prospettiva del viewport prima di caricare le immagini, fai clic su Z sul Gizmo di navigazione o premi Numpad 7. Per caricare le immagini, fai clic su Aggiungi |Immagine |Riferimento, selezionare la prima immagine e fare doppio clic su di essa per confermare. Ripeti l'operazione per ogni immagine, assicurandoti che la prospettiva del riquadro di visualizzazione rimanga coerente per tutto il tempo.1
    NOTA: per ruotare la vista, tenere premuto il pulsante centrale del mouse e spostare il mouse oppure utilizzare il gizmo di navigazione. Per eseguire la panoramica della vista, tenere premuto Maiusc + pulsante centrale del mouse, spostare il mouse o utilizzare Sposta la vista.
  10. Disporre le immagini TEM alla distanza appropriata, tenendo conto dello spessore delle sezioni ultrasottili (Figura 4A). Per posizionare l'ultima immagine TEM lungo l'asse Z, fare clic sull'immagine, fare clic su Proprietà oggetto (barra laterale destra) e inserire il valore in Posizione Z. Le immagini possono ora essere distribuite tra la prima e l'ultima immagine. Per distribuirle, seleziona tutte le immagini, premi N per aprire il pannello N e fai clic sulla scheda Modifica (nel pannello N) | Dist Z.
    NOTA: Prima di effettuare qualsiasi regolazione, allineare la prospettiva del riquadro di visualizzazione e fare clic su Z sul gizmo di navigazione o premere il tastierino numerico 7.
    Lo strumento Distribuisci deve essere abilitato per distribuire le immagini. Per attivarlo, vai su Modifica | Preferenze | Ottieni estensioni, cerca "Distribuisci" e fai clic su Installa. Una volta abilitato, lo strumento Distribuisci rimane attivo tra le sessioni e non deve essere riattivato, purché venga utilizzata la stessa versione del programma.
  11. Delineare manualmente la forma della spina dendritica su ciascuna immagine utilizzando una singola curva per immagine TEM (Figura 4B, C).
    1. Assicurati che sia visibile solo la prima immagine TEM. Nella Raccolta scene, nascondere tutti gli altri oggetti utilizzando l'icona a forma di occhio . Per creare una curva base per il contorno, fare clic su Aggiungi |Curva |Cerchio. Sposta l'oggetto BézierCircle, tieni premuto G, muovi il mouse e fai clic per accettare le modifiche.
    2. Per far corrispondere le dimensioni del profilo della spina dendritica, ridimensionare l'oggetto, tenere premuto S, muovere il mouse e fare clic. Accedere alla scheda Modellazione con l'oggetto BézierCircle selezionato. Allineare nuovamente la prospettiva del riquadro di visualizzazione e fare clic su Z sul gizmo di navigazione o premere il tastierino numerico 7.
    3. Per regolare la forma della curva, selezionare un punto di controllo, tenere premuto G, spostare il mouse e fare clic.
    4. Per regolare la direzione e l'intensità delle maniglie, selezionare un punto della maniglia, premere G per spostare o S per scalare e fare clic per confermare. Ripeti per ogni punto.
    5. Per aggiungere un nuovo punto di controllo, selezionare due punti di controllo esistenti, tenere premuto Maiusc e fare clic su ciascun punto, fare clic con il pulsante destro del mouse, selezionare Suddividi. Quando la curva corrisponde sufficientemente al contorno del profilo della spina dendritica, accedere alla scheda Layout , fare clic con il pulsante destro del mouse sull'oggetto BézierCircle e sull'oggetto duplicato e fare clic senza muovere il mouse. Crea lo stesso numero di copie di BézierCircle quante sono le immagini GST utilizzate per la ricostruzione. Allineali con le immagini TEM disposte utilizzando lo strumento Distribuisci come al punto 4.10.
    6. Regolare ogni curva BézierCircle nella scheda Modellazione in modo che corrisponda al profilo della spina dendritica in ogni immagine. Assicurati che siano visibili contemporaneamente solo l'oggetto BézierCircle attualmente modificato e l'immagine TEM corrispondente.
      NOTA: tutte le azioni del tasto destro del mouse necessarie per determinati passaggi devono essere eseguite entro il limite della scena. Le curve successive devono corrispondere ai limiti di sezioni consecutive della spina dendritica e contenere lo stesso numero di punti di controllo.
  12. Collegare le linee adiacenti utilizzando la funzione di ricostruzione 3D per formare una superficie continua e creare la forma 3D finale (Figura 4D).
    1. Assicurarsi che siano visibili solo gli oggetti BézierCircle. Nella Raccolta scene, nascondi tutti gli altri oggetti utilizzando l'icona a forma di occhio nella barra laterale.
    2. Per creare l'oggetto spina dorsale dendritica, vai alla scheda Layout , seleziona tutti gli oggetti BézierCircle, fai clic con il pulsante destro del mouse e fai clic su Unisci. Converti l'oggetto unito in una mesh facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando Converti in |Maglia.
    3. Per collegare i bordi dell'oggetto unito, accedere alla scheda Modellazione , premere 2 per accedere alla modalità Selezione bordo |Seleziona |Tutto |fare clic con il pulsante destro del mouse |Anelli del bordo del ponte.
    4. Per riempire lo spazio vuoto nella parte superiore dell'oggetto, deselezionare tutto facendo clic accanto all'oggetto, tenere premuto Alt e fare clic su una sezione del bordo della sporgenza superiore, fare clic con il pulsante destro del mouse, selezionare Estrusione bordi, trascinare verso l'alto sull'asse Z, premere S e spostare il mouse per ridurre il nuovo loop del bordo, fare clic per accettare la modifica. Mentre la nuova linea chiusa di spigoli è ancora selezionata, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Nuova faccia da spigoli. Riempi lo spazio inferiore usando lo stesso metodo.
    5. Per levigare l'oggetto, accedere alla scheda Layout , fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Sfumatura uniforme. Per smussare ulteriormente la forma, vai su Modificatori (barra laterale destra) |Aggiungi modificatore |Genera |Superficie di suddivisione. Impostate entrambi i livelli Viewport e Render sullo stesso valore (consigliato 1).
  13. Ripetere i passaggi 4.11-4.12 per la ricostruzione delle sinapsi (Figura 4E, F).
  14. Assegnare un colore a ciascuna struttura e utilizzare la funzione di rendering per preparare l'immagine finale (Figura 4G, H). Vai al menu Ombreggiatura Viewport e seleziona Renderizzato per visualizzare in anteprima le modifiche al materiale. Seleziona l'oggetto da colorare e fai clic su Materiale (barra laterale destra) |Nuovo |regola il colore di base.
    1. Per perfezionare l'aspetto del materiale, regolare i cursori Rugosità o Metallico in base alle esigenze. Utilizzare questo metodo per assegnare un colore distinto a ciascuna struttura.
    2. Per regolare l'illuminazione della scena, fare clic sull'oggetto Luce, tenere premuto G e spostare il mouse per riposizionarlo. Per modificare l'intensità della luce, vai su Dati (barra laterale destra) e regola il valore di Potenza .
    3. Per posizionare la telecamera, orientare la finestra in modo che sia rivolta verso il dorso ricostruito come dovrebbe apparire nell'immagine finale, premere Ctrl + Alt + Numpad 0. Seleziona la cornice visibile della fotocamera, tieni premuto G e sposta il mouse per riposizionarla se necessario.
    4. Per prepararti per il rendering, vai su Output (barra laterale destra), modifica i valori di Risoluzione X e Y in modo che corrispondano all'immagine desiderata. Per migliorare la qualità dell'immagine, vai su Rendering (barra laterale destra) |Rendering, regola il valore dei campioni tra 120 e 250. Per uno sfondo trasparente, vai su Rendering |Pellicola |selezionare Trasparente. Per eseguire il rendering dell'immagine, premere F12 o andare su Rendering (menu superiore) |Rendering dell'immagine.

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Results

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Per applicare correttamente il nostro metodo all'analisi delle modificazioni sinaptiche circadiane, è necessario iniziare selezionando almeno quattro punti temporali a intervalli uguali, con due punti per ogni fase dell'attività degli animali (ogni 6 ore). In questi momenti designati, gli animali vengono sacrificati e i loro cervelli vengono raccolti. Questo approccio consente di identificare modelli giornalieri o circadiani di plasticità sinaptica e li collega ai cambiamenti nell'attività locomotoria degli animali (

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Discussion

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Qui, abbiamo presentato la metodologia utilizzata per studiare la plasticità circadiana delle sinapsi e la ricostruzione delle spine dendritiche nella corteccia del barile dei topi. Per garantire risultati affidabili, lo studio della plasticità circadiana dovrebbe includere almeno quattro punti temporali. La nostra ricerca ha dimostrato che i dati provenienti da due punti temporali - uno durante la fase di riposo (giorno) e uno durante la fase di attività (notte) - hanno fornito informaz...

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Disclosures

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è supportato da sovvenzioni del National Science Centre in Polonia, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 a EP e al Jagiellonian University Medical College, nr N41/DBS/001129 a MJ.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pellicola AclarAgar scientificoAGL4458
Software per frullatori Versione: v. 2.91.2
Acido cacodilico, sale sodico triidratoPoliscienze01131-100
Scivolo concavoMenzel9.161 151
Coltello diamantato Diatomee15-Stati UnitiAngolo del coltello: Ultra 45 gradi  
Fotocamera digitale Nikon DXM 1200 F
di-sodio idrogeno fosfato dodecaidratoPOCH799280115
Resina per inclusionePoliscienze08792-1Formulazione Luft 
EtanoloPol-AuraPA-11-0004
Software GIMPVersione: V 3.0.4
Citrato di piomboTAABL018
Microscopia ottica Nikon Ottiphot
Tetrossido di osmio PoliscienzeCodice 0223C-10Cristallino (99.95%)
Pennello
Software Photoshopversione: CS5
Ferricianuro di potassioSigmaaldrichP8131
Ossido di propilene Sigmaaldrich82320puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Griglie a slot singoloAgar scientificoAGG25252 x 0,75 mm o 2 x 1 mm
Cloruro di sodio Chempur117941206
Sodio diidrogeno fosfato diidratoChempur117991808
Stereomicroscopiopzo
Filtro a siringa BiosensBS25PES045
TEM GioeleJEM-2100
UltramicrotomoLeicaUC7
Acetato di uranileLachema
VibratomoLeicaVT1000 S

References

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