Presentiamo un protocollo in vitro ottimizzato per la produzione di particelle simili al virus SARS-CoV-2 che imitano da vicino il virus autentico. Questo approccio consente lo studio dell'infezione virale, dell'assemblaggio e dei meccanismi di uscita senza i vincoli di richiedere un laboratorio di biosicurezza di livello 3.
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Articolo metodologico
Produzione di un sistema di particelle simile al virus SARS-CoV-2 per studiare i cicli di vita virali in vitro
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metodo della particella simile al virus (SC2-VLP) della sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) offre uno strumento potente e accessibile per studiare il ciclo di vita del SARS-CoV-2 senza la necessità di laboratori di biosicurezza di livello 3 (BSL-3). Questo sistema imita efficacemente le fasi critiche del ciclo di vita virale, tra cui l'assemblaggio, l'impacchettamento del genoma e l'uscita, utilizzando un reporter di luciferasi fuso con il segnale T20 per un rilevamento sensibile e preciso della produzione di particelle virali. Le SC2-VLP sono generate co-esprimendo proteine strutturali di SARS-CoV-2, tra cui membrana (M), nucleocapside (N), inviluppo (E) e spike (S), insieme al segnale di impacchettamento dell'RNA nelle cellule HEK-293T. A differenza dei tradizionali sistemi di particelle simili a virus, il metodo SC2-VLP garantisce una quantificazione accurata e una maggiore fedeltà al ciclo di vita virale naturale. Inoltre, rispetto ai metodi di pseudotipizzazione lentivirale, che si limitano allo studio dell'ingresso virale attraverso l'incorporazione della proteina S nelle particelle lentivirali basate sull'HIV, il sistema SC2-VLP fornisce una piattaforma più completa per esplorare più fasi della biologia del SARS-CoV-2. Mentre questo metodo aggira i rischi della gestione del virus vivo e amplia l'accessibilità. Il metodo SC2-VLP rappresenta un progresso significativo nella ricerca antivirale e nello sviluppo di strategie terapeutiche contro SARS-CoV-2.
Introduzione
La pandemia di COVID-19 è emersa come una delle crisi sanitarie globali più devastanti della storia moderna, con conseguenti milioni di morti in tutto il mondo1. Il virus responsabile, SARS-CoV-2, segue un ciclo di vita complesso che include fasi chiave come l'infezione, la replicazione del genoma, l'assemblaggio e l'uscita. Il processo di infezione inizia quando la proteina spike virale (S) si lega al recettore della cellula ospite, l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), facilitando il rilascio del genoma virale nella cellula ospite 2,3. L'RNA polimerasi virale RNA-dipendente (RdRp) catalizza quindi la replicazione dell'RNA genomico. Questo RNA, in complesso con la proteina nucleocapside (N), forma una struttura stabile che viene riconosciuta dalla proteina di membrana (M). La proteina M svolge un ruolo centrale nell'assemblaggio virale reclutando il complesso RNA-N, S, e la proteina dell'involucro (E)4,5. Dopo l'assemblaggio, il virione completa la sua uscita attraverso una via di traffico 6 mediata dal lisosoma noncanonica.
In risposta alla pandemia, sono state mobilitate ingenti risorse globali per sviluppare vaccini, anticorpi neutralizzanti e farmaci antivirali. La valutazione di questi interventi è stata essenziale per far progredire la ricerca sul SARS-CoV-27. Tuttavia, lo studio del virus vivo presenta notevoli sfide logistiche, poiché gli esperimenti che coinvolgono il virus devono essere condotti in laboratori di biosicurezza di livello 3 (BSL-3). La disponibilità limitata di strutture BSL-3 ha limitato il ritmo della ricerca volta a comprendere e combattere il SARS-CoV-2.
Per affrontare queste sfide, due sistemi principali - la particella simile al virus (VLP) e la pseudotipizzazione lentivirale - sono stati ampiamente adottati nella ricerca sul SARS-CoV-2, entrambi i quali non richiedono il contenimento di BSL-38. Il sistema VLP prevede la co-trasfezione di cellule con geni che codificano per proteine strutturali virali, tra cui M, S, E e N, che insieme generano particelle simili a virus. Queste particelle imitano le proprietà strutturali e funzionali del virus, rendendole uno strumento prezioso per studiare i processi chiave nel ciclo di vita del SARS-CoV-2 e persino un antigene efficace per lo sviluppo di vaccini 9,10,11.
Al contrario, il sistema di pseudotipizzazione lentivirale prevede la sostituzione della proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV) nel lentivirus con la proteina SARS-CoV-2 S, consentendo la produzione di particelle lentivirali che possono incorporare geni reporter come la luciferasi o la GFP. Questo sistema è particolarmente utile per studiare gli anticorpi neutralizzanti che bloccano l'interazione S-ACE212. Tuttavia, la pseudotipizzazione lentivirale non rispecchia l'assemblaggio o l'uscita virale di SARS-CoV-2 a causa dell'uso di proteine strutturali dell'HIV, che mediano il rilascio di particelle sulla membrana plasmatica.
Per superare queste limitazioni, Syed et al. hanno recentemente identificato il segnale di impacchettamento di SARS-CoV-2 all'interno del suo genoma di RNA, che dimostra la specificità della proteina N verso il riconoscimento del genoma virale13. Fondendo questo segnale di imballaggio con i geni reporter, è possibile incorporare in modo efficiente questi geni in particelle simili al virus SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)13. Questa strategia non solo replica i processi di assemblaggio e uscita del SARS-CoV-2, ma consente anche la misurazione sensibile delle fasi di infezione. In questo studio, introduciamo la metodologia sperimentale per l'utilizzo del sistema SC2-VLP ed evidenziamo le considerazioni chiave per condurre questo approccio.
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Protocollo
1. Generazione di SC2-VLP
- Seme ~3,0 × 106 cellule HEK-293T in una piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro con terreno completo DMEM, integrato con il 10% v/v di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
NOTA: Per garantire un'elevata efficienza di trasfezione e una produzione ottimale di SC2-VLP, le celle HEK-293T devono essere mantenute a bassi numeri di passaggio ~10. - Coltivare la cellula HEK-293T a 37 °C, 5% CO2 per circa 24 ore e controllare la confluenza cellulare al microscopio. Procedere se ~70% confluente.
- Diluire 60 μL di PEI da 1 mg/mL a 200 μL con terreno privo di siero.
- Aggiungere 6,7 μg di plasmide N, 10 μg di plasmide Luc-T20, 0,016 μg di plasmide S e 3,3 μg di plasmide M-IRES-E in 200 μL di terreno privo di siero (vedere File supplementare 1).
- Aggiungere delicatamente il PEI diluito del passaggio 1.3 nella soluzione contenente plasmidi che codificano per le proteine della struttura virale del passaggio 1.4 e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Questa è la soluzione di trasfezione.
- Far cadere con cautela la soluzione di trasfezione dalla fase 1.5 sulle cellule HEK-293T e agitare delicatamente la piastra di coltura tissutale per una miscelazione accurata.
- Sostituire il terreno di coltura cellulare 6 ore dopo l'infezione con il terreno completo DMEM e incubare le cellule HEK-293T trasfettate a 37 °C, 5% CO2 per 48 ore.
- Raccogliere il surnatante delle cellule HEK-293T infette, che contiene le SC2-VLP, quindi filtrare il surnatante attraverso un filtro per siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti cellulari. Questo è il mezzo SC2-VLP.
NOTA: Abbiamo tentato di produrre SC2-VLP in linee cellulari HeLa, Vero E6 e Caco2, ma non è stato ottenuto alcun titolo virale misurabile, indicando la specificità del protocollo per le cellule HEK-293T.
2. Esame dell'efficacia di SC2-VLP
NOTA: La linea cellulare HEK-293T che esprime stabilmente ACE2 e TMPRSS2 è stata stabilita utilizzando un approccio di trasduzione lentivirale14,15. L'espressione proteica sia di ACE2 che di TMPRSS2 è stata confermata dall'analisi western blot, seguendo un protocollo simile a quello descritto nella Fase 3 (analisi della composizione SC2-VLP).
- Seminare 4.0 × 104 cellule HEK-293T con espressione stabile di ACE2 e TMPRSS2 in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 50 μL di terreno SC2-VLP dal passaggio 1.8.
- Incubare la piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti a 37 °C con CO2 al 5% per 24 ore.
- Rimuovere il terreno dalla piastra a 96 pozzetti e lavare una volta con 100 μL di tampone PBS a 37 °C, contenente 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4.
- Lisi le celle HEK-293T ACE2/TMPRSS2 con 20 μL di tampone di lisi passiva, facendo oscillare delicatamente il campione per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente.
NOTA: Il tampone di lisi contiene 25 mM di Tris-fosfato (pH 7,8), 2 mM di DTT, 2 mM di acido 1,2-diaminocicloesano-N,N,N',N'-tetraacetico, 1,25 mg/mL di lisozima, 2,5 mg/mL di BSA, 10% di glicerolo e 1% di Triton X-100). - Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 4.000 × g per 15 minuti a 4 °C in una centrifuga per micropiastre refrigerata, quindi trasferire immediatamente la piastra in un bagno di ghiaccio.
- Prelevare 100 μl di tampone per il saggio della luciferasi ricostituita su una piastra bianca opaca a 96 pozzetti e aggiungere 20 μl di lisato dal passaggio 2.5. Mescolarli brevemente pipettandoli su e giù 2-3 volte.
- Misurare la luminescenza utilizzando un lettore di piastre con i seguenti parametri: Modalità di rilevamento: Luminescenza; Gamma di lunghezze d'onda: spettro completo; Formato della piastra: piastra opaca standard a 96 pozzetti; Tempo di integrazione: 200 ms.
3. Esame della composizione SC2-VLP
- Aggiungere 1,36 mL di soluzione PEG 8000, contenente il 50% di PEG 8000 e il 2,2% di NaCl, a 10 mL di terreno SC2-VLP dal passaggio 1.8.
- Conservare la miscela su un agitatore orbitale e mescolare lentamente la soluzione a 4 °C per una notte.
- Centrifugare la soluzione a 4 °C, 2.000 × g per 30 minuti e raccogliere il pellet SC2-VLP per l'analisi del western blotting16.
NOTA: Per l'analisi del western blotting, tutte le informazioni relative agli anticorpi sono fornite nella Tabella dei materiali.
4. Analisi della localizzazione subcellulare di S e dei suoi mutanti in cellule produttrici di SC2-VLP
- Seminare ~3,0 × 106 cellule HEK-293T in modo uniforme nel piatto di coltura con fondo di vetro con diametro di 15 mm, quindi lasciare che le cellule aderiscano e crescano fino a ~70% di confluenza prima della trasfezione.
- Ripetere la procedura di trasfezione come descritto nei passaggi da 1.3 a 1.7 e modificare solo le quantità di plasmidi come segue: plasmide N: 1,3 μg, plasmide Luc-T20: 2 μg, plasmide S: 0,0032 μg e plasmide M-IRES-E: 0,66 μg.
- Lavare delicatamente la piastra di coltura due volte con 1 mL di PBS ghiacciato, quindi aggiungere 1 mL di soluzione di fissazione con paraformaldeide (PFA) al 4% a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
- Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT, quindi permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di Triton X-100 allo 0,25% a RT per 10 min.
- Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT, quindi aggiungere 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 5% a RT per 1 ora per bloccare le interazioni anticorpali aspecifiche.
- Aggiungere ~200 μL di soluzione di anticorpi primari (sufficiente a coprire il fondo del vetro) e incubare a 4 °C per una notte.
NOTA: Le soluzioni anticorpali primarie sono preparate diluendo il 5% di BSA disciolto in PBS ai seguenti rapporti di diluizione: l'anticorpo anti-S di topo a 1:200, l'anticorpo anti-Sec61β di coniglio a 1:200, l'anticorpo anti-GM130 di coniglio a 1:200 e l'anticorpo anti-ERGIC53 di coniglio a 1:200. La soluzione BSA/PBS al 5% è servita sia come diluente che come tampone bloccante per ridurre al minimo il legame aspecifico durante le successive procedure di colorazione in immunofluorescenza. - Rimuovere la soluzione di anticorpi primari, quindi lavare le cellule per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
- Aggiungere una soluzione di anticorpi secondari coniugati a fluorescenza a RT per 1 ora, quindi lavare le cellule per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
NOTA Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti al buio o con un'esposizione minima alla luce per prevenire il fotosbiancamento dei coniugati fluorescenti e preservare l'integrità del segnale. Due tipi di anticorpi secondari coniugati a fluorescenza, derivati da topo o coniglio, sono impiegati per colorare la proteina S o le proteine marcatrici degli organelli cellulari. - Colorare i nuclei con 2,5 μg/mL di soluzione di Hoechst a RT per 5 minuti, quindi lavare le cellule per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
- Osservare la colorazione della proteina S o degli organelli e acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale con i seguenti parametri: Modalità PMT impostata su VBF (senza media, scansione sequenziale della linea) con apertura autoconfocale. Per il canale 1 (FITC), utilizzare il laser a 488 nm al 25% di potenza con emissione da 500 a 548 nm, HV 525 V, guadagno 1x e offset 5%. Per il canale 2 (Alexa Fluor 594), utilizzare il laser a 594 nm al 25% di potenza con emissione da 610 a 670 nm, HV 500 V, guadagno 1x e offset 5%. Per il canale 3 (DAPI), utilizzare il laser a 405 nm al 25% di potenza con emissione da 430 a 470 nm, HV 490 V, guadagno 1x e offset 5%.
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Risultati
Le fasi di uscita e di assemblaggio del ciclo di vita del SARS-CoV-2 sono state meno studiate rispetto alle fasi di infezione e replicazione17,18. Prima che il metodo SC2-VLP fosse sviluppato, questi processi potevano essere studiati solo utilizzando SARS-CoV-2 vivo, limitando la ricerca ai laboratori BSL-313. Il flusso di lavoro SC2-VLP, mostrato nella Figura 1, delinea il protocollo sperimentale e illustra i...
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Discussione
Un metodo semplice ed efficace per modellare il ciclo di vita del SARS-CoV-2 nei sistemi di coltura cellulare, senza i vincoli dei laboratori BSL-3, rappresenta un progresso fondamentale per la ricerca anti-SARS-CoV-2. Il metodo SC2-VLP soddisfa questa esigenza, offrendo una piattaforma robusta e accessibile. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato per il metodo SC2-VLP, delineando le fasi sperimentali critiche per la produzione di SC2-VLP. Inoltre, ne evidenziamo la versati...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma Startup fund presso l'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM) (90011451310011). Estendiamo la nostra gratitudine a tutti i membri del laboratorio del Dr. Ma presso la BUCM per l'inestimabile discussione e assistenza con gli esperimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina (BSA) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 9998S | |
| Olympus | FV3000 | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermofisher | A5670402 | |
| IgG anti-topo H& L (Alexa Fluor 488) anticorpo | Invitrogen | A11001 | rapporto di diluizione: IF 1:1000 |
| IgG di capra anti-coniglio H& Rapporto di diluizione dell'anticorpo L (Alexa Fluor 594) | Abcam | ab150080 | : IF 1:1000 |
| Linea cellulare HEK-293T | Infrastruttura nazionale delle risorse della linea cellulare (NICR) | NICR-293T-001 | Per garantire un'elevata efficienza di trasfezione e una produzione ottimale di SC2-VLP, le cellule HEK-293T devono essere mantenute a bassi numeri di passaggio (≤ P10). |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Concentrazione di lavoro: 2,5 μ g/mL |
| Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1500 | |
| Luc-T20 | Addgene | 177941 | |
| Monoclonale di topo anti-GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | Rapporto di diluizione: WB 1:20.000 |
| Monoclonale di topo anti-S RBD | Abclonal | A23771 | Rapporto di diluizione: IF 1:200 |
| OptiMEM | Thermofisher | 31985070 | terreno privo di siero per trasfezione |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | P3635 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermofisher | 15140122 | |
| Polietilenimmina (PEI) | Thermofisher | 43896.01 | |
| Promega tampone di lisi passiva | Promega | E1941 | |
| Rapporto di diluizione policlonale anti-ACE2 | Proteintech | 21115-1-AP | WB 1:1000 |
| policlonale anti-ERGIC53 Proteintech | 13364-1-AP | : IF 1:200 Rapporto di diluizione | |
| policlonale anti-GM130 | Proteintech | 11308-1-AP | : IF 1:200 |
| anti-S anti-S | Abcam | ab272504 | : WB 1:1000 |
| Coniglio policlonale anti-Sec61β | Proteintech | 15087-1-AP | : IF 1:200 |
| Anti-TMPRSS2 policlonale di coniglio | Abcam | ab109131 | rapporto di diluizione: WB 1:1000 |
| SARS-CoV-2 M-IRES-E plasmide | Addgene | 177938 | |
| SARS-CoV-2 N plasmide | Addgene | 177959 | |
| SARS-CoV-2 Nucleoproteina Coniglio mAb | Abclonale | A21042 | Rapporto di diluizione: WB 1:4000 |
| SARS-CoV-2 S plasmide | Addgene | 177960 | |
| Anticorpo secondario, HRP, IgG (H+L) | Invitrogen | 31460 | di capra Rapporto di diluizione: WB 1:5000 |
| Anticorpo secondario, HRP, IgG di capra anti-coniglio (H+L) | Invitrogen | 31430 | : WB 1:5000 |
| SpectraMax i3x plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x |
Riferimenti
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