Una guida passo passo all'isolamento e all'analisi della superficie fogliare e dell'RNA apoplastico utilizzando le rosette di Arabidopsis

Sommario

Descriviamo un metodo semplice ma altamente riproducibile per isolare l'RNA extracellulare dalla superficie fogliare e dall'apoplasto delle piante di Arabidopsis.

Abstract

La superficie delle foglie delle piante e lo spazio intercellulare all'interno delle foglie (l'apoplasto) fungono da interfacce chiave per lo scambio molecolare tra le piante e i loro microbi interagenti. In lavori precedenti, abbiamo dimostrato la presenza di una vasta gamma di specie di RNA nell'apoplasto delle rosette di Arabidopsis. Più recentemente, i nostri risultati hanno rivelato che le piante di Arabidopsis secernono attivamente anche RNA sulla superficie fogliare. Per indagare su questo, abbiamo sviluppato un metodo altamente riproducibile per raccogliere sia il lavaggio della superficie fogliare (LSW) che il liquido di lavaggio apoplastico (AWF) dallo stesso insieme di piante di Arabidopsis. Inoltre, abbiamo esplorato una tecnica non invasiva che coinvolge il tampone della superficie fogliare (LSS), che ci ha permesso di raccogliere l'RNA tamponando delicatamente la superficie fogliare con bastoncini sterili con punta di cotone. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione microbica, abbiamo filtrato le frazioni LSW, AWF e LSS prima di isolare l'RNA extracellulare (exRNA). Dopo aver analizzato l'exRNA purificato utilizzando l'elettroforesi su gel di RNA denaturante, abbiamo osservato una vasta gamma di specie di RNA lunghe e piccole in campioni di RNA LSW, LSS e AWF. Ulteriori quantificazioni e analisi comparative tra campioni di exRNA e condizioni sperimentali sono state eseguite utilizzando il software ImageJ, liberamente accessibile. Questo protocollo fornisce un approccio efficiente ed economico per isolare e analizzare piccole quantità di exRNA dalle foglie delle piante. Questi preparati di RNA possono essere ulteriormente caratterizzati attraverso il sequenziamento e altre analisi molecolari, offrendo informazioni sui ruoli dinamici dell'exRNA nelle interazioni pianta-microbi.

Introduzione

Le foglie sono colonizzate da una varietà di microbi, tra cui batteri, funghi, oomiceti e protisti, che possono aiutare a proteggere le piante da fattori di stress biotici e abiotici, promuovendo in ultima analisi la crescita e lo sviluppo delle piante 1,2,3,4. La foglia della pianta ha due compartimenti principali per ospitare i microbi interagenti: epifita (superficie fogliare) ed endofitica (apoplasto)². La superficie fogliare è protetta da uno strato di cuticole idrofobiche, che impedisce la perdita d'acqua e include componenti come cera e cutina. La superficie superiore (assiale) delle foglie spesso include cellule epidermiche specializzate simili a peli chiamate tricomi, che proteggono dai raggi UV, regolano la temperatura e fungono da deterrenti per gli erbivori. Al contrario, l'apoplast facilita lo scambio di gas e acqua per la fotosintesi e fornisce un ambiente umido favorevole alla colonizzazione microbica⁵. Nonostante queste differenze, entrambi i compartimenti fogliari favoriscono alcuni microbi, con le reti microbiche epifite che sono più complesse in termini di diversità rispetto alle reti microbiche endofite⁵. Il modo in cui la composizione di queste comunità microbiche è regolata in ciascun compartimento extracellulare rimane poco compreso. Ipotizziamo che la struttura della comunità microbica possa essere determinata, in parte, dall'RNA extracellulare (exRNA) secreto dalla pianta ospite.

Nel nostro recente studio, abbiamo riportato la presenza di diverse specie di RNA sulla superficie fogliare che differiscono dall'RNA nell'apoplasto o nei lisati cellulari⁶. Mentre la maggior parte della ricerca sugli exRNA nelle piante si è concentrata su piccoli RNA non codificanti, come i microRNA (miRNA) e i piccoli RNA interferenti (siRNA), meno attenzione è stata data ad altre specie di RNA, come i frammenti derivati da rRNA e tRNA, che possono potenzialmente regolare i processi cellulari indipendentemente dalla complementarità delle sequenze, in particolare nelle specie prive di meccanismi di interferenza dell'RNA ^{7,8. 9}.

Il metodo che descriviamo qui consente l'isolamento sequenziale dell'RNA sia dal lavaggio della superficie fogliare (LSW) che dal liquido di lavaggio apoplastico (AWF) utilizzando lo stesso set di piante di Arabidopsis. Inoltre, descriviamo una tecnica ortogonale non invasiva che coinvolge un tampone di superficie fogliare (LSS), che consente la raccolta di RNA tamponando delicatamente la superficie fogliare spruzzata con bastoncini sterili con punta di cotone⁶. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione microbica, filtriamo sia la frazione LSW che quella AWF prima di isolare l'RNA extracellulare. Per valutare la quantità e la distribuzione dimensionale dei campioni di exRNA, descriviamo un protocollo che impiega l'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante combinata con l'analisi delle immagini utilizzando il software ImageJ liberamente accessibile. Questo protocollo fornisce un approccio efficiente ed economico per l'isolamento e l'analisi di piccole quantità di exRNA. Questi preparati di RNA possono essere ulteriormente caratterizzati attraverso il sequenziamento e le analisi molecolari, offrendo informazioni sui ruoli dinamici dell'RNA extracellulare nelle interazioni pianta-microbi.

Il protocollo descritto di seguito differisce dal nostro protocollo precedentemente descritto per l'isolamento dell'RNA dalle vescicole extracellulari delle piante¹⁰. L'attuale protocollo non richiede alcuna fase di ultracentrifugazione e consente l'isolamento dell'RNA dal liquido di lavaggio extracellulare totale, non solo dalle vescicole extracellulari. Più significativamente, fornisce due metodi ortogonali per isolare l'RNA dalla superficie fogliare. Per quanto ne sappiamo, l'isolamento dell'RNA dalle superfici fogliari non è stato descritto prima della nostra recente pubblicazione⁶.

Protocollo

1. Preparazione del tampone e sterilizzazione

1. Preparare il tampone di isolamento delle vescicole (VIB) composto da 20 mM di acido 2-(N-morfolino) etansolfonico (MES), pH 6,0, 2 mM di CaCl₂ e 0,01 M di NaCl in 1 L di acqua distillata.
   NOTA: Sono stati apportati piccoli aggiustamenti alla concentrazione di NaCl nel VIB da 0,1 M a 0,01 M per imitare la concentrazione ionica dell'apoplasto fogliare.
2. Autoclavare il VIB per 20 minuti a 121 °C, ciclo del liquido. In alternativa, sterilizzare il VIB con un filtro sottovuoto da 0,45 μm.
   NOTA: Questo passaggio serve a garantire che il tampone sia sterile, poiché qualsiasi contaminazione microbica potrebbe portare all'induzione di piante e, a sua volta, alla variabilità dei risultati. Questo tampone può essere conservato a temperatura ambiente (senza aprire il coperchio dopo la sterilizzazione) per una conservazione a breve termine o a 4 °C per una conservazione a lungo termine.

2. Materiale vegetale e stato di crescita

1. Semina i semi di Arabidopsis thaliana Col-0 wild type (WT) in vasi di plastica rotondi da 4 pollici contenenti un terriccio standard. Dopo la semina, immergere i semi con un fungicida biologico (600 mg/L), coprirli con una cupola di plastica trasparente e tenerli a 4 °C al buio per 3 giorni per indurre la germinazione sincrona.
2. Trasferite i vasi con i semi in una camera di crescita a temperatura controllata a giornata corta impostata a 24 °C con un fotoperiodo di 9 ore di luce e 15 ore di buio con densità di flusso di fotoni fotosintetici di 150 μmol·^m-2·s⁻¹ a livello di pianta (miscela 50:50 di lampadine fluorescenti da 3.500 e 5.000 K con spettro da 32 watt).
3. Dopo circa 10 giorni, trasferisci le singole piantine in inserti per vassoi da 36 celle contenenti terriccio e copri con una cupola di plastica trasparente per 1-2 settimane.
   NOTA: Un tipico esperimento richiede ~12-24 piante sane per ogni genotipo/trattamento. È stato notato che le piante di 6-7 settimane producono la quantità ottimale di RNA LSW e AWF con il minor rischio di contaminazione cellulare.
4. A seconda del terriccio utilizzato, innaffia le piante ogni 10-15 giorni per evitare siccità o stress da inondazione.

3. Raccolta dell'RNA della superficie fogliare

1. Metodo basato sulla centrifugazione (Leaf Surface Wash; LSW)
   1. Per ogni replica, utilizzare piante di Arabidopsis di 6-7 settimane.
   2. Aggiungere Silwet-L77 (d'ora in poi indicato come agente umettante) al VIB sterile a una concentrazione finale dello 0,001% (1 μL in 100 mL di VIB) prima di iniziare l'isolamento di LSW.
      NOTA: Silwet-L77 è un agente bagnante che riduce la tensione superficiale e consente al tampone di rivestire le superfici fogliari.
   3. Trasferire 100 mL di VIB in un flacone spray da 500 mL.
   4. Stacca con cura le rosette di Arabidopsis dalle loro radici usando le forbici sottili.
   5. Rimuovere il terreno in eccesso dal picciolo usando una spazzola morbida.
   6. Posizionare le rosette su un vassoio piatto con la superficie abassiale rivolta verso l'alto.
   7. Spruzzare la superficie abassiale con VIB + agente umettante utilizzando cinque dosi del flacone spray.
   8. Capovolgere con cura le rosette e spruzzare la superficie adassiale con VIB + agente umettante cinque volte.
   9. Per recuperare la LSW, posizionare con cura le rosette spruzzate all'interno di siringhe da 60 ml senza ago con fori sul fondo (per siringa possono entrare al massimo due rosette di 6 settimane) poste all'interno di flaconi da centrifuga da 250 ml. Avvolgere la siringa con il parafilm intorno al collo per sospendere la punta della siringa sopra il fondo del flacone (vedere la Figura 1 per riferimento).
      NOTA: Per i dettagli sulla preparazione delle siringhe da 60 mL con fori, fare riferimento al protocollo¹¹ precedentemente pubblicato.
   10. Centrifugare le bottiglie caricate a 100 g per 10 minuti a 4 °C (rotore JA-14).
   11. Filtrare l'LSW attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifugazione da 50 mL posta su ghiaccio.
       NOTA: In genere, 12 piante produrrebbero circa 30 ml di LSW alla fine utilizzando questo protocollo. Tuttavia, questa è solo una stima basata sul numero di spruzzi eseguiti in ogni fase. Questo volume è normalmente inferiore al volume spruzzato, poiché parte del tampone spruzzato viene persa durante la manipolazione.
2. Metodo del tampone sulla superficie fogliare (LSS)
   1. Spruzzare le rosette staccate con VIB + agente umettante come descritto nella sezione precedente (passaggi 3.1.1-3.1.7).
   2. Per recuperare l'LSS, tamponare le superfici adassiali e abassiali utilizzando bastoncini sterili con punta di cotone e premere le punte imbevute contro la parete interna di una provetta da centrifugazione da 15 ml per espellere il liquido.
      NOTA: I campioni LSS adassiali e abassiali possono essere raccolti in provette separate in base alla configurazione sperimentale e al risultato atteso.
   3. Filtrare i campioni LSS attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm in una provetta da centrifugazione da 15 mL posta su ghiaccio.
      NOTA: A seconda del numero di piante sottoposte a tampone, è stato possibile raccogliere volumi variabili di LSS per esperimento.

Figura 1: Strumenti utilizzati per il lavaggio della superficie fogliare e l'isolamento del liquido di lavaggio apoplastico. (A) Per raccogliere LSW e AWF, due rosette intere di Arabidopsis thaliana vengono poste in una siringa da 60 ml con otto fori aggiuntivi che vengono fusi all'estremità della siringa con una pinza riscaldata per creare canali attraverso i quali il lavaggio può fluire. (B) Questa siringa senza ago viene quindi avvolta con parafilm nella regione del collo come raffigurato. (C) Questo passaggio consente alla siringa di inserirsi in un flacone da centrifuga da 250 ml senza toccare il fondo del flacone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Raccolta del liquido di lavaggio apoplastico (AWF)

1. Metti lo stesso set di piante utilizzate per l'isolamento LSW o LSS in un becher e sciacquale delicatamente due volte con acqua distillata.
2. Aspirare infiltrando le rosette con VIB per 20 s come segue:
   NOTA: Sebbene il processo di infiltrazione nel vuoto sia ben descritto in un protocollo¹¹ pubblicato in precedenza, è stato riprodotto qui per rendere chiaro il presente protocollo.
   1. Posizionare con cura le rosette in una caffettiera francese con 300-500 ml di VIB. Posiziona il coperchio sulla pressa francese e abbassa delicatamente lo stantuffo fino a quando le piante non sono completamente sommerse.
   2. Posizionare la pressa francese con piante e tampone in una camera a vuoto. Applicare il vuoto per 20 s utilizzando una pompa a vuoto. Il tampone dovrebbe iniziare a bollire.
   3. Rilasciare il vuoto e rimuovere la french press dalla camera del vuoto, togliere il coperchio e versare il VIB in un becher di plastica separato da 500 ml. Togliete le rosette dalla pressa francese.
      NOTA: Il VIB può essere riutilizzato più volte nello stesso giorno per un genotipo, ma una volta utilizzato per l'infiltrazione nel vuoto, il VIB non deve essere conservato per l'uso in un altro giorno.
   4. Rimuovi il VIB in eccesso dalle piante agitando delicatamente e poi spazzolando le foglie su un tovagliolo di carta.
3. Rimuovere il tampone in eccesso dalle superfici fogliari tamponando delicatamente con carta assorbente.
4. Per raccogliere il liquido di lavaggio apoplastico (AWF), posizionare le rosette all'interno di siringhe senza ago da 60 mL posizionate all'interno di flaconi da centrifuga da 250 mL come descritto per la raccolta di LSW e centrifugare a 4 °C per 30 minuti a 600 × g con lenta accelerazione.
5. Filtrare l'AWF raggruppato attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 15 ml posta su ghiaccio.
   NOTA: In genere, 12 piante produrrebbero circa 6 mL di AWF alla fine utilizzando questo protocollo. LSW, AWF e LSS filtrati possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
6. Registrare il peso fresco (FW) delle piante utilizzate per ciascuna replica dopo l'isolamento AWF. Successivamente, utilizzare questa lettura per normalizzare la quantità di RNA in ciascun campione (Figura 2).

Figura 2: Illustrazioni schematiche del protocollo e del metodo del tampone sulla superficie fogliare. (A) Illustrazione schematica del protocollo graduale per l'isolamento del lavaggio della superficie fogliare e del liquido di lavaggio apoplastico utilizzando rosette di Arabidopsis. (B) Illustrazione schematica del metodo del tampone della superficie fogliare (LSS) per isolare l'RNA della superficie fogliare. Figure adattate dalla Figura S1 e dalla Figura S4 di Borniego et al., 2025⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Precipitazione dell'RNA

1. Precipitare l'RNA mescolando il volume richiesto di AWF, LSW o LSS con 0,1 volumi di 3 M di acetato di sodio (pH 5,2) e 1,0 volumi di isopropanolo freddo in una provetta da centrifugazione da 15 mL.
2. Aggiungere glicogeno (20 mg/mL) a una concentrazione finale di 20 μg/mL.
   NOTA: Assicurarsi che le provette da centrifuga utilizzate per precipitare l'RNA possano essere centrifugate ad una velocità elevata di 13.000 × g. La rottura delle provette in questa fase può portare alla perdita di campioni di RNA.
3. Incubare la miscela a -20 °C per almeno 1 ora o tutta la notte.
4. Centrifugare le provette a 13.000 × g per 30 minuti a 4 °C (rotore JA-25.50).
5. Lavare il pellet due volte con EtOH al 70% ghiacciato e lasciarlo asciugare all'aria per non più di 10 minuti.
6. Risospendere i pellet in 100 μL di acqua ultrapura priva di DNasi/RNasi o VIB e trasferire l'RNA in provette da centrifuga da 1,5 mL.
   NOTA: Dopo questo passaggio, l'RNA precipitato può essere conservato a -80 °C per un massimo di 2 settimane.

6. Isolamento dell'RNA basato su TRIzol

1. Aggiungere 1 mL di reagente TRIzol a ciascuna provetta e mescolare agitando su un rotatore.
   ATTENZIONE: Per maneggiare il TRIzol, utilizzarlo in una cappa aspirante, indossare guanti e proteggere gli occhi.
2. Posizionare le provette su un rotatore da tavolo per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Aggiungere 200 μl di cloroformio a ciascuna provetta, seguito da una breve ma vigorosa fase di vortice.
   ATTENZIONE: Per maneggiare il cloroformio, utilizzarlo in una cappa aspirante, indossare guanti e proteggere gli occhi.
4. Lasciare riposare le provette a RT per circa 3 minuti, quindi centrifugare a 13.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
5. Trasferire la fase acquosa in provette da centrifuga da 1,5 mL marcate e aggiungere 10 μg di glicogeno privo di RNasi e un volume di isopropanolo freddo.
   ATTENZIONE: Per i rifiuti a rischio biologico generati (come i rifiuti fenolici), raccogliere i solventi organici in contenitori per rifiuti designati secondo le linee guida istituzionali.
6. Incubare le provette per non più di 1 ora a -20 °C.
   NOTA: La precipitazione dell'RNA per più di 1 ora in questa fase riduce l'efficienza dell'isolamento dell'RNA e porta a una concentrazione molto bassa di RNA.
7. Per pellettare l'RNA, centrifugare le provette a 13.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
8. Lavare i pellet di RNA due volte utilizzando EtOH ghiacciato al 70% e lasciarli asciugare all'aria prima di risospenderli in 10-20 μL di acqua ultrapura priva di DNasi/RNasi.
9. Conservare l'RNA risospeso a -20 °C o -80 °C per la conservazione a breve o lungo termine, rispettivamente.

7. Rimozione della contaminazione da fenolo o guanidina

1. Per rimuovere la contaminazione da fenolo o guanidina dai campioni di RNA, eseguire una o due precipitazioni seriali con EtOH al 96% e acetato di ammonio.
2. Aggiungere 1 μg di glicogeno a 10 μL di campioni di RNA e miscelare con 0,5 volumi di acetato di ammonio 7,5 M prima dell'aggiunta di 2,5 volumi di EtOH al 96-100%.
   NOTA: La concentrazione finale di EtOH dovrebbe essere del 70-75% nell'intero volume in questa fase.
3. Incubare la miscela a -80 °C per 30 minuti e centrifugare a 13.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
4. Lavare due volte il pellet di RNA con il 70% di EtOH e risospendere in 10 μL di acqua ultrapura priva di DNasi/RNasi.

8. Elettroforesi su gel di RNA per la quantificazione e il confronto

1. Preparare il mini gel (7,2 cm x 8,6 cm x 0,75 mm) contenente il 10% o il 15% di poliacrilammide e il 7 M di urea in 1x acido tris-borico EDTA (TBE, pH 8,4) utilizzando una soluzione di acrilammide/bis al 40%, 37,5:1. In alternativa, è possibile utilizzare un mini gel denaturante commerciale (15% TBE-Urea Gel) per analizzare i campioni di RNA.
2. Miscelare campioni di RNA (1:1) con 2 tamponi di caricamento denaturanti (95% formammide, 10 mM EDTA, 0,02% SDS, 0,02% blu di bromofenolo e 0,01% xilene cianolo), denaturare a 65 °C per 5 minuti e porre immediatamente su ghiaccio.
3. Risolvere i campioni di RNA in TBE 0,5x eseguendo un tampone a RT a 220 V per circa 1 ora e 15 minuti.
4. Per gli standard dimensionali, utilizzare una miscela 1:1 di ssRNA a basso intervallo e marcatori ladder a scala di ssRNA 14-30 nt.
5. Colorare il gel con 1x SYBR gold nucleic acid gel color in 0,5x TBE per 10 minuti, lavare due volte con acqua distillata e creare l'immagine utilizzando un sistema di imaging (Figura 3).
6. Per quantificare l'RNA risolto in ciascuna corsia, utilizzare il metodo di analisi su gel descritto nella documentazione ImageJ alla voce "Analisi su gel": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. Poiché ogni volta vengono caricati 100 ng/μL di CL RNA per confrontare il modello di bande tra i campioni di CL ed exRNA, stimare la concentrazione di campioni di exRNA rispetto all'RNA CL (Figura 4).

Figura 3: Le foglie delle piante sono rivestite con diversi tipi di RNA. 100 ng di RNA da lisato di cellule fogliari (CL) e 2 μL di RNA isolati da AWF e LSW sono stati separati su un gel di poliacrilammide denaturante al 15% e colorati con colorante di acido nucleico SYBR Gold per visualizzare e confrontare i modelli di bande di RNA. Gli standard di dimensione dell'RNA sono mostrati nella corsia più a sinistra. Le misurazioni densitometriche ottenute utilizzando l'analisi su gel ImageJ sono indicate nella parte inferiore di ciascuna corsia e indicano la quantità di RNA relativa all'RNA nella corsia totale del lisato delle cellule fogliari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Estrazione ripetuta di LSW RNA. LSW è stato isolato per la prima volta utilizzando VIB senza Silwet L-77 o concentrazioni variabili di Silwet L-77 (0,001% o 0,01%). L'isolamento ripetuto di LSW utilizzando lo stesso set di piante di Arabidopsis può essere impiegato per arricchire l'RNA di LSW utilizzando VIB + Silwet L-77 (0,001%). L1, L2 e L3 denotano campioni di RNA isolati utilizzando LSW raccolti attraverso tre cicli successivi di centrifugazione post-irrorazione dello stesso set di piante. L'aumento della concentrazione dell'agente umettante dallo 0,001% allo 0,01% non ha migliorato l'isolamento dell'RNA LSW. Le misure densitometriche ottenute utilizzando l'analisi su gel ImageJ sono indicate nella parte inferiore di ogni corsia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

9. Metodo alternativo per quantificare l'RNA utilizzando un metodo basato su piastra per microtitolazione

1. Preparare soluzioni di RNA standard utilizzando CL RNA in acqua ultrapura priva di RNasi/DNasi. Determinare l'intervallo di concentrazione appropriato per gli standard in base alla concentrazione prevista dei campioni. Utilizzare le seguenti concentrazioni di RNA: 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/μL e preparare un volume sufficiente di ciascuno standard per consentire due repliche tecniche.
2. Preparare 1,5x SYBR Gold colorante in gel per acidi nucleici in 500 mM Tris HCl pH = 8.
   NOTA: SYBR Gold è pH dipendente e ha una sensibilità di colorazione ottimale tra pH = 7,0 e 8,0.
3. Configurazione della micropiastra:
   1. Aggiungere 99 μL di dH₂O a ciascun pozzetto.
   2. Aggiungere 1 μL di RNA a ciascun pozzetto. Utilizzare 1 μl sia per i campioni di RNA che per gli standard di RNA.
   3. Aggiungere 50 μl di oro SYBR 1,5x in ciascun pozzetto.
4. Impostare i parametri sul lettore di micropiastre come segue:
   Scuotimento -Lineare o orbitale: 0:03 (MM:SS)
   Leggi - Punto finale di fluorescenza con lunghezza d'onda di eccitazione impostata a 496 nm e lunghezza d'onda di emissione impostata a 540 nm.
5. Costruire una linea di calibrazione utilizzando i valori degli standard. Utilizzando l'equazione della linea di calibrazione, calcolare le concentrazioni di RNA nei campioni.
   NOTA: Coloranti alternativi possono essere utilizzati per quantificare l'RNA in campioni isolati da TRIzol. Risultati simili sono stati ottenuti con il reagente per la quantificazione dell'RNA Ribo488. Un manuale dettagliato è fornito dall'azienda per questo colorante. Brevemente, diluire il colorante 1000x (da 1 a 1000) utilizzando 200 mM Tris pH = 8. Quindi, per effettuare le misurazioni, aggiungere 99 μL di dH₂O autoclavato a ciascun pozzetto + 1 μL di RNA (campione o standard) + 100 μL della diluizione Ribo488, incubare per 5 minuti e quantificare la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre utilizzando un'eccitazione di 480 nm e un'emissione di 520 nm. Le curve standard ottenute utilizzando i due coloranti a RNA sono mostrate nella Figura 5.

Figura 5: Curve standard ottenute utilizzando un metodo di quantificazione dell'RNA basato su piastra di microtitolazione. Due diversi coloranti a RNA, SYBR Gold (a sinistra) e Ribo488 (a destra) producono risultati coerenti con due repliche tecniche per campione. Entrambi i metodi possono essere utilizzati per eseguire la quantificazione dell'RNA. Tuttavia, una curva standard dovrebbe essere ottenuta ogni volta che l'RNA deve essere quantificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Una panoramica schematica del protocollo graduale sopra descritto per l'isolamento delle frazioni di lavaggio della superficie fogliare (LSW) e apoplastica (AWF) dalle piante di Arabidopsis è mostrata nella Figura 2A. Questo metodo consente l'estrazione di LSW e AWF da un minimo di tre a sei piante per replica, producendo costantemente quantità equivalenti di RNA da entrambe le frazioni. Per misurare la concentrazione di RNA nei lisati cellulari, utilizziamo la spettrofotometria NanoDrop. Tuttavia, per i campioni di RNA derivati da LSW, LSS e AWF, ci affidiamo alla quantificazione densitometrica di gel di poliacrilammide colorati con oro SYBR. Questa fase di quantificazione è necessaria perché le frazioni extracellulari contengono un contaminante sconosciuto - probabilmente polisaccaridi - che a volte può copurificare e interferire con i metodi di quantificazione dell'RNA basati sull'assorbanza, portando a una sovrastima della concentrazione di RNA. Per superare questa limitazione, prevediamo di utilizzare metodi di purificazione dell'RNA non basati sul fenolo nel nostro lavoro futuro.

L'analisi del gel di RNA denaturante ha rivelato la presenza di un'ampia gamma di specie di RNA in LSW e AWF, inclusi sia gli RNA lunghi che quelli piccoli (Figura 3). In particolare, sono state isolate con successo quantità equivalenti di RNA sia dalla superficie fogliare che dalle frazioni apoplastiche, con le quantità di RNA normalizzate per peso fresco (FW) della pianta. Sorprendentemente, i profili delle dimensioni dell'RNA delle frazioni LSW e AWF differivano significativamente l'uno dall'altro e dal profilo dell'RNA del lisato cellulare totale (CL). Queste differenze suggeriscono che le frazioni di exRNA non sono contaminate dall'RNA cellulare. Tra le tre frazioni, l'RNA apoplastico (AWF) ha mostrato la maggiore diversità nella distribuzione dimensionale, suggerendo che l'RNA apoplastico è più degradato dell'RNA della superficie fogliare.

Per esaminare ulteriormente la presenza di RNA sulla superficie delle foglie di Arabidopsis, abbiamo utilizzato tamponi di cotone. Questo metodo ci ha permesso di raccogliere separatamente e sequenzialmente l'RNA dalle superfici fogliari adassiali (superiore) e aassiali (inferiori)⁶. Queste analisi hanno rivelato che entrambe le superfici fogliari contenevano quantità simili di RNA. Inoltre, la capacità di raccogliere l'RNA semplicemente assorbendo il tampone dalla superficie fogliare senza la necessità di centrifugazione supporta ulteriormente la conclusione che l'RNA si trova effettivamente sulla superficie fogliare, piuttosto che essere estratto attraverso gli stomi durante la centrifugazione.

Una regolazione primaria che ci ha permesso di estrarre un'abbondante quantità di RNA della superficie fogliare è stata l'aggiunta dell'agente umettante. Abbiamo recuperato quasi il doppio dell'RNA dopo l'aggiunta di agente umettante (a una concentrazione molto bassa dello 0,001%) al VIB. Questa differenza di concentrazione di RNA ottenuto con e senza Silwet L-77 indica che l'uso di un agente umettante migliora la dissoluzione dell'RNA sulla superficie fogliare. Tuttavia, l'aumento della concentrazione dell'agente umettante dallo 0,001% allo 0,01% non ha migliorato l'isolamento dell'RNA LSW (Figura 4). In particolare, ripetendo l'isolamento dell'RNA LSW dalle stesse foglie si è ottenuto un RNA aggiuntivo (circa il 63% del recupero ottenuto dal primo lavaggio), il che suggerisce che le foglie secernono continuamente RNA sulla superficie, con quasi due terzi di esso sostituiti entro i circa 30 minuti necessari per elaborare le foglie. Per aumentare la resa totale di RNA di LSW quando il materiale vegetale è limitante, è quindi possibile lavare le stesse foglie più volte in successione. Tuttavia, non si consigliano più di tre lavaggi, poiché la manipolazione coinvolta può portare a danni cumulativi al materiale fogliare, come valutato dalla colorazione verde del liquido di lavaggio. Per questi esperimenti, la concentrazione di RNA è stata stimata utilizzando l'analisi densitometrica basata su gel di RNA. Tuttavia, il metodo di quantificazione dell'RNA basato su piastra per microtitolazione sopra descritto può essere utilizzato per una quantificazione accurata dell'RNA quando si valutano più campioni contemporaneamente (Figura 5).

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio come isolare il lavaggio della superficie fogliare (LSW), il tampone della superficie fogliare (LSS) e il liquido di lavaggio apoplastico (AWF) da rosette sane di Arabidopsis, seguito dall'estrazione dell'RNA. Le fasi critiche includono la preparazione e la sterilizzazione del VIB prima di eseguire l'esperimento, la coltivazione delle piante in condizioni controllate e l'utilizzo di Silwet-L77 per garantire il corretto rivestimento della superficie fogliare da parte del VIB. Queste procedure dovrebbero produrre quantità uguali di RNA sia da LSW che da AWF normalizzate dal peso fresco delle foglie. Il recupero dell'RNA da queste frazioni extracellulari richiede un'attenta manipolazione, soprattutto per quanto riguarda i pellet di RNA dopo le fasi di precipitazione.

Sebbene il protocollo di cui sopra sia stato ottimizzato per le foglie di Arabidopsis, lo abbiamo utilizzato con successo anche su altre specie vegetali con solo piccole modifiche. L'estrazione dell'RNA dalla superficie fogliare può essere ottimizzata implementando due regolazioni primarie: in primo luogo, conducendo più cicli di isolamento LSW e, in secondo luogo, aumentando la concentrazione dell'agente umettante. Le specie vegetali che hanno superfici fogliari molto idrofobiche, come il riso ^12,13, possono richiedere concentrazioni più elevate dell'agente umettante.

Inoltre, abbiamo descritto un metodo non invasivo per raccogliere l'RNA della superficie fogliare utilizzando tamponi con punta di cotone. Con questo metodo di isolamento dell'RNA della superficie fogliare, ci assicuriamo che la provetta di raccolta sia posta in un secchiello per il ghiaccio. Considerando che l'RNA sulla superficie fogliare viene secreto e si accumula a temperatura ambiente, supponiamo che rimarrebbe stabile anche durante il processo di raccolta. Abbiamo anche confrontato i modelli di bande di LSW e LSS RNA, e non mostrano molte differenze in termini di degradazione.

Il protocollo di cui sopra utilizza il reagente TRIzol per purificare l'RNA da LSW, LSS o AWF. Questo reagente impiega il fenolo per rimuovere le proteine. Abbiamo scoperto, tuttavia, che la purificazione a base di TRIzol non rimuove i polisaccaridi come la pectina, che sono abbondanti in LSW e AWF⁶. Tali molecole copurificanti possono causare problemi con la quantificazione dell'RNA utilizzando la spettrofotometria o la fluorimetria. Per questo motivo, ci affidiamo all'analisi densitometrica basata su gel di RNA per valutare le concentrazioni di exRNA. Attualmente stiamo studiando metodi di purificazione basati su colonne che dovrebbero fornire una migliore separazione dell'RNA dai polisaccaridi. Tuttavia, questi metodi spesso limitano il recupero di piccoli RNA poiché la membrana di silice è ottimizzata per legare molecole di RNA più grandi di ~ 200 nucleotidi. Piccoli RNA possono passare attraverso la membrana durante il legame o essere persi nelle fasi di lavaggio. Pertanto, finora, ci siamo affidati solo al metodo basato su TRIzol per un recupero più completo di tutte le dimensioni di RNA, compresi gli RNA piccoli, sebbene richieda un'attenta manipolazione e separazione di fase.

Inoltre, quando si conduce l'analisi su gel di RNA, non vediamo frammenti più piccoli di 80 nt per i campioni di RNA cellulare totale rispetto agli RNA AWF e LSW, principalmente a causa della bassa abbondanza rispetto alle grandi quantità di rRNA e tRNA. La presenza di bande più piccole nell'AWF e nell'LSW è dovuta alla degradazione degli abbondanti rRNA e tRNA, che avviene naturalmente dopo la secrezione di RNA nel compartimento extracellulare delle piante, e non è un artefatto introdotto durante la raccolta e la manipolazione delle piante come confermato dal sequenziamento e dall'analisi del northern blot⁶.

Il nostro metodo di isolamento del lavaggio della superficie fogliare è uno strumento versatile con un potenziale significativo per un'ampia gamma di applicazioni di ricerca. Dovrebbe consentire l'isolamento di biomolecole dalla superficie fogliare, come RNA, proteine e altri metaboliti che possono essere fondamentali per comprendere le interazioni tra piante e microbi. Se si desidera identificare i microbi presenti in AWF e LSW, ciò può essere ottenuto eliminando la filtrazione attraverso il filtro da 0,22 μm.

Le piante interagiscono con una vasta gamma di microbi, tra cui batteri, funghi e virus, che formano comunità complesse sulle^{loro superfici1}. Queste comunità microbiche possono avere effetti profondi sulla crescita delle piante, sulla resistenza alle malattie e sull'acquisizione di nutrienti ^2,3,4. Isolando e analizzando il lavaggio della superficie fogliare con questo metodo, i ricercatori possono isolare exRNA, metaboliti microbici, identificare le comunità microbiche presenti sulla superficie fogliare e studiare come queste comunità sono regolate a livello molecolare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
14-30 nt ssRNA marcatore ladder	Takara	3416
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	VWR	20170-038
Siringa senza ago da 10 mL	BD	303347
Provette Falcon da 15 mL	VWR	89039-668
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 10 pozzetti/12 pozzetti, 30 & micro; L/20 µ L	Bio-Rad	4566053 / 4566055
Inserti per vassoi a 36 celle	Mercato della vera foglia
Soluzione di acrilammide e bis-acrilammide al 40%, 37,5:1	Bio-Rad	1610148
Pentole rotonde da 4 pollici	Mercato della vera foglia
Provette Falcon da 50 mL	VWR	89039-656
Siringa senza ago da 50 mL	BD	309653
Piastra a 96 pozzetti fondo nero	Grenier	655090
Acrodisc 0.22 μ m filtro per siringhe	Sudario	4192
Acrodisc 0,45 μ m filtro per siringhe	Sudario	4454
Persolfato di ammonio (APS)	Sigma-Aldrich	Trasmissione A3678
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016
Cloroformio (senza RNasi)	Macron Chimica Fine	MK444110
Cupole in plastica trasparente	Hummert Internazionale	11 3348	Qualsiasi cupola di plastica può essere utilizzata per coprire le piante e mantenere l'umidità
Bastone con punta in cotone per uso medico	Uline	S-21102
Etanolo (senza RNASI)	Laboratori Decon, Inc.	2716GEA
Caffettiera French Press, 24 fl oz	Picco di neve	CS-111
Vassoio di coltivazione senza fori 10 x 20	Mercato della vera foglia
Secchiello per il ghiaccio	Schuett-Biotech, Spongex	3-680 052
Isopropanolo	Termo Scientifico	149320050
Rotore ad angolo fisso JA-14	Beckman Coulter; modello: JA-14	339247
Salviette Kimwipes	KCWW, Kimberly-Clark	34120
Lader di ssRNA a basso intervallo	NEB	N0364S
MES idratare	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M8250
Lettore di micropiastre	BioTek	Sinergia H1
Miracolo-Gro	Miracolo-Gro	24-8-16	È un alimento vegetale per tutti gli usi. A seconda della fonte di terreno utilizzata per coltivare le piante, l'applicazione può essere regolata.
Nalgene flacone centifugo 250 mL (senza tappo)	Nalgene	3120
Asciugamani di carta
ParaFilm  M Lab Film	Parafilm	S-25929
Bicchiere in plastica (500 mL)	Uline	S-21658
Glicogeno libero da RNasi (20 mg/mL)	Termo Scientifico	R0561
RootShield Plus WP Fungicida Biologico	BioWorks	68539-9
Forbici
Silwet L-77	Laboratori fitotecnici	S7777	È possibile utilizzare Silwet L-77 di qualsiasi marca. Tuttavia, Silwet perde la sua efficacia nel corso del tempo. L'ideale è sostituirlo una volta all'anno.
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Pennello per capelli in nylon morbido	NOI. Fornitura d'arte	n. 6
Flacone spray	Uline	S-7272	È possibile utilizzare qualsiasi flacone spray, ma le impostazioni dello spray devono essere sulla doccia.
Sungro Professional Mix di Coltivazione	Sungro
Miscela di propagazione Sungro	Sungro
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10.000x concentrato in DMSO)	Termo Scientifico	Episodio 11494
TEMED	Termo Scientifico	17919
Reagente TRIzol	Invitrogen	15596026
Acqua ultrapura priva di DNASI/RNASI	Invitrogen	10977015
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
Camera a vuoto, 0,20 piedi cubi	SP Scienceware - Prodotti Bel-Art - Strumento H-B	F42031-0000
Pompa a vuoto, 3,5 CFM	Prodotti per il vuoto ideali	P101532
Bilancia	Cantone di Escali	WBB480535	Questo è solo un esempio. È possibile utilizzare qualsiasi bilancia.