Ex Vivo Analisi a singola molecola dell'assemblaggio del recettore 2 della rianodina nel tessuto cardiaco e neuronale

Sommario

Questo studio presenta un metodo di imaging a singola molecola basato su vescicole che preserva l'organizzazione del recettore nativo, consentendo una precisa quantificazione stechiometrica e ampie applicazioni nell'assemblaggio dei recettori, nella funzione e nella ricerca sulle malattie.

Abstract

Comprendere l'assemblaggio dei recettori è fondamentale per chiarire i meccanismi alla base della loro funzione e regolazione nei processi fisiologici. Mentre i tradizionali studi in vitro su singole molecole si basano sull'isolamento di proteine da sistemi di espressione eterologhi, spesso non riescono a catturare la complessità fisiologica in vivo coinvolta nell'organizzazione e nell'assemblaggio delle proteine della superficie cellulare. Questo protocollo impiega la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) per studiare le molecole del recettore 2 della rianodina (RyR2) marcate con GFP incapsulate all'interno di vescicole su scala nanometrica. Queste vescicole, generate da organi estratti rapidamente dall'animale, forniscono efficacemente un'istantanea dello stato di assemblaggio del recettore al momento dell'estrazione, consentendo un'analisi dettagliata della stechiometria delle subunità e dell'organizzazione dei recettori in risposta ai cambiamenti nell'ambiente fisiologico dell'animale. Questo approccio utilizza il TIRFM e l'analisi graduale del fotosbiancamento per fornire una lettura della stechiometria del recettore. I recettori di imaging a livello di singola molecola facilitano il rilevamento dell'eterogeneità all'interno delle popolazioni di recettori assemblate in un animale vivo e consentono il monitoraggio dei cambiamenti di assemblaggio associati agli stati patologici. Di conseguenza, questo metodo offre un potente strumento per determinare la distribuzione degli assemblaggi recettoriali e la loro correlazione con i cambiamenti nel loro ambiente fisiologico.

Introduzione

I recettori di membrana svolgono un ruolo cruciale nei processi fisiologici in tutto il corpo umano¹. Una funzione primaria è quella di mediare la comunicazione tra le cellule attraverso il trasferimento di stimoli extracellulari per avviare eventi di segnalazione intracellulare. A causa del loro ruolo fondamentale nella segnalazione, quasi il 70% delle terapie esistenti ha come bersaglio i recettori di membrana². Sono spesso strutture oligomeriche composte da più subunità assemblate in forme eteromeriche con più stechiometrie ^3,4. Comprendere come i recettori si organizzano in complessi funzionali è fondamentale per chiarire i loro ruoli nella salute e nella malattia ^5,6. I metodi biochimici tradizionali, come l'immunoprecipitazione e il western blotting, forniscono misurazioni medie dell'insieme, che oscurano l'eterogeneità nelle sottopopolazioni recettoriali⁷. Al contrario, le tecniche a singola molecola consentono l'osservazione diretta dei singoli recettori, consentendo la quantificazione dell'eterogeneità all'interno delle popolazioni di recettori ^8,9,10. Le tecniche a singola molecola sono diventate lo standard per quantificare l'assemblaggio dei recettori di membrana, la stechiometria e l'oligomerizzazione^11,12. Questo approccio è stato ampiamente applicato a molti recettori di membrana fisiologicamente rilevanti utilizzando proteine isolate o condizioni di coltura cellulare. Gli studi su singole molecole si basano principalmente su sistemi di espressione in vitro, in cui le proteine possono essere isolate da un ambiente cellulare. Tuttavia, la complessità all'interno di un sistema vivente non si riflette pienamente in questi tipi di sistemi di espressione eterologhi.

Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio che isola e visualizza i recettori di membrana in uno stato fisiologicamente rilevante catturandoli all'interno di nanovescicole derivate direttamente da tessuti cardiaci e neuronali. Questo metodo preserva efficacemente lo stato di assemblaggio del recettore al momento della formazione delle vescicole, consentendo la visualizzazione diretta della stechiometria della subunità del recettore, che è un indicatore fondamentale della risposta del recettore in diversi ambienti fisiologici. Questo approccio ci consente di esaminare l'assemblaggio stechiometrico dei recettori di membrana che si verificano con il complesso ambiente biologico all'interno di animali vivi senza richiedere espressione eterologa o ricostituzione. Utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM), otteniamo l'imaging con risoluzione di una singola molecola di recettori incapsulati con vescicole ed estraiamo tracce di fotosbiancamento per determinare la composizione delle subunità.

TIRFM è adatto per l'imaging di proteine di membrana a singola molecola perché eccita selettivamente i fluorofori entro ~150 nm dalla superficie del vetro, riducendo la fluorescenza di fondo dalle molecole in soluzione ^3,10. Questo confinamento migliora significativamente il rapporto segnale/rumore, consentendo un rilevamento accurato dei singoli complessi recettoriali di membrana. Analizzando il photobleaching graduale dei recettori marcati in fluorescenza, possiamo determinare direttamente la stechiometria delle subunità e valutare la potenziale eterogeneità all'interno delle popolazioni di recettori¹². Ciò è particolarmente rilevante per il recettore 2 della rianodina (RyR2), un grande canale di rilascio intracellulare del Ca²⁺ che svolge un ruolo cruciale nell'accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore, dove si assembla solo come omo-tetramero, e nella funzione sinaptica nel cervello, dove il suo assemblaggio non è stato stabilito ^1,13,14. Data la presenza di più isoforme di RyR nei tessuti neuronali, non è chiaro se RyR2 formi complessi tetrameri puramente omomerici nel cervello, costituiti da quattro subunità identiche come nel cuore, o se assemblaggi eteromerici con RyR1 o RyR3 si verifichino in vivo 15,16,17,18.

Isolando le vescicole da specifiche regioni del cuore e del cervello, questo metodo consente di studiare potenziali differenze tessuto-specifiche nell'organizzazione di RyR2. Sfruttiamo le proprietà di RyR2 nel tessuto cardiaco, dove può formare solo omotetrameri, per fornire una base statisticamente robusta per la stechiometria a subunità di una singola molecola ex vivo, e l'assemblaggio noto del tetramero funge da controllo per studiare assemblaggi sconosciuti in altri organi. La capacità di visualizzare i recettori nel loro stato nativo, preservando le loro interazioni fisiologiche, fornisce un quadro solido per studiare l'assemblaggio dei recettori in diversi organi e in diverse condizioni fisiologiche. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'isolamento delle vescicole, l'immobilizzazione e l'imaging di singole molecole di RyR2 marcato con GFP, consentendo una caratterizzazione precisa della stechiometria del recettore. Questa tecnica non solo fa progredire la nostra comprensione dell'organizzazione di RyR2 nei tessuti cardiaci e neuronali, ma offre anche applicazioni più ampie per lo studio dell'assemblaggio e della regolazione dei recettori in vari contesti fisiologici e patologici 19,20,21.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Perfusione transcardica ed estrazione di organi
   1. Anestetizzare il topo con CO₂ fino alla cessazione della respirazione.
   2. Posiziona il mouse in posizione supina e fissa gli arti.
   3. Praticare un'incisione sulla linea mediana lungo l'addome ed estenderla lateralmente verso la gabbia toracica per esporre la cavità toracica.
   4. Inserire con cautela un ago nel ventricolo sinistro e sezionare l'atrio destro per consentire il drenaggio perfusato.
   5. Per la preparazione delle vescicole, perfondere con 1x PBS freddo fino a quando il sistema circolatorio non viene ripulito dal sangue.
   6. Per la criosezione, dopo la perfusione di PBS, continuare la perfusione con paraformaldeide (PFA) al 4% per fissare i tessuti.
   7. Estrarre con cura il cuore e metterlo immediatamente sul ghiaccio.
   8. Usando le forbici sottili, taglia con cura lungo la linea mediana del cuoio capelluto e stacca la pelle per esporre il cranio.
   9. Praticare un'incisione alla base del cranio vicino al forame magno.
   10. Usando una pinza fine, fai leva con cautela per aprire il cranio lungo la fessura longitudinale, rimuovendo i frammenti ossei per esporre il cervello.
   11. Solleva delicatamente il cervello usando una pinza curva, recidendo i nervi cranici per estrarlo completamente intatto.
   12. Se utilizzato per la criosezione, post-fissare il cervello in PFA al 4% a 4 °C per 24 ore.
   13. Se utilizzato per la preparazione delle vescicole, posizionare immediatamente il cervello sul ghiaccio senza fissarlo per un'ulteriore elaborazione.
2. Criosezione
   1. Rimuovi il cervello o il cuore dal 4% di PFA e asciugalo.
   2. Incorporare l'intero organo nel composto OCT all'interno di un criostampo.
   3. Congelare il tessuto incorporato ponendo lo stampo in un congelatore a -80 °C fino a completa solidificazione.
   4. Prima del sezionamento, equilibrare la camera del criostato e la testa del campione a -20 °C.
   5. Trasferire il blocco OCT congelato dal congelatore a -80 °C alla camera del criostato e lasciarlo equilibrare per 10 minuti.
   6. Pulire il mandrino del campione con etanolo al 70%, asciugarlo e applicare uno strato sottile di OCT come adesivo.
   7. Fissare il blocco OCT congelato sul mandrino, assicurandosi del corretto orientamento.
   8. Inserire il mandrino nel portacampioni del criostato e regolare la posizione della lama.
   9. Tagliare l'OCT in eccesso fino a quando la superficie del tessuto non è esposta.
   10. Sezionare il tessuto a 10 μm di spessore, raccogliendo le sezioni su vetrini.
   11. Dopo aver asciugato le sezioni all'aria a temperatura ambiente per 1 ora, applicare il terreno di montaggio sulle sezioni e posizionare un vetrino coprioggetti per sigillare il campione.
   12. Attendere che il supporto di montaggio si solidifichi prima di conservare le diapositive a 4 °C per l'imaging.
3. Preparazione delle vescicole
   1. Preparazione delle vescicole cardiache
      1. Estrarre il cuore a seguito di perfusione transcardica con 1x PBS e metterlo su ghiaccio.
      2. Utilizzando un bisturi sterile, sezionare circa 30 mg di muscolo ventricolare dalla parte inferiore del cuore.
      3. Trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga contenente 4-5 mL di 10 mM di NaHCO₃ con 5 mM di NaN₃ per mantenere l'integrità della vescicola.
      4. Omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore fino a quando non è completamente lisato.
      5. Centrifugare l'omogeneizzato a 10.000 × g per 20 minuti per rimuovere i detriti di grandi dimensioni e raccogliere il surnatante.
      6. Eseguire l'ultracentrifugazione a 37.000 × g per 65 minuti, quindi scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3-4 mL di tampone tris-maleato da 20 mM (pH 6,8) con 0,6 M KCl.
      7. Ripetere l'ultracentrifugazione a 37.000 × g per altri 65 minuti per rimuovere l'actomiosina solubilizzata.
      8. Risospendere il pellet finale in 0,5 mL di tampone tris-maleato 20 mM (pH 6,8) con 50 mM KCl per ottenere la soluzione di vescicola cardiaca e conservarla a -80 °C.
   2. Preparazione delle vescicole cerebrali
      1. Estrarre il cervello dopo la perfusione transcardica con 1x PBS e metterlo su ghiaccio.
      2. Tagliare il cervello in sezioni di 1 mm utilizzando una matrice coronale cerebrale di topo da 1 mm.
      3. Identificare la terza e la quarta sezione dal bulbo olfattivo e sezionare attentamente: 1) lo strato corticale più esterno da entrambi gli emisferi; 2) l'ippocampo, situato nella regione centrale della sezione.
      4. Dall'estremità posteriore, isolare il cervelletto praticando un taglio trasversale alla sua base.
      5. Raggruppare le stesse regioni cerebrali di cinque topi per garantire un'adeguata resa delle vescicole.
      6. Omogeneizzare immediatamente il tessuto utilizzando un omogeneizzatore Dounce in 2 mL di tampone di omogeneizzazione a freddo (0,32 M saccarosio, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, inibitore della proteasi, pH 7,4).
      7. Aggiungere 3 mL di tampone di omogeneizzazione aggiuntivo e centrifugare a 200 × g per 15 minuti per rimuovere i frammenti di tessuto di grandi dimensioni.
      8. Raccogliere il surnatante e centrifugare a 1.000 × g per 15 minuti a 4 °C per eliminare la frazione nucleare.
      9. Centrifugare ulteriormente il surnatante a 10.000 × g per 20 minuti a 4 °C per rimuovere i mitocondri.
      10. Ultracentrifugare il surnatante risultante a 100.000 × g per 2 ore a 4 °C per pellettare le vescicole.
      11. Risospendere il pellet finale della vescicola in 1x PBS per ottenere la soluzione della vescicola cerebrale e conservarla a -80 °C.
4. Caratterizzazione delle nanovescicole tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
   1. Montare la cella di rilevamento seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Accendere lo strumento e avviare il software compatibile.
   3. Caricare una siringa da 1 ml con acqua deionizzata (DI) e sciacquare manualmente il tubo del sistema fino a quando lo sfondo non è privo di contaminanti.
   4. Preparare il campione di nanovescicola diluendolo in 1x PBS.
   5. Caricare ~1 mL del campione di nanovescicola diluito in una siringa pulita da 1 mL, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
   6. Iniettare manualmente il campione nella cella di rilevamento e regolare la messa a fuoco fino a quando le vescicole non sono chiaramente visibili.
   7. Fissare la siringa sulla pompa a siringa e impostare la portata su 200 μL/s nel pannello hardware.
   8. Nel pannello SOP , impostare la durata della misurazione su 60 s, il numero di cicli su 5 e verificare che il controllo della temperatura sia abilitato e impostato su 25 °C. Salvare le impostazioni come nuova SOP facendo clic su Salva SOP e denominando il file in modo appropriato (ad esempio, "nanovesicle_standard.sop").
   9. Nel pannello Acquisizione, configurare le impostazioni dello strumento selezionando un livello della telecamera pari a 13 e una soglia di rilevamento iniziale pari a 3.
   10. Fare clic su Esegui e selezionare la SOP salvata in precedenza. Il software eseguirà automaticamente la misurazione in base alle impostazioni.
   11. Una volta completato, fai clic su Analizza per elaborare ogni video. Regolare la soglia di rilevamento per assicurarsi che tutte le particelle siano chiaramente visibili e fare clic su Fine al termine dell'analisi batch. Esporta il risultato facendo clic su Esporta dati | Tutte le misurazioni e salvarle come file CSV per un uso successivo.
   12. Dopo aver completato l'esperimento, sciacquare il sistema con ~ 2 mL di acqua deionizzata fino a quando non rimangono più vescicole residue.
   13. Iniettare aria attraverso il tubo per rimuovere il liquido residuo, assicurandosi che il sistema sia asciutto per l'uso successivo.

2. Imaging

1. Imaging confocale di criosezioni tissutali
   1. Accendere il microscopio confocale a scansione laser e aprire il software collegato.
   2. Selezionare l'obiettivo appropriato (20x aria o 60x olio) e caricare il vetrino di criosezione preparato sul tavolino del microscopio.
   3. Configura le impostazioni del laser per l'eccitazione GFP utilizzando una linea laser a 488 nm con un filtro di emissione a 535/70 nm.
   4. Ottimizza i parametri di imaging, tra cui la dimensione del foro stenopeico (28,9 μm), l'intensità del laser (17%) e il guadagno del rivelatore (15,3), per migliorare il rapporto segnale/rumore riducendo al minimo il fotobleaching.
   5. Se necessario, acquisire uno Z-stack impostando i piani focali superiore e inferiore e definendo la dimensione del passo appropriata (0,275 μm).
   6. Abilita l'unione automatica delle immagini con una sovrapposizione dell'immagine del 15% durante l'acquisizione di immagini di grandi dimensioni.
   7. Regola la risoluzione dell'immagine e applica la media dei fotogrammi, se necessario, per ridurre il rumore di fondo.
   8. Cattura le immagini e salvale in formato '.nd2' per ulteriori analisi.
2. Imaging a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)
   1. Immobilizzazione delle vescicole tramite ancoraggio biocompatibile per membrana (BAM) metodo²²
      1. Pulire le piastre con fondo in vetro da 35 mm sonicandole in 5 M NaOH per 1 ora a 45 °C, seguite da tre risciacqui accurati con acqua deionizzata.
      2. Sonicare le piastre in 0,1 M HCl per un'altra 1 ora a 45 °C, quindi eseguire tre ulteriori risciacqui con acqua deionizzata.
      3. Trattare la superficie del vetro pulita con il 2% di 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) in etanolo per 30 minuti a temperatura ambiente per introdurre gruppi funzionali amminici.
      4. Sciacquare il piatto 3 volte con acqua deionizzata ed etanolo per rimuovere l'eccesso di APTES e lasciarlo asciugare.
      5. Incubare la piastra con 100 μM di Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) in 1x PBS per 10 minuti.
      6. Lavare il piatto con PBS per rimuovere il reagente non reagito.
      7. Introdurre le vescicole alla concentrazione desiderata e incubare per 15 minuti per consentire il legame delle vescicole.
      8. Sciacquare delicatamente la piastra con PBS per rimuovere le vescicole non legate assicurandosi che le vescicole immobilizzate rimangano attaccate.
   2. Configurazione e acquisizione dell'imaging TIRF
      1. Accendi la sorgente laser da 488 nm del microscopio a fluorescenza invertita e la fotocamera EMCCD.
      2. Avvia i software Metamorph e CellSens per inizializzare il controllo dell'imaging.
      3. Pulire l'obiettivo a immersione in olio 60x (1,49 NA APO) con metanolo per rimuovere polvere e olio residui.
      4. Applicare una piccola goccia di olio da immersione corrispondente all'indice di rifrazione (RI) sulla lente dell'obiettivo.
      5. Posizionare la vaschetta delle vescicole preparata sul tavolino del microscopio, assicurandosi che sia centrata per un allineamento ottimale.
      6. Regolare la messa a fuoco del raggio laser centrando il raggio di eccitazione al centro dell'apertura posteriore dell'obiettivo in modalità epifluorescenza.
      7. Utilizzare il motore passo-passo per regolare l'angolo di incidenza del laser fino a raggiungere l'angolo critico, garantendo la totale riflessione interna sulla superficie del vetro.
      8. Identificare il piano focale scansionando l'asse Z, distinguendo: 1) il primo piano di messa a fuoco, corrispondente alla superficie del fondo in vetro; 2) il secondo piano di messa a fuoco, corrispondente alla superficie immobilizzata dalla vescicola.
      9. Una volta che le vescicole sono a fuoco, applicare la messa a fuoco automatica in CellSens per bloccare la posizione dell'obiettivo su questo piano, evitando la deriva durante l'imaging.
      10. Spegnere temporaneamente il laser e spostare il tavolino del microscopio su un nuovo campo visivo che non è stato ancora esposto alla luce di eccitazione.
      11. Avvia la registrazione accendendo contemporaneamente il laser, garantendo l'acquisizione dell'intero processo di fotosbiancamento senza esposizione precedente.
      12. Acquisisci immagini con i seguenti parametri: Tempo di esposizione: 100 ms per fotogramma, Modalità di acquisizione: 900 fotogrammi continui per campo visivo, Impostazione guadagno: 1.400.
      13. Ripetere il processo per più campi visivi per garantire una raccolta dati sufficiente.
      14. Salva le pile di immagini in formato TIFF per un'ulteriore elaborazione.

3. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati

1. Elaborazione confocale delle immagini
   1. Aprire le immagini confocali acquisite nel software collegato.
   2. Regolare le impostazioni della tabella di ricerca (LUT) per ottimizzare la luminosità e il contrasto.
   3. Applicate le stesse regolazioni LUT in modo uniforme su tutte le immagini per mantenere la coerenza visiva.
2. Elaborazione video TIRF e analisi dell'intensità della fluorescenza
   1. Elaborazione video per la visualizzazione
      1. Aprire le pile di immagini TIRF acquisite (formato TIFF) in ImageJ per la visualizzazione.
      2. Regola la luminosità e il contrasto per migliorare la chiarezza del segnale, assicurando che le vescicole fluorescenti siano facilmente distinguibili dallo sfondo.
      3. Esporta immagini modificate per la presentazione o ulteriori analisi qualitative.
   2. Analisi dei passaggi di fotosbiancamento
      1. Estrazione di tracce temporali
         1. Apri lo script MATLAB (vedi File supplementare 1) denominato "getTimeTraces.m" ed eseguilo. Nell'interfaccia utente grafica (GUI), fare clic su Carica filmato e selezionare il file di .tiff di imaging TIRF per importare la pila di filmati delle vescicole.
         2. Fare clic su Trova picchi per identificare automaticamente i segnali di fluorescenza di una singola molecola. Le regioni del segnale saranno contrassegnate da cerchi nella finestra di anteprima.
         3. Fare clic su Compila dati. In questo modo verrà esportata la traccia di intensità temporale per ogni punto in un file .xlsx per l'analisi a valle.
      2. Conteggio manuale dei passi
         1. Eseguire lo script "simpleGraph.m" (vedere File supplementare 1) per avviare la GUI, fare clic su Carica file di dati e selezionare il file .xlsx generato nel passaggio 3.2.2.1.3.
         2. Ispeziona le fasi di sbiancamento di ogni traccia temporale visualizzata nel pannello di sinistra. Assicurarsi che per l'analisi siano accettate solo le tracce che soddisfano i seguenti criteri: 1) la traccia temporale contiene almeno una fase di sbiancamento distinta. 2) La durata di uno step è di almeno 1 s. 3) La differenza di intensità tra i livelli di step è almeno 3 volte la deviazione standard dell'intensità post-decolorazione.
         3. A destra, individua il campo Passaggio # e usa i pulsanti + o - per inserire il numero di passaggi di fotosbiancamento per ogni traccia.
         4. Dopo aver completato ogni voce, fare clic su Avanti per passare alla traccia successiva. Una volta elaborate tutte le tracce, il software genererà e salverà automaticamente un file .txt registrando il conteggio dei passi di ciascuna traccia.
      3. Riepilogo del conteggio dei passi
         1. Eseguire lo script "CombinedFiles.m" (vedere File supplementare 1) per aprire la GUI.
         2. Digitare il nome desiderato per l'output di riepilogo nella casella di testo.
         3. Fare clic su Combina più risultati simpleGraph in un unico file. Nel browser dei file, selezionare uno o più file di .txt desiderati generati dal passaggio 3.2.2.2.3. Lo script compilerà automaticamente tutti i dati del conteggio dei passi e genererà un file di .xlsx combinato che riassume la frequenza di 1 passaggio e 2 passaggi,... Tracce.

Risultati

Per confermare l'applicabilità di questo metodo, abbiamo prima verificato l'espressione e la localizzazione di GFP-RyR2 mediante imaging confocale di criosezioni di tessuto cardiaco e neuronale (Figura 1). Il segnale di fluorescenza nel tessuto cardiaco mostrava un pattern striato trasversale coerente con la localizzazione attesa di RyR2 nei cardiomiociti, ma mostrava un'elevata intensità in alcune regioni del cervello, vale a dire la corteccia, l'ippocampo e...

Discussione

Questo studio stabilisce un protocollo dettagliato e riproducibile per l'incapsulamento ex vivo e l'imaging di singole molecole di recettori di membrana utilizzando RyR2 marcato con GFP come sistema modello. Il protocollo fa progredire in modo significativo i metodi attuali consentendo l'analisi stechiometrica dei complessi recettoriali direttamente dal tessuto nativo, preservando il contesto fisiologico delle proteine di membrana. Rispetto ai tradizionali sistemi di espressione...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto da 35 mm | N. 1.5 Vetrino coprioggetti | Diametro vetro 14 mm	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Stampi/adattatori Tissue-Tek Cryomold	Fisher Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML	(3-amminopropil)trietossisilano
Bio-Gen PRO200 Omogeneizzatore da laboratorio	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n/a
fotocamera EMCCD	Andor	n/a	iXon Ultra 897
Etanolo assoluto ≥ 100% (v/v) USP per la biologia molecolare (200 Proof)	VWR	71006-012
Leica CM1860	Leica	n/a	criostato
MetaMorph Advanced	Molecular Devices	n/a
Nanosight NS300 (con software Nanosight NTA)	Malvern	Panalytical n/a
Microscopio confocale invertito Nikon AXR		n/a
Microscopio a fluorescenza invertita con messa a fuoco automatica motorizzata Olympus IX83	Olympus	n/a	TIRFM
Paraformaldeide 4% in PBS reagente fissativo pronto all'uso	VWR	76221-378
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 20x, grado ultra puro	VWR	97062-950
idrossido di sodio, perline, grado reagente	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF America Corporation	n/a	Oleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	M71484
VectaMount AQ Medium Montaggio acquoso	Vector Laboratories	H-5501-60