Questo protocollo descrive il metodo CTAB per estrarre DNA di alta qualità dai micobatteri, superando le difficoltà poste dalle loro dure pareti cellulari ricche di acido micolico. Il processo prevede la digestione enzimatica, la lisi cellulare con CTAB e la purificazione del DNA tramite estrazione organica e precipitazione di etanolo. Questo metodo produce DNA adatto agli studi molecolari ed è affidabile per la ricerca micobatterica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Estrazione di acidi desossiribonucleici a genoma intero da specie di Mycobacterium tramite la tecnica del bromuro di cetiltrimetilammonio
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'estrazione efficiente e affidabile del DNA è un passo fondamentale nella biologia molecolare, fornendo materiale genetico di alta qualità per applicazioni successive come PCR, sequenziamento e analisi genomiche. Tuttavia, la composizione unica della parete cellulare dei micobatteri, ricca di lipidi e acidi micolici, pone sfide significative per un isolamento efficiente del DNA. Il metodo del bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) è ampiamente utilizzato grazie alla sua efficienza nell'estrazione di DNA ad alta purezza da specie micobatteriche, inclusi sia ceppi a rapida crescita che a lenta crescita. La tecnica prevede la rottura enzimatica delle cellule batteriche tramite lisozima e proteinasi K, seguita dalla lisi dei componenti cellulari tramite CTAB, che si lega selettivamente e forma un complesso con polisaccaridi e proteine. La purificazione e la concentrazione del DNA vengono ottenute tramite estrazione con solventi organici e precipitazione di etanolo. Secondo i nostri dati, il protocollo CTAB produce grandi quantità di DNA (200 - 1000 ng/μL) con alta qualità e contaminazione minima, come dimostrato dall'elettroforesi su gel e dall'analisi NanoDrop. Il DNA estratto da diverse specie micobatteriche è di alta purezza ed è adatto a vari studi molecolari. Questo studio dimostra i passaggi procedurali del metodo CTAB, evidenziandone l'utilità nel superare le sfide uniche associate all'estrazione del DNA micobatterico.
Introduzione
L'estrazione di DNA di alta qualità è un passo fondamentale nella biologia molecolare, essenziale per applicazioni a valle come PCR, sequenziamento dell'intero genoma e altri studi genomici. Per Mycobacterium, un genere che include sia specie patogene, come Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), sia specie ambientali non patogeniche come Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), l'estrazione del DNA può essere difficile a causa delle loro pareti cellulari spesse, ricche di lipidi eidrofobe 1,2,3. Questa resistente parete cellulare richiede l'uso di metodi di lisi specializzati per disturbare le cellule e rilasciare efficacemente il DNA genomico.
Il metodo del bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) si è dimostrato affidabile nell'isolare DNA di alta qualità proveniente da varie speciemicobatteriche 4,5. Il CTAB, un tensioattivo cationico, si lega ai polisaccaridi e ad altri componenti cellulari, facilitandone la rimozione durante il processodi estrazione 6. Anche con campioni difficili, il protocollo basato su CTAB garantisce l'isolamento efficiente del DNA intatto e puro, soprattutto se combinato con lisi enzimatica, trattamento termico ed estrazioni con solventiorganici 7,8. Il metodo CTAB ha svolto un ruolo cruciale nell'estrazione efficiente del DNA da specie micobatteriche, in particolare per ricerche che coinvolgono il sequenziamento dell'intero genoma, la metagenomica e la diagnostica molecolare, che richiedono materiale di input di DNA puro e di altaqualità 9,10. Rispetto ad altre tecniche di estrazione del DNA come il perlo o i kit commerciali, il protocollo CTAB presentato qui offre un vantaggio distintivo nel preservare l'integrità del DNA, un fattore essenziale per il sequenziamento a lunga lettura e le applicazioni epigenetiche. Sebbene studi precedenti abbiano riportato rese di DNA inferiori con il CTAB rispetto ai metodi di interruzione meccanica, sottolineano anche la sua capacità di minimizzare il taglio del DNA e mantenere l'integritàdel DNA 11,12. Per affrontare le limitazioni di purezza e rendimento, l'attuale protocollo è stato ottimizzato con tempi di incubazione ridotti e una maggiore coerenza tra diversi tipi di campioni. Questo perfezionamento è stato supportato dai risultati di Opperman et al., che hanno dimostrato che il DNA estratto da CTAB da colture di Mycobacterium avium aveva una concentrazione e qualità sufficienti per applicazioni a valle come il sequenziamento del 16S rRNA e i test a linea di sonda, supportando ulteriormente l'applicazione del protocollo CTAB come strumento versatile e scalabile per la ricerca micobatterica, in particolare negli studi che richiedono DNA genomico intatto per analisi molecolariavanzate 13. Inoltre, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) richiede generalmente 100-1000 ng di DNA genomicodi alta qualità 14 e, nel caso del sequenziamento a lettura lunga, come il sequenziamento PacBio, richiede ≥5 μg di DNA15 di alta qualità, quindi quando sono richieste grandi quantità di DNA di alta qualità e integro, il CTAB rimane un metodoefficace 16.
Stabilire metodologie efficienti, coerenti ed efficaci di estrazione del DNA da microbi difficili da lisare è necessario per garantire riproducibilità e affidabilità in laboratorio, in particolare per l'identificazione dei ceppi e gli studiepidemiologici 5,7. Questo protocollo fornisce dettagli per estrarre il DNA dell'intero genoma dai micobatteri utilizzando il metodo CTAB. L'attuale protocollo mira a permettere ai ricercatori di ottenere risultati coerenti e affidabili nei loro flussi di lavoro in biologia molecolare, affrontando le insidie e superando le sfide poste dalla caratteristica parete cellularemicobatterica 17.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I risultati rappresentativi sono stati generati con l'approvazione del comitato etico REC: BES dell'Università di Stellenbosch (BES-2024-22504). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione della sospensione di colture micobatteriche
NOTA: A seconda della specie esaminata, questo passaggio deve essere condotto in un laboratorio di livello di Biosicurezza 2 (BSL-2) o di livello di Biosicurezza 3 (BSL-3). Il tempo di incubazione e le condizioni della coltura dipendono anche dalle esigenze di crescita delle specie micobatteriche a causa dei loro tassi di crescita distinti e delle caratteristiche fisiologiche.
- Prepara 5 mL o 8 mL di coltura batterica in mezzo liquido Middlebrook 7H9 o MGIT rispettivamente, integrati con OADC e incuba a 37 °C per il periodo richiesto per consentire la crescita batterica. I micobatteri a crescita lenta richiedono 10-14 giorni, mentre quelli a crescita rapida impiegano circa 2-5 giorni.
NOTA: Una sospensione di cellule micobatteriche può essere preparata raschiando un anello di colonie in acqua sterile doppiamente distillata se la coltura iniziale proviene da piastre di agar solidi (ad esempio, agaro Middlebrook 7H10). - Versa la coltura liquida in tubi da 15 mL.
- Uccidere la coltura a 80 °C per 1 ora in incubatrice.
- Nel caso di Mycobacterium tuberculosis o altre specie patogene che richiedono BSL-3, trasferire le colture termiche al laboratorio BSL-2.
2. Digestione della parete cellulare ed estrazione del DNA
NOTA: Una volta che la coltura è inattivata dal calore, i seguenti passaggi possono essere eseguiti in sicurezza in un laboratorio di biosicurezza livello 2 (BSL-2). Se l'obiettivo è l'estrazione per sequenziamento a lunga lettura o applicazioni alternative che richiedono DNA ad alto peso molecolare, assicurati di utilizzare punte di pipetta a largo diametro e, nei passaggi dei vortice, sostituire il vortice con inversione o miscelazione di pipette.
- Centrifuga il tubo da 15 mL a 3220 x g per 15-30 minuti a temperatura ambiente (RT). Scartare il supernatant trasparente (assicurati che tutti i supporti siano rimossi).
- Sospendere accuratamente il pellet di coltura in 300 μL di tampone Tris-EDTA (TE).
- Trasferire il pellet sospeso in un tubo da 2 mL.
- Aggiungi 100 μL di lisozima (10 mg/mL) e mescola pipettando su e giù 5 volte, poi tocca delicatamente il tubo per garantire una dispersione uniforme.
- Incubare la miscela a 37 °C su un incubatore rotativo durante la notte (~16 h; tempi di incubazione più bassi potrebbero ridurre l'efficienza della lisi e quindi portare a una bassa resa di DNA).
- Il giorno seguente, preparare una miscela di 5 μL di proteinasi K (10 mg/mL) e 70 μL di SDS al 10%. Ad esempio, se ci sono cinque campioni, preparare 350 μL di SDS al 10% e 25 μL di proteinasi K. Mescolare invertendo il tubo per evitare la formazione di schiuma.
- Aggiungi 75 μL della miscela a ogni campione.
- Mescola con picchiettate e incuba a 65 °C per 10 minuti in un incubatore o blocco riscaldante, con miscelazione intermittente per inversione.
- Aggiungi 100 μL di 5 M NaCl.
- Aggiungi 100 μL di soluzione CTAB/NaCl preriscaldata a 65 °C.
NOTA: Riscaldare la soluzione CTAB/NaCl a 65 °C prima di garantire l'accuratezza del pipetaggio, considerando la viscosità della sostanza a RT. - Mescola battendo fino a quando la soluzione diventa lattiginosa.
- Incubare a 65 °C per 10 minuti in un incubatore o blocco riscaldante, con miscelazione intermittente per inversione.
- Aggiungere un volume uguale (~ 675 μL) di soluzione di cloroformio/isoamilico alcolico (24:1) a ciascun campione e mescolare tramite picchiettatura.
NOTA: Esegui questo passaggio in una cappa perché il cloroformio è tossico se inalato e richiede una manipolazione cauta. - Centrifuga i campioni a 12000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare con cura 550-600 μL della fase acquosa (superiore) in tubi sterili da 1,5 mL e etichettarli in modo appropriato.
NOTA: Fai attenzione a non disturbare gli altri strati. Se qualche strato viene involontariamente interrotto, centrifuga nuovamente il tubo.
3. Precipitazione ed eluzione del DNA
- Aggiungi un volume uguale (550-600 μL) di isopropanolo gelato e mescola invertendo i tubi.
NOTA: Se la concentrazione di DNA è alta, può formarsi precipitazione bianca durante la miscelazione. - Incubare i tubi a -20 °C per 30 minuti a 1 ora.
NOTA: tempi di incubazione più lunghi possono aumentare la precipitazione del DNA18 , ma possono anche portare alla coprecipitazione di sali. Pertanto, l'incubazione notturna può essere eseguita se si prevede una bassa concentrazione di DNA. - Centrifugare alla massima velocità (~21130 x g) per 30 minuti a temperatura ambiente per pelletare il DNA insolubile.
NOTA: Assicurati che il lato anteriore dei tubi da 1,5 sia rivolto verso l'interno nel rotore della centrifuga. In questa fase, il DNA precipita alla base e lungo il retro dei tubi. Questo è importante per evitare di disturbare il pellet possibilmente invisibile nella fase successiva. Un precipitato bianco o una pallina può essere visibile se la concentrazione di DNA è elevata. L'assenza di un pellet non indica un'estrazione fallita; Procedi con i passaggi rimanenti. - Aspirare il soprantantante dal lato anteriore del tubo senza disturbare il pellet di DNA né decantarlo rapidamente, assicurandosi che il pellet rimanga indisturbato.
NOTA: È meglio aspirare il soprandanante se la coltura iniziale è piccola e si prevede una bassa concentrazione di DNA. - Aggiungi 1000 μL di etanolo al 75% ghiacciato.
- Mescola invertendo i tubi più volte.
- Centrifugare a 12000 × g per 30 minuti (nella stessa orientazione del passo 3).
- Aspira o decanta tutto l'etanolo senza disturbare il pellet.
NOTA: I passaggi 5-8 possono essere ripetuti se si prevede un'alta coprecipitazione di sale. - Lascia asciugare i tubi all'aria a RT durante la notte o per almeno 30 minuti.
- Aggiungi 25-50 μL di tampone TE (pH 8) a ogni tubo per risospendere il DNA.
NOTA: Il DNA può essere risospeso in acqua tampone Tris (10 mM, pH 8) o senza nucleasi se le applicazioni a valle sono sensibili all'EDTA. - Lascia che la pellet di DNA si risospenda durante la notte a 4 °C.
- Conserva a 4 °C per 2-3 giorni prima di effettuare una valutazione di controllo qualità.
- Conserva a -80 °C per il lungo periodo.
4. Quantificazione del DNA e controllo qualità
NOTA: Il controllo qualità del DNA viene generalmente eseguito utilizzando uno spettrofotometro a microvolume ed elettroforesi su gel. Un sistema di quantificazione basato sulla fluorescenza può anche essere utilizzato per quantificare il DNA estratto.
- Metodo dello spettrofotometro
- Misura la concentrazione di DNA e determina la qualità seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Un campione di DNA idealmente ha un rapporto 260/280 tra 1,7 e 2,0. Un valore di 1,8 è solitamente considerato puro per il DNA. I valori inferiori a questo intervallo indicano contaminazione da proteine residue, guanidina o altri reagenti che si assorbono fortemente a o vicino a 280 nm. Un rapporto 260/230 tra 2,0 e 2,2 è ideale. Se il rapporto è inferiore alle aspettative, ciò può indicare la presenza di contaminanti che si assorbono a 230 nm, come EDTA, fenolo e carboidrati. Controlla anche i grafici di assorbanza ottenuti per il campione.
- Misura la concentrazione di DNA e determina la qualità seguendo le istruzioni del produttore.
- Elettroforesi
- Eseguire l'elettroforesi in geldi agarosio 19 per valutare l'integrità del DNA e determinare se si sia verificata frammentazione o degradazione.
- Per visualizzare il DNA sotto il sistema di documentazione del gel UV, utilizza un gel di agarosio al 1,0% contenente un colorante SYBR Safe. Fai funzionare il gel a 80 V per 45 minuti.
NOTA: L'obiettivo è avere bande chiare, distinte e ad alto peso molecolare sopra la fascia più alta della scala del DNA. Usa ogni volta un buffer TAE 1× fresco.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Questo protocollo di estrazione del DNA utilizzando il metodo CTAB (Figura 1) è stato valutato su varie specie micobatteriche come M. tuberculosis, M. abscessus e M. chelonea. Il DNA è stato estratto e confrontato in termini di ressa, purezza e integrità del DNA estratto tra i campioni.
La concentrazione di DNA variava tra le specie micobatteriche e variava tra 190-600 ng/μL e >1000 ng/μL in alcuni casi,...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I risultati rappresentativi dimostrano l'utilità del metodo CTAB nell'estrazione del DNA da specie micobatteriche e nell'affrontare le sfide associate all'estrazione del DNA da questi organismi. I micobatteri sono ben noti per le loro pareti cellulari complesse e ricche dilipidi 2. I risultati attuali evidenziano diversi aspetti critici che contribuiscono al successo di questa tecnica, poiché fornisce DNA intatto ad alta concentrazione e alta qualità, che dovrebbe...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Gli autori esprimono la loro sincera gratitudine al team di genomica della TB: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa e Rob M Warren, per i loro contributi allo sviluppo e all'ottimizzazione di questo protocollo, nonché per il loro prezioso supporto durante tutto lo studio. Questo lavoro e le persone coinvolte sono stati sostenuti da sovvenzioni e finanziamenti del South African Medical Research Council (SAMRC), della National Research Foundation (NRF) e dell'Università di Stellenbosch (SU). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi o nella preparazione dei manoscritti.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Punte da 1 mL per pipette | Qualsiasi fornitore | ||
| 10 & micro; Punte a L pipette | Qualsiasi fornitore | ||
| 10% Dodecilsolfato di Sodio (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| Tubi di polipropilene da 15 mL | Qualsiasi fornitore | ||
| Tubi da 2 ml e tubi da 1,5 ml | Qualsiasi fornitore | ||
| 200 & micro; Punte per pipette l | Qualsiasi fornitore | ||
| 2-PROPANOLO, BIOREAGENTE, PER MOLECULAR B&; | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Conserva tra -20 e gradi; C |
| 37° Incubatore C | Qualsiasi fornitore | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65 e degna; Incubatore C | Qualsiasi fornitore | ||
| Gel di agarosio | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Sistema di documentazione del gel UV Bio-Rad, | BioRad | ||
| Centrifuga (per tubi da 15 ml da 50 ml) e Microfuge (per tubi da 2 ml) | Qualsiasi fornitore | ||
| CLOROFORMIO PER L'ANALISI EMPARTA & reg; ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Cloroformio/isoamil alcol (24:1) | In una cappa fumi, mescola 384 ml di cloroformio e 16 ml di alcol isoamilico | ||
| Soluzione CTAB/NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Sciogliere 4,1 g di NaCl in 80 ml di acqua distillata. Durante la mescola, aggiungi 10 g di CTAB. Soluzione termica a 65°Deg; Incubatore C. Regola il volume a 100 ml con acqua distillata. Conserva a temperatura ambiente fino a 6 mesi. |
| Scala DNA 1 Kb | Thermo Fisher Scientific | ||
| ALCOL ETILICO, PURO, 200 PROOF, PER MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Mescola 75 ml di etanolo assoluto e 25 ml di acqua distillata |
| Lisozima (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Ricostituire la lisozima liofilizzata (portata a temperatura ambiente) con acqua distillata a 10 mg/ml |
| Media Middlebrook 7H9 | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Segui le linee guida del produttore per la preparazione del mezzo liquido |
| ARRICCHIMENTO MIDDLEBROOK OADC 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Substrati per il Tubo Indicatore di Crescita dei Micobatteri (MGIT) | BD | 245122 | |
| Sistema NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pipetta P10 | Qualsiasi fornitore | ||
| Pipetta P1000 | Qualsiasi fornitore | ||
| Pipetta P200 | Qualsiasi fornitore | ||
| Proteinasi K, ricombussolato, PCR grd 2x250mg | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Ricostituire la fiala di proteinasi K liofilizzata con acqua distillata a 10 mg/ml. Congelare le aliquote in tubi da 2 ml a -20 ° C |
| Sicuro per SYBR | Thermo Fisher Scientific | ||
| Filtro tampone Tris/EDTA (TE) pH 8.0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP o 382499997 | |
| Vortice | Qualsiasi fornitore |
Riferimenti
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
- Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
- Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
- Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
- Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
- Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
- Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
- Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
- Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
- Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
- Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
- Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
- Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
- Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
- Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
- Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
- Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
- Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
- Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
