Descriviamo un protocollo per misurare i contatti tra cellule in strati epiteliali adiacenti in dischi immaginali ali vivi di Drosophila utilizzando un approccio basato sulla ricostituzione GFP.
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Articolo metodologico
Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive
In questo articolo
Sommario
Abstract
La crescita e il patterning dei tessuti embrionali sono in gran parte controllati da segnali scambiati localmente tra le popolazioni cellulari all'interno dei tessuti stessi. I citonemi sono un tipo di filopodi di segnalazione identificati per la prima volta in Drosophila che collegano e mediano lo scambio tra le cellule che producono e ricevono il segnale. Nel disco immaginale dell'ala di Drosophila in via di sviluppo, i citonemi sono coinvolti nello scambio di segnali tra popolazioni distinte di cellule all'interno dell'epitelio del disco vero e proprio (DP), che formerà l'ala adulta, così come tra le cellule DP e le cellule nei tessuti adiacenti associati al disco. I citonemi fanno la sinapsi con le cellule bersaglio per formare contatti intimi con la membrana.
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare il contatto mediato dal citonema tra le cellule DP e le cellule dell'epitelio adiacente della membrana peripodiale (PerM), che è separato dalle cellule DP dal lume del disco, utilizzando un approccio di ricostituzione GFP nei dischi alari vivi. Utilizzando i sistemi GAL4-UAS e LexA-LexAop, frammenti complementari di split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), ciascuno fuso al dominio transmembrana di CD4, sono espressi su entrambi i lati del lume del disco. L'imaging della fluorescenza GFP ricostituita in preparazioni di dischi alari vivi mediante microscopia confocale viene quindi utilizzato per generare stack di immagini da cui è possibile localizzare e quantificare la fluorescenza GFP ricostituita. Utilizzando questo sistema è possibile co-esprimere transgeni codificanti proteine o di interferenza dell'RNA in cellule produttrici di citonemi o bersaglio per misurare il loro effetto sui contatti cellulari DP-PerM. Questo sistema, facilmente adattabile ad altri tessuti, consente quindi l'identificazione di fattori importanti per la formazione o la funzione del citonema.
Introduzione
Lo sviluppo dei tessuti embrionali è controllato da cellule situate in "centri organizzativi" che segnalano alle cellule distanti all'interno di un tessuto, controllando le loro decisioni di proliferare (cioè, crescere e dividersi) oadottare destini particolari. Questa segnalazione cellulare non autonoma è mediata da ligandi prodotti dall'organizzazione delle cellule centrali che formano gradienti di concentrazione attraverso i tessuti e suscitano risposte concentrazione-dipendenti. In molti casi, questi ligandi vengono consegnati o raccolti attraverso lunghi filopodi di segnalazione basati sull'actina chiamati citonemi che collegano le cellule che inviano e ricevono il segnale nei tessuti 2,3. Scoperti per la prima volta nel disco immaginale4 dell'ala di Drosophila, i citonemi sono stati identificati anche nei mammiferi e in altri vertebrati 5,6,7,8,9. Una migliore comprensione del ruolo dei citonemi nella segnalazione cellulare non autonoma, anche se in una fase iniziale, è fondamentale per decifrare come le cellule comunicano per organizzarsi nei tessuti e come queste linee di comunicazione vengono modificate in varie condizioni patologiche, tra cui malformazioni dello sviluppo e cancro.
I citonemi possono estendersi dalle cellule sorgente per fornire ligandi alle cellule bersaglio o dalle cellule bersaglio per ricevere ligandi vicini alle loro fonti 2,3. I citonemi stabiliscono contatti intimi con i loro bersagli, dove si pensa che formino strutture simili a sinapsi, dove può avvenire il trasferimento del ligando 3,10,11. Questo contatto può avvenire tra le punte dei citonemi sorgente e bersaglio o tra i citonemi e i corpi cellulari3. Sebbene non ampiamente caratterizzata, l'adesione cellulare attraverso molecole di adesione o attraverso interazioni recettore-ligando è, in alcuni casi, necessaria per la corretta attivazione degli eventi di segnalazione a valle 12,13,14, rendendo questo un aspetto importante della biologia del citonema.
Diversi studi hanno applicato la tecnica GRASP (GFP reconstitution across synaptic partners) all'analisi dei contatti del citonema. Questo metodo è stato sviluppato per identificare e mappare i partner sinaptici nei sistemi nervosi complessi15. Si basa sull'espressione di due frammenti complementari di split-GFP (spGFP1-10 e spGFP11), ciascuno fuso nella regione extracellulare di un dominio transmembrana (ad esempio di CD4), in diverse popolazioni di cellule. Se le membrane plasmatiche delle cellule di queste due popolazioni entrano in contatto diretto, si avvicinano i domini complementari di spGFP, portando alla ricostituzione della fluorescenza GFP. Questo approccio è stato utilizzato in Drosophila per identificare l'esistenza di contatti di citonema tra le cellule all'interno del disco alare e tra il disco alare e altri tessuti strettamente apposti 12,16,17,18,19,20,21.
Questo articolo descrive l'applicazione di GRASP alla caratterizzazione dei contatti tra due strati epiteliali morfologicamente distinti del disco immaginale dell'ala di Drosophila, il disco vero e proprio (DP) e la membrana peripodiale (PerM). Questi strati epiteliali formano una sacca che circonda un lume centrale, con le cellule DP colonnari pseudostratificate situate da un lato e le cellule PerM squamose dall'altro, entrambe con le membrane apicali rivolte verso l'interno verso il lume (Figura 1A). Ci sono alcune prove di segnalazione transluminale tra i due strati 22,23,24,25, e abbiamo recentemente documentato la segnalazione dal DP per controllare la proliferazione delle cellule PerM che è mediata dai citonomi apicali nel DP 21. Questo protocollo prevede l'utilizzo dei sistemi di espressione transgenica GAL4/UAS e LexA/LexAop per esprimere frammenti complementari di spGFP fusi a CD4 sulle membrane delle cellule DP e PerM. Utilizza la fluorescenza GFP ricostituita per leggere il contatto della membrana tra le due popolazioni cellulari.
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Protocollo
Il driver nubbin-GAL4 viene utilizzato per esprimere CD4-spGFP1-10 in modo specifico nella regione della tasca alare del DP (Figura 1A). Il driver PerM-LexA21 viene utilizzato per esprimere CD4-spGFP11 in modo specifico nel PerM (Figura 1A). Questi due sistemi di espressione sono indipendenti l'uno dall'altro, consentendo l'espressione simultanea e specifica di diversi transgeni in DP e PerM (Figura 1B, C).
Lo schema genetico di base prevede l'incrocio di mosche per generare larve del genotipo nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Come controllo negativo, tralasciamo il transgene LexAop-CD4-spGFP11 . Altri transgeni (ad esempio, RNA a doppio filamento codificante proteine) possono essere espressi a piacere nello strato DP (sotto il controllo di sequenze UAS ) o nel PerM (sotto il controllo dell'operatore LexA).
Si tratta di un protocollo di imaging dal vivo che non può essere interrotto. La preparazione del materiale è stimata in ~10 min. Le dissezioni non devono essere eseguite per più di 20 minuti alla volta prima dell'imaging. L'imaging dura ~30 minuti e non dovrebbe durare più di ~1 ora. Per più condizioni o un numero elevato di campioni, la procedura deve essere eseguita in più cicli per garantire i migliori risultati.
1. Preparazione del materiale
- Prima della dissezione, pinzetta pulita, una piastra di depressione in vetro a 9 pozzetti (o altro contenitore adatto per la raccolta e la pulizia delle larve) e una piastra di Petri riutilizzabile rivestita in Sylgard (silicone) utilizzata per la dissezione con etanolo al 70%.
- Preparare i vetrini da microscopio eseguendo un lavaggio con etanolo al 70% e quindi attaccando un distanziatore di imaging al vetrino essiccato. Tagliare i singoli pozzetti dalla striscia a 8 pozzetti con le forbici e tagliarli a metà (Figura 2A). Rimuovere il supporto protettivo da un lato di ciascuna metà e attaccare i distanziatori alla slitta, leggermente distanziati per creare uno spazio riparato al centro dove verranno posizionati i dischi (Figura 2B).
NOTA: In base alla nostra esperienza, questo semplifica il montaggio del campione poiché il volume preciso del fluido trasferito al vetrino è meno critico. Qualsiasi piccolo volume in eccesso fluirà semplicemente attraverso la fessura durante il vetrino. Poiché immaginiamo solo per un tempo relativamente breve (generalmente ~1 h), non abbiamo riscontrato alcun problema con l'essiccazione media. - Scongelare il terreno di imaging dal vivo ( Drosophila Medium di Schneider non integrato conservato in aliquote congelate da 10 mL) e tenerlo facilmente accessibile in un secchiello del ghiaccio.
- In una provetta da microcentrifuga da 2 mL, miscelare 1,5 mL di terreno con 20 μL di 200 μg/mL Hoechst 33342 (concentrazione finale 2,7 μg/mL). Mantieni il tubo sul ghiaccio.
NOTA: Questa forma specifica di colorante Hoechst viene utilizzata perché è altamente permeabile alla membrana. ATTENZIONE: I guanti devono essere utilizzati quando si maneggia Hoechst 33342. Gli strumenti devono essere lavati dopo l'uso.
2. Dissezione del disco alare e preparazione del vetrino
- Dopo l'incrocio genetico e l'allevamento a 25°C, prelevare le larve vaganti del terzo stadio dal tubo e lavarle in un terreno di imaging vivo freddo in una piastra di depressione in vetro a 9 pozzetti.
NOTA: I citonemi sono molto fragili. Nelle fasi seguenti, è necessario prestare attenzione a manipolare i tessuti attorno ai dischi, cercando di evitare il contatto diretto tra i dischi e gli strumenti di dissezione. Prepariamo tre o quattro larve alla volta, poiché il danneggiamento di alcuni dischi è inevitabile e questo può diventare evidente solo durante le fasi di imaging. - Sotto il microscopio da dissezione, trasferire le larve in una goccia di terreno di imaging vivo su una piastra di Petri rivestita di silicone e iniziare a dissezionare utilizzando due pinze da dissezione. Per fare ciò, prima tieni ferma la testa e la parte anteriore del corpo pizzicando le larve con un paio di pinze a circa un terzo della lunghezza del corpo (dalla parte anteriore). Usando il secondo paio di pinze, pizzica il corpo appena dietro la prima pinza. Quindi, tirare via la parte posteriore delle larve per isolare la "metà" anteriore.
- Capovolgi la metà anteriore fissandola con un paio di pinzette su entrambi i lati dell'estremità tagliata e spingendo la testa con l'altro paio (come capovolgere un calzino), per esporre le strutture interne, inclusi i dischi immaginali, la trachea, le ghiandole salivari, il corpo grasso e l'intestino.
- Rimuovere con cura le ghiandole salivari, il corpo adiposo e l'intestino, facendo attenzione a non disturbare i tronchi laterali della trachea, che dovrebbero sovrastare e proteggere i dischi alari.
- Utilizzare una pinza per trasferire con cura le metà anteriori pulite con i dischi alari attaccati in una goccia di terreno di imaging dal vivo pulito con Hoechst, posizionato tra i distanziatori su un vetrino preparato (Figura 2C). Isolare i dischi alari dal resto dei tessuti sezionandoli delicatamente lontano dai rami sottili della trachea che si collegano al disco, utilizzando una lama della pinza da dissezione o un sottile filo di tungsteno attaccato a un portaaghi da dissezione. Scartare il resto della carcassa.
- Orientare i dischi utilizzando una lama della pinza da dissezione o un ago da dissezione a filo di tungsteno. A causa della loro forma appiattita a forma di goccia, i dischi alari cadranno con il DP o la PerM rivolti verso l'alto. Per questo protocollo, orientare tutti i dischi con il lato PerM rivolto verso l'alto.
- Regolare il volume del mezzo per riempire completamente il pozzetto, leggermente al di sopra del livello del distanziatore di imaging, aggiungendo o rimuovendo il mezzo secondo necessità. Rimuovere il supporto protettivo dal lato superiore di ciascuna metà del distanziatore di imaging, quindi abbassare con cautela un vetrino coprioggetti sul campione. Premere delicatamente sul vetrino coprioggetti nel punto in cui entra in contatto con i distanziatori per immagini (ad esempio, con l'estremità arrotondata della pinza da dissezione) per assicurarsi che il vetrino coprioggetti aderisca al distanziatore.
NOTA: Il livello medio deve essere leggermente superiore all'altezza del distanziatore per evitare di intrappolare bolle d'aria, ma non così alto da generare un flusso significativo quando il vetrino coprioggetti viene abbassato.
3. Imaging
- Imaging di campioni a temperatura ambiente utilizzando un microscopio confocale (laser a ioni argon con lunghezza d'onda di 488 nm per GFP, laser UV con lunghezza d'onda di 350 nm per Hoechst) dotato di lente a immersione in olio 40x/1,30 NA e software di microscopia. Acquisisci stack di immagini con incrementi di 1 μm che vanno da appena sopra il livello più alto della PerM (dove la fluorescenza di Hoechst diminuisce) al lato basale del DP, che generalmente equivale a più di 100 immagini per stack. Acquisisci pile di immagini ripetute per generare filmati timelapse.
NOTA: Immaginiamo una diapositiva per non più di ~1-2 ore. - Per le impostazioni del software del microscopio, acquisire immagini utilizzando la codifica a 8 bit, la media delle linee di 2, il guadagno del rivelatore generalmente compreso tra 650 e 750 e le tracce dei canali separate per ridurre il passaggio del segnale. Utilizzare le impostazioni identiche del laser e del rivelatore per tutte le condizioni, predeterminate eseguendo in anticipo i test su ciascuna condizione.
NOTA: Con un ingrandimento di 40x, le nostre immagini hanno una risoluzione di 5,0386 pixel per μm (dimensione dei pixel: 0,1985 x 0,1985 μm2). Nella nostra configurazione, le impostazioni ottimali del microscopio confocale includevano la massima intensità laser possibile (senza danneggiare il tessuto) per catturare la maggior quantità di segnale possibile, producendo allo stesso tempo una saturazione minima o nulla; e il rumore più basso possibile valutato sui controlli negativi, ottenuto riducendo l'offset del rivelatore e la velocità di acquisizione (se necessario). Generalmente utilizziamo meno del 5% di potenza laser e la velocità massima della testina di scansione ("9" nelle impostazioni del software Zen). L'acquisizione di un singolo stack di immagini richiede in genere ~1 min 45 s e le immagini vengono acquisite ogni 2-3 minuti per le analisi timelapse.
4. Analisi delle immagini
- Proietta pile utilizzando la funzione di proiezione alla massima intensità del pacchetto software ImageJ (fare clic sull'immagine | Pile | Z progetto, selezionare Intensità massima nel menu).
- Nelle immagini MIP, determinare l'area della tasca alare in base al modello di piegatura del disco alare (utilizzando il canale Hoechst) utilizzando la selezione poligonale. Utilizzare la stessa selezione sul canale GFP con la funzione Clear Outside ( fare clic su Modifica | Cancella all'esterno) per impostare ogni valore di pixel esterno su 0.
- Nelle immagini MIP, utilizzare il canale Hoechst per pulire le immagini GFP, rimuovendo in particolare eventuali macchie artefatte che appaiono in entrambi i canali impostando il valore del pixel interessato su 0 (fare clic su Selezione poligono, quindi su Modifica | cancella).
- Nelle immagini MIP pulite, utilizzare la funzione Istogramma (fare clic su Analizza | Istogramma | Elenco) per ottenere e copiare l'elenco di tutti i valori dei pixel in una tabella di un foglio di calcolo.
- Impostare un valore di soglia basato sull'analisi del segnale di fondo nei controlli negativi (e poi verificato in altri campioni; vedi la discussione).
- Calcolate la percentuale di superficie positiva per la GFP utilizzando la seguente formula:
%GFP-superficie positiva =
× 100 - Normalizzare i dati alla fine dividendo ogni valore per la media della condizione di riferimento (che è impostata su 1).
NOTA: Pixel valido = pixel con un valore ≥ 1, ignorando di fatto qualsiasi pixel eliminato il cui valore è stato impostato su 0. I valori dei pixel pari a 0 non si verificano naturalmente. - Per determinare dove si localizza il segnale GFP ricostituito nei dischi, utilizzare sezioni XZ di pile di immagini per osservare l'asse apicobasale dell'epitelio del disco. Esegui le sezioni nelle Figi senza interpolazione e aumenta l'altezza dell'immagine sull'asse Z utilizzando la funzione Scala con interpolazione bilineare per migliorare la visibilità.
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Risultati
Per testare l'utilità della procedura GRASP per misurare i contatti tra le cellule DP e PerM, abbiamo esaminato dischi alari di quattro diversi genotipi: dischi a controllo negativo wild-type (genotipo: w1118) che mostreranno solo i livelli di fondo di autofluorescenza nel canale GFP; dischi che esprimono il CD4-spGFP1-10 nello strato DP, ma privi del transgene CD4-spGFP11, che mostrerà il livello di fluorescenza prodotto dalla sola GFP1-10 (che ci aspettavamo fosse trascurabile, in quanto GFP1-10 non...
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Discussione
I citonemi svolgono un ruolo importante nella distribuzione dei ligandi, controllando la crescita e l'organizzazione dei tessuti in via di sviluppo. Lo scambio di segnale avviene dove le punte del citonema entrano in contatto intimo con i loro bersagli. In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per analizzare i contatti mediati dal citonema tra gli strati epiteliali nel disco alare utilizzando la tecnica GRASP.
La tecnica qui presentata richiede, co...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione CIHR (PJT-162109) a D.H. M.J. ha ottenuto una borsa di dottorato dalla Fondazione Institut de Recherches Cliniques de Montréal e dal Programma di Biologia Molecolare dell'Università di Montreal. Gli autori riconoscono molto l'assistenza della piattaforma di microscopia e imaging IRCM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio di dissezione Discovery V12 | Zeiss | microscopio di dissezione | |
| Pinza Dumont #55, punte per la biologia | Strumenti per la scienza | 11255-20 | pinza da dissezione |
| EP-Slik (slik20358) | BDSC | Panneton et al. 2015 | ceppo di mosca per esprimere Slik |
| FIGI | Schindelin J. et al. (2012) | software di analisi delle immagini | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientifico | H3570 | colorazione nucleare per imaging dal vivo |
| LexAop-CD4-spGFP11 | BDSC | 93018 | ceppo di mosca |
| Microscopio confocale LSM 700 | Zeiss | microscopio confocale | |
| nub-GAL4 | Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (BDSC) | 86108 | ceppo di mosca |
| PerM-LexA | Rambaud, Joseph et al., 2025 | ceppo di mosca | |
| Piastra spot in vetro PYREX a 9 depressionisell | Corning Scienze della Vita | 7220-85 | per la raccolta e il lavaggio delle larve |
| Drosophila di Schneider Medium | ThermoFisher Scientifico | 21720024 | Mezzo di imaging dal vivo |
| Distanziatori di imaging SecureSeal, 8 pozzetti, spessore 0,12 mm | Grace Bio-Labs | 654008 | distanziatore |
| Kit elastomero siliconico SYLGARD 184 | Sylgard | 3097358-1004 | per la realizzazione di piastre di dissezione |
| UAS-CD4-spGFP1-10 | BDSC | 93017 | ceppo di mosca |
| Zen Nero | Zeiss | software di acquisizione |
Riferimenti
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