Un sistema a doppia espressione basato sulla complementazione GFP per la valutazione del contatto cellula-cellula mediato dai citonemi nei dischi immaginali delle ali di Drosophila vive

Summary

Descriviamo un protocollo per misurare i contatti tra cellule in strati epiteliali adiacenti in dischi immaginali ali vivi di Drosophila utilizzando un approccio basato sulla ricostituzione GFP.

Abstract

La crescita e il patterning dei tessuti embrionali sono in gran parte controllati da segnali scambiati localmente tra le popolazioni cellulari all'interno dei tessuti stessi. I citonemi sono un tipo di filopodi di segnalazione identificati per la prima volta in Drosophila che collegano e mediano lo scambio tra le cellule che producono e ricevono il segnale. Nel disco immaginale dell'ala di Drosophila in via di sviluppo, i citonemi sono coinvolti nello scambio di segnali tra popolazioni distinte di cellule all'interno dell'epitelio del disco vero e proprio (DP), che formerà l'ala adulta, così come tra le cellule DP e le cellule nei tessuti adiacenti associati al disco. I citonemi fanno la sinapsi con le cellule bersaglio per formare contatti intimi con la membrana.

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare il contatto mediato dal citonema tra le cellule DP e le cellule dell'epitelio adiacente della membrana peripodiale (PerM), che è separato dalle cellule DP dal lume del disco, utilizzando un approccio di ricostituzione GFP nei dischi alari vivi. Utilizzando i sistemi GAL4-UAS e LexA-LexAop, frammenti complementari di split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), ciascuno fuso al dominio transmembrana di CD4, sono espressi su entrambi i lati del lume del disco. L'imaging della fluorescenza GFP ricostituita in preparazioni di dischi alari vivi mediante microscopia confocale viene quindi utilizzato per generare stack di immagini da cui è possibile localizzare e quantificare la fluorescenza GFP ricostituita. Utilizzando questo sistema è possibile co-esprimere transgeni codificanti proteine o di interferenza dell'RNA in cellule produttrici di citonemi o bersaglio per misurare il loro effetto sui contatti cellulari DP-PerM. Questo sistema, facilmente adattabile ad altri tessuti, consente quindi l'identificazione di fattori importanti per la formazione o la funzione del citonema.

Introduction

Lo sviluppo dei tessuti embrionali è controllato da cellule situate in "centri organizzativi" che segnalano alle cellule distanti all'interno di un tessuto, controllando le loro decisioni di proliferare (cioè, crescere e dividersi) o^{adottare destini} particolari. Questa segnalazione cellulare non autonoma è mediata da ligandi prodotti dall'organizzazione delle cellule centrali che formano gradienti di concentrazione attraverso i tessuti e suscitano risposte concentrazione-dipendenti. In molti casi, questi ligandi vengono consegnati o raccolti attraverso lunghi filopodi di segnalazione basati sull'actina chiamati....

Protocol

Il driver nubbin-GAL4 viene utilizzato per esprimere CD4-spGFP1-10 in modo specifico nella regione della tasca alare del DP (Figura 1A). Il driver PerM-LexA²¹ viene utilizzato per esprimere CD4-spGFP11 in modo specifico nel PerM (Figura 1A). Questi due sistemi di espressione sono indipendenti l'uno dall'altro, consentendo l'espressione simultanea e specifica di diversi transgeni in DP e PerM (Figura 1B, C).

Lo schema genetico di base prevede l'incrocio di mosche per generare larve del genotipo nub-G....

Results

Per testare l'utilità della procedura GRASP per misurare i contatti tra le cellule DP e PerM, abbiamo esaminato dischi alari di quattro diversi genotipi: dischi a controllo negativo wild-type (genotipo: w¹¹¹⁸) che mostreranno solo i livelli di fondo di autofluorescenza nel canale GFP; dischi che esprimono il CD4-spGFP1-10 nello strato DP, ma privi del transgene CD4-spGFP11, che mostrerà il livello di fluorescenza prodotto dalla sola GFP1-10 (che ci aspettavamo fosse trascurabile, in quanto GFP1-10 non.......

Discussion

I citonemi svolgono un ruolo importante nella distribuzione dei ligandi, controllando la crescita e l'organizzazione dei tessuti in via di sviluppo. Lo scambio di segnale avviene dove le punte del citonema entrano in contatto intimo con i loro bersagli. In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per analizzare i contatti mediati dal citonema tra gli strati epiteliali nel disco alare utilizzando la tecnica GRASP.

La tecnica qui presentata richiede, co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio di dissezione Discovery V12	Zeiss		microscopio di dissezione
Pinza Dumont #55, punte per la biologia	Strumenti per la scienza	11255-20	pinza da dissezione
EP-Slik (slik20358)	BDSC	Panneton et al. 2015	ceppo di mosca per esprimere Slik
FIGI		Schindelin J. et al. (2012)	software di analisi delle immagini
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientifico	H3570	colorazione nucleare per imaging dal vivo
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC	93018	ceppo di mosca
Microscopio confocale LSM 700	Zeiss		microscopio confocale
nub-GAL4	Centro di stoccaggio di Drosophila di Bloomington (BDSC)	86108	ceppo di mosca
PerM-LexA		Rambaud, Joseph et al., 2025	ceppo di mosca
Piastra spot in vetro PYREX a 9 depressionisell	Corning Scienze della Vita	7220-85	per la raccolta e il lavaggio delle larve
Drosophila di Schneider Medium	ThermoFisher Scientifico	21720024	Mezzo di imaging dal vivo
Distanziatori di imaging SecureSeal, 8 pozzetti, spessore 0,12 mm	Grace Bio-Labs	654008	distanziatore
Kit elastomero siliconico SYLGARD 184	Sylgard	3097358-1004	per la realizzazione di piastre di dissezione
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC	93017	ceppo di mosca
Zen Nero	Zeiss		software di acquisizione