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Articolo metodologico

Un modello di trapianto intestinale di rigetto dell'innesto di ratto con ileostomia esteriorizzata per la valutazione della prognosi longitudinale

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DOI:

10.3791/68412

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10 giugno 2025

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1Department of Pediatric Surgery, Graduation School of Medicine, The University of Osaka, 2Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, The University of Osaka

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un modello di trapianto intestinale basato su ratto con ileostomia per la valutazione del decorso temporale dell'intervento farmacologico sul rigetto del trapianto.

Abstract

Ad oggi, il trapianto di organi rimane il trattamento principale per l'insufficienza d'organo. Tra i vari organi solidi, la prognosi dei pazienti dopo il trapianto intestinale rimane insoddisfacente, principalmente a causa del rigetto del trapianto. Questa sfida richiede un ulteriore miglioramento delle tecniche chirurgiche o lo sviluppo di nuovi interventi farmacologici post-chirurgici. Questo articolo presenta un modello di ratto di rigetto dell'innesto da trapianto intestinale per fungere da piattaforma per tali indagini. Un segmento dell'ileo isolato dal ceppo Fischer 344 (F344) è stato allotrapiantato in un ratto Lewis (LEW), seguito dalla somministrazione di tacrolimus a una dose e a un programma definiti. È stata costruita un'ileostomia esteriorizzata per consentire il monitoraggio longitudinale non invasivo dello stato tissutale dell'allotrapianto. Un modello di regressione lineare tricromatica è stato addestrato utilizzando immagini di ileostomia e utilizzato per costruire uno schema di valutazione basato su immagini in grado di valutare lo stato dell'ileostomia su una scala da 0 a 10. La valutazione ha indicato un deterioramento della salute dell'allotrapianto a partire dalla terza settimana dopo il trapianto. Le analisi istologiche dell'allotrapianto hanno confermato segni di rigetto cronico dal giorno post-operatorio (POD) 28 in poi, simili a quelli osservati nei pazienti umani, e hanno convalidato i risultati della valutazione dell'immagine dell'ileostomia non invasiva. Si prevede che il modello di allotrapianto intestinale e i metodi di valutazione associati qui presentati facilitino lo sviluppo del trattamento per il trapianto intestinale.

Introduzione

L'insufficienza d'organo è una condizione in cui uno o più organi vitali funzionano in modo non ottimale e non possono sostenere la salute. Il ritardo delle cure mediche è spesso fatale o associato a complicanze secondarie come le infezioni1. Per la maggior parte degli organi, la sostituzione dell'organo malfunzionante è l'unica opzione praticabile per un recupero prolungato. Dalla scoperta della riacquisizione della staminalità da parte delle cellule somatiche2, è stato ipotizzato che queste cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possano consentire la piena organogenesi e fornire una fonte virtualmente illimitata di organi per la sostituzione. Combinando la conoscenza dello sviluppo embrionale con un attento controllo dei segnali di segnalazione, è stato raggiunto il successo nella generazione di più tessuti su scala di organoidi. Per la generazione di organi su larga scala, sebbene siano stati recentemente compiuti progressi significativi in organi specifici come gli occhi 3,4, l'allotrapianto da donatori umani rimane l'approccio principale per la maggior parte degli organi vitali.

Tra gli organi interni, il trapianto intestinale continua a mostrare esiti prognostici insoddisfacenti e richiede un ulteriore perfezionamento chirurgico o un intervento farmacologico5. I nuovi interventi sono raramente testati direttamente su soggetti umani e sono spesso valutati prima in modelli animali di trapianto intestinale. L'articolo descrive in dettaglio un modello di ratto di rigetto del trapianto intestinale che funge da piattaforma di valutazione per questi potenziali progressi terapeutici.

Per imitare la sottile discrepanza dell'antigene leucocitario umano (HLA) osservata nell'uomo, un segmento di ileo (maschile) di sesso corrispondente isolato da un ratto Fischer 344 (F344) è stato trapiantato in un ratto Lewis (LEW), seguito dalla somministrazione di dosi non ottimali dell'immunosoppressore tacrolimus durante la fase acuta per indurre il rigetto del trapianto in fase cronica. Questa coppia donatore-ricevente condivide gli stessi loci del complesso maggiore di istocompatibilità, ma differisce per gli antigeni minori di istocompatibilità6. In questo metodo, una porzione della mucosa trapiantata è stata esteriorizzata come ileostomia per consentire il monitoraggio visivo della prognosi del trapianto e dello stato di rigetto. Inoltre, viene presentato un metodo complementare basato su immagini di ileostomia per la quantificazione dello stato di rigetto, convalidato da corrispondenti cambiamenti istologici nel trapianto trapiantato.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Scuola di Specializzazione in Medicina dell'Università di Osaka, con il numero di riferimento 04-018-003 e sono state eseguite in conformità con le linee guida dell'Università di Osaka. Sono stati utilizzati ratti maschi riceventi Lewis (LEW) (del peso di 200-250 g, 7-9 settimane) e ratti maschio donatore Fischer 344 (F344) (del peso di 200-250 g, 10-12 settimane). Prima dell'intervento chirurgico, la zona addominale è stata rasata e sterilizzata con etanolo al 70%. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Chirurgia del donatore

  1. Digiunare il ratto donatore per 12 ore prima dell'intervento chirurgico.
  2. Anestetizzare il ratto donatore con isoflurano inalato (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Posizionare il ratto perpendicolarmente all'operatore. Impostare lo stereomicroscopio su un ingrandimento 5x durante la procedura. Usa la seta 5-0 per la legatura.
    NOTA: La portata dell'isoflurano era di 1,5 L/min. L'isoflurano è stato somministrato al 2,5% durante l'incisione addominale iniziale e mantenuto all'1,5% durante l'intervento chirurgico. Un'adeguata anestesia è stata confermata dall'assenza di riflesso del dito del piede al pizzicamento del dito. Se necessario, applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza dopo aver confermato l'anestesia.
  3. Eseguire un'incisione della linea mediana di 8 cm per aprire la cavità addominale. Estendere l'incisione superiore al processo xifoideo per garantire una chiara visualizzazione della vena porta (PV).
  4. Sezionare il legamento di Treitz e ruotare l'intestino tenue di 180 gradi in senso orario per invertire la rotazione intestinale.
  5. Osservare le anse vascolari mesenteriche e selezionare un sito di innesto ben vascolarizzato, a circa 10 cm di lunghezza dall'ileo (Figura 1A1).
  6. Sezionare il mesentere distale e legare l'arteria mesenterica superiore (SMA) e la vena mesenterica superiore (SMV) dell'ileo distale. Assicurarsi che SMA/SMV siano tagliati via dalla legatura prossimale. Una legatura impropria può causare sanguinamento e compromettere la perfusione dell'innesto.
  7. Sposta lo stomaco e la milza cranialmente per esporre chiaramente il PV.
  8. Sezionare e legare l'arteria/vena media del colon e l'arteria/vena destra del colon, situate sul lato sinistro della SMA/SMV.
  9. Sezionare il mesentere sul lato destro della SMA/SMV e legare il ramo digiunale. Evitare di legare troppo vicino all'SMV per evitare attorcigliamenti (Figura 1A2).
  10. Separare delicatamente la base della SMA con un batuffolo di cotone e legare il mesentere tra l'aorta sopra la SMA e il PV. Quest'area contiene i linfonodi mesenterici superiori e numerosi vasi linfatici.
  11. Identificare e legare l'arteria renale destra, situata sul lato destro dell'aorta (Figura 1A3).
  12. Iniettare soluzione salina eparinizzata (200 U / 2 mL) nella vena del pene.
  13. Determinare la lunghezza finale dell'innesto e legare i rami mesenterici in eccesso. Legare le arterie diritte sia all'estremità prossimale che a quella distale dell'innesto.
  14. Legare l'aorta sotto la SMA, quindi legare l'aorta sopra la SMA e asportare la base della SMA insieme a una macchia circolare dell'aorta. Tagliare la vena porta in corrispondenza dell'ilo epatico, assicurandosi un taglio obliquo per creare un'ampia apertura anastomotica.
    1. Procedere al taglio delle anse vascolari prossimali e distali e dell'intestino. Porre l'innesto estratto in soluzione salina fredda (4 °C) (Figura 1A4).
  15. Rimuovere la legatura dell'aorta prossimale per indurre il dissanguamento e sopprimere il ratto donatore (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).

2. Elaborazione dell'innesto

  1. Identificare l'arteria mesenterica superiore (SMA) e la vena porta (PV).
  2. Perfondere delicatamente l'innesto con 15 mL di soluzione fisiologica fredda attraverso la SMA (Figura 1B1). Verificare che tutto il sangue sia stato sostituito e che il colore dell'innesto diventi pallido o bianco.
  3. Lavare il lume dell'innesto intestinale e rimuovere il contenuto fecale.
  4. Mantenere l'innesto immerso in soluzione salina fredda fresca fino al trapianto.

3. Chirurgia del ricevente

  1. Anestetizzare il ratto ricevente con isoflurano inalato (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Posizionare il ratto perpendicolarmente all'operatore.
    1. Impostare lo stereomicroscopio su 5× per le procedure generali e su 12,5× durante l'anastomosi vascolare. Usa la seta 5-0 per la legatura e 8-0 Sutura sintetica in polipropilene per anastomosi vascolare. Posiziona il ratto su un termoforo per prevenire l'ipotermia durante l'operazione.
      NOTA: La portata dell'isoflurano era di 1,5 L/min. L'isoflurano è stato somministrato al 2,5% durante l'incisione addominale iniziale e ridotto all'1,5% durante l'intervento chirurgico. L'anestesia è stata confermata dall'assenza di riflesso del dito del piede a seguito di un pizzicamento del dito del piede. Se necessario, applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza dopo la conferma dell'anestesia.
  2. Prima dell'intervento chirurgico, iniettare 0,5 mg/kg di tacrolimus per via intramuscolare. Praticare un'incisione sulla linea mediana (~5 cm) e aprire la cavità addominale.
  3. Muovi l'intestino e il colon cranialmente e seziona il legamento di Treitz. Avvolgere l'intestino e il colon in una garza umida e posizionarli sul corpo del topo.
  4. Sezionare il peritoneo sopra la vena cava inferiore (IVC) e l'aorta (Figura 1B2). Identificare e legare l'arteria gonadica e la vena destra. Individua l'uretere giusto.
  5. Ruotare il ratto di 90° in senso antiorario in modo che la testa sia rivolta verso la sinistra dell'operatore. Bloccare l'IVC sopra la vena renale destra utilizzando un morsetto vascolare Bulldog curvo.
  6. Incidi la parete IVC con le forbici per creare un'apertura ovale. Lavare con soluzione fisiologica e posizionare una sutura a stecchino sul bordo caudale dell'IVC (Figura 1B3-1). Assicurarsi che l'apertura anastomotica venosa sia ampia (~1 cm) e allungare adeguatamente la parete fotovoltaica in corrispondenza dell'anastomosi.
  7. Posizionare l'innesto sul lato sinistro del ratto, posizionando la PV e la SMA vicino all'IVC e all'aorta. Orientare l'ileo distale verso la testa. Avvolgere l'innesto in una garza fredda e umida e applicare del ghiaccio per mantenere una bassa temperatura.
  8. Far passare l'ago da sutura a tenuta stagna (sutura in polipropilene sintetico 8-0) attraverso il bordo caudale del PV. Utilizzare una pinza antizanzare per controllare la tensione della sutura.
  9. Sutura e lega il bordo cranico del PV all'IVC (PV to IVC). Anastomizzare la parete PV posteriore (da IVC a PV) (Figura 1B3-2). Legare la sutura di stazionamento sul bordo destro del PV. Successivamente, anastomizzare la parete PV anteriore (da PV a IVC).
    1. Prima di completare l'anastomosi, bloccare il PV dell'innesto e iniettare soluzione salina eparinzzata. Legare la sutura e rilasciare il morsetto IVC (Figura 1B3-3).
      NOTA: Il sanguinamento iniziale può verificarsi durante l'anastomosi, ma in genere è controllato spontaneamente.
  10. Bloccare l'aorta sopra la biforcazione dell'arteria iliaca con un morsetto Bulldog curvo.
  11. Incidere la parete aortica. Posizionare una sutura a stecchino (sutura in polipropilene sintetico 8-0) sul bordo cranico dell'aorta e della SMA (~4-5 mm) (Figura 1B4-1). Tenere la sutura dello strallo con una pinza antizanzare per controllare la tensione.
  12. Passa un altro 8-0 ago attraverso il bordo caudale della SMA e dell'aorta. Legare e iniziare l'anastomosi sul lato destro del ratto (Figura 1B4-2). Legare la sutura di soggiorno.
  13. Ruotare il ratto di 180° in modo che la testa sia rivolta verso la destra dell'operatore. Completare l'anastomosi SMA-aorta sul lato sinistro. Prima della sutura finale, bloccare il PV dell'innesto e iniettare soluzione salina eparinizzata. Legare la sutura (Figura 1B4-3).
  14. Rilasciare i morsetti aortico e PV per la riperfusione (Figura 1B5). Può verificarsi un sanguinamento iniziale, ma può essere controllato con una leggera pressione utilizzando un batuffolo di cotone. La mucosa dell'innesto dovrebbe diventare rosa in pochi minuti (Figura 1B6).
  15. Ruota il ratto di 90° in modo che la testa sia rivolta verso il lato opposto. Praticare due incisioni cutanee di 8 mm sull'addome destro ed esteriorizzare le estremità prossimale e distale dell'innesto ileale.
    1. Sutura la pelle e innesto di sierosa utilizzando 5-0 polidiossanone (PDS) (Figura 1B7). Chiudere l'incisione della linea mediana con PDS 5-0 per completare l'intervento chirurgico.
      NOTA: I ratti post-operatori devono essere attentamente monitorati fino al completo recupero di coscienza. Non tornare nella gabbia fino a quando non si è raggiunta la decubito sternale.

4. Gestione post-operatoria

  1. Per mantenere l'innesto durante la fase acuta, iniettare tacrolimus a 0,5 mg/kg per via intramuscolare nei giorni post-operatori (POD) 1-13, 20 e 277.
    NOTA: Somministrare iniezioni consecutive a gambe alternate. In alternativa, il tacrolimus può essere somministrato per via sottocutanea.
  2. Iniettare meloxicam a 0,4 mg/kg per via sottocutanea su POD 1-3.
    NOTA: I ratti riceventi in genere perdono peso fino al POD 7, con recupero dal POD 14. Possono essere somministrate iniezioni di soluzione salina sottocutanea per mitigare la disidratazione dovuta alla perdita di liquidi dall'ileostomia. La mortalità inaspettata si verifica in circa il 20% dei casi prima del POD 7. La sopravvivenza e la salute generale sono in genere stabili in seguito.

5. Valutazione dell'immagine dello stato di salute dell'innesto intestinale

  1. Aprire un'immagine dell'ileostomia in ImageJ. Converti l'immagine in una pila RGB selezionando Tipo > immagine > Pila RGB.
    NOTA: Se l'immagine non è già in formato RGB, convertirla prima in colore RGB utilizzando Tipo di > immagine > Colore RGB.
  2. Selezionare una regione di interesse (ROI) che includa solo l'area della mucosa visibile dell'ileostomia.
  3. Misura l'intensità di ciascun canale (rosso, verde e blu) all'interno del ROI selezionato.
  4. Calcola il punteggio di salute dell'innesto utilizzando la seguente formula:
    Punteggio = figure-protocol-1
    NOTA: Normalizzare il punteggio finale in modo che: Se il punteggio > 10, assegnare un valore di 10; Se Punteggio < 0, assegnare un valore pari a 0.

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Risultati

Le immagini rappresentative dei principali punti di controllo chirurgici sono mostrate nella Figura 1. Il tasso di successo della riperfusione è stato di quasi il 100% e il tasso di sopravvivenza post-operatoria è stato dell'80,0% (20 su 25 interventi chirurgici). Quando le procedure sono state eseguite correttamente e il tacrolimus è stato somministrato al dosaggio e al programma specificati, l'ileostomia esteriorizzata è diventata tipicamente biancastra - un'indicazione di rigetto del trap...

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Discussione

Mentre gli studi sugli animali sono essenziali per lo sviluppo di interventi chirurgici e farmacologici migliorati per migliori risultati a breve e lungo termine del trapianto intestinale, è stato empiricamente difficile stabilire la tecnica della chirurgia del trapianto intestinale nei ratti. Qui vengono descritte in dettaglio le procedure chirurgiche di trapianto intestinale eterotopico. In questo metodo, i tempi di intervento del donatore e del ricevente erano rispettivamente di circa...

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Dichiarazioni

Ka.T. è un fondatore scientifico, azionista e ha ricevuto finanziamenti per la ricerca da StemRIM Inc. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Il Center for Medical Research and Education, Graduate School of Medicine, The University of Osaka, ha fornito gli strumenti necessari per l'imaging microscopico confocale degli allotrapianti. Il lavoro è stato sostenuto da un fondo di ricerca da StemRIM a Ka.T..

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-0 seta intrecciata 40cm nero Alfresa Pharma62-9965-34
5-0 seta intrecciata 40cm bianco Alfresa Pharma62-9964-99
8-0 PROLENE BV130-5 45cmETHICONEP8730H
Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG(H+L)InvitrogenCodice: A11005Conc. di lavoro: 2ug/ml
Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG(H+L)InvitrogenCodice A21245Conc. di lavoro: 2ug/ml
Porta aghi Barraquer Micro, ganascia CVD da 8 mm, 6"
Morsetto vascolare Bulldog 35mmNatsumeC-42-S-2
Fischer 344 (F344)   Giappone SLC (Shizuoka, Giappone)donatore, maschio, da 10 a 12 settimane
Ratti di Lewis (LEW) Giappone SLC (Shizuoka, Giappone)riceventi, maschi, da 7 a 9 settimane
MicroforbiciYDMCC06C
Pinze per sutura per microchirurgia - Curve, piattaforme, impugnature rotonde: 15 cm/6 pollici
Ms mAb a collagene IabcamAB90395Conc. di lavoro: diluizione 1000x
SOLUZIONE SALINA NORMALE 500 mLOTSUKA Codice 3311401A8024
Doppia pinza vascolare in plasticaFormazione in microchirurgia ltd
Prograf iniezione 5 mgAstellas PharmaCodice 3999416A1028
Rb pAb a LamininaabcamAB11575Conc. di lavoro: 2ug/ml
Anestesista per piccoli animaliMuromachi kikaiMK-A100
Microscopio operatorio OPMI-1FRCarl ZeissOPMI-1FR
SUTURA, 5/0 18 PDS II CLR MONO P, VAETHICONZ493G

Riferimenti

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