Un modello di trapianto intestinale di rigetto dell'innesto di ratto con ileostomia esteriorizzata per la valutazione della prognosi longitudinale

L'insufficienza d'organo è una condizione in cui uno o più organi vitali funzionano in modo non ottimale e non possono sostenere la salute. Il ritardo delle cure mediche è spesso fatale o associato a complicanze secondarie come le infezioni¹. Per la maggior parte degli organi, la sostituzione dell'organo malfunzionante è l'unica opzione praticabile per un recupero prolungato. Dalla scoperta della riacquisizione della staminalità da parte delle cellule somatiche², è stato ipotizzato che queste cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possano consentire la piena organogenesi e fornire una fonte virtualmente illimitata di organi per la sostituzione. Combinando la conoscenza dello sviluppo embrionale con un attento controllo dei segnali di segnalazione, è stato raggiunto il successo nella generazione di più tessuti su scala di organoidi. Per la generazione di organi su larga scala, sebbene siano stati recentemente compiuti progressi significativi in organi specifici come gli occhi ^3,4, l'allotrapianto da donatori umani rimane l'approccio principale per la maggior parte degli organi vitali.

Tra gli organi interni, il trapianto intestinale continua a mostrare esiti prognostici insoddisfacenti e richiede un ulteriore perfezionamento chirurgico o un intervento farmacologico⁵. I nuovi interventi sono raramente testati direttamente su soggetti umani e sono spesso valutati prima in modelli animali di trapianto intestinale. L'articolo descrive in dettaglio un modello di ratto di rigetto del trapianto intestinale che funge da piattaforma di valutazione per questi potenziali progressi terapeutici.

Per imitare la sottile discrepanza dell'antigene leucocitario umano (HLA) osservata nell'uomo, un segmento di ileo (maschile) di sesso corrispondente isolato da un ratto Fischer 344 (F344) è stato trapiantato in un ratto Lewis (LEW), seguito dalla somministrazione di dosi non ottimali dell'immunosoppressore tacrolimus durante la fase acuta per indurre il rigetto del trapianto in fase cronica. Questa coppia donatore-ricevente condivide gli stessi loci del complesso maggiore di istocompatibilità, ma differisce per gli antigeni minori di istocompatibilità⁶. In questo metodo, una porzione della mucosa trapiantata è stata esteriorizzata come ileostomia per consentire il monitoraggio visivo della prognosi del trapianto e dello stato di rigetto. Inoltre, viene presentato un metodo complementare basato su immagini di ileostomia per la quantificazione dello stato di rigetto, convalidato da corrispondenti cambiamenti istologici nel trapianto trapiantato.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Scuola di Specializzazione in Medicina dell'Università di Osaka, con il numero di riferimento 04-018-003 e sono state eseguite in conformità con le linee guida dell'Università di Osaka. Sono stati utilizzati ratti maschi riceventi Lewis (LEW) (del peso di 200-250 g, 7-9 settimane) e ratti maschio donatore Fischer 344 (F344) (del peso di 200-250 g, 10-12 settimane). Prima dell'intervento chirurgico, la zona addominale è stata rasata e sterilizzata con etanolo al 70%. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Chirurgia del donatore

1. Digiunare il ratto donatore per 12 ore prima dell'intervento chirurgico.
2. Anestetizzare il ratto donatore con isoflurano inalato (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Posizionare il ratto perpendicolarmente all'operatore. Impostare lo stereomicroscopio su un ingrandimento 5x durante la procedura. Usa la seta 5-0 per la legatura.
   NOTA: La portata dell'isoflurano era di 1,5 L/min. L'isoflurano è stato somministrato al 2,5% durante l'incisione addominale iniziale e mantenuto all'1,5% durante l'intervento chirurgico. Un'adeguata anestesia è stata confermata dall'assenza di riflesso del dito del piede al pizzicamento del dito. Se necessario, applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza dopo aver confermato l'anestesia.
3. Eseguire un'incisione della linea mediana di 8 cm per aprire la cavità addominale. Estendere l'incisione superiore al processo xifoideo per garantire una chiara visualizzazione della vena porta (PV).
4. Sezionare il legamento di Treitz e ruotare l'intestino tenue di 180 gradi in senso orario per invertire la rotazione intestinale.
5. Osservare le anse vascolari mesenteriche e selezionare un sito di innesto ben vascolarizzato, a circa 10 cm di lunghezza dall'ileo (Figura 1A1).
6. Sezionare il mesentere distale e legare l'arteria mesenterica superiore (SMA) e la vena mesenterica superiore (SMV) dell'ileo distale. Assicurarsi che SMA/SMV siano tagliati via dalla legatura prossimale. Una legatura impropria può causare sanguinamento e compromettere la perfusione dell'innesto.
7. Sposta lo stomaco e la milza cranialmente per esporre chiaramente il PV.
8. Sezionare e legare l'arteria/vena media del colon e l'arteria/vena destra del colon, situate sul lato sinistro della SMA/SMV.
9. Sezionare il mesentere sul lato destro della SMA/SMV e legare il ramo digiunale. Evitare di legare troppo vicino all'SMV per evitare attorcigliamenti (Figura 1A2).
10. Separare delicatamente la base della SMA con un batuffolo di cotone e legare il mesentere tra l'aorta sopra la SMA e il PV. Quest'area contiene i linfonodi mesenterici superiori e numerosi vasi linfatici.
11. Identificare e legare l'arteria renale destra, situata sul lato destro dell'aorta (Figura 1A3).
12. Iniettare soluzione salina eparinizzata (200 U / 2 mL) nella vena del pene.
13. Determinare la lunghezza finale dell'innesto e legare i rami mesenterici in eccesso. Legare le arterie diritte sia all'estremità prossimale che a quella distale dell'innesto.
14. Legare l'aorta sotto la SMA, quindi legare l'aorta sopra la SMA e asportare la base della SMA insieme a una macchia circolare dell'aorta. Tagliare la vena porta in corrispondenza dell'ilo epatico, assicurandosi un taglio obliquo per creare un'ampia apertura anastomotica.
    1. Procedere al taglio delle anse vascolari prossimali e distali e dell'intestino. Porre l'innesto estratto in soluzione salina fredda (4 °C) (Figura 1A4).
15. Rimuovere la legatura dell'aorta prossimale per indurre il dissanguamento e sopprimere il ratto donatore (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).

2. Elaborazione dell'innesto

1. Identificare l'arteria mesenterica superiore (SMA) e la vena porta (PV).
2. Perfondere delicatamente l'innesto con 15 mL di soluzione fisiologica fredda attraverso la SMA (Figura 1B1). Verificare che tutto il sangue sia stato sostituito e che il colore dell'innesto diventi pallido o bianco.
3. Lavare il lume dell'innesto intestinale e rimuovere il contenuto fecale.
4. Mantenere l'innesto immerso in soluzione salina fredda fresca fino al trapianto.

3. Chirurgia del ricevente

1. Anestetizzare il ratto ricevente con isoflurano inalato (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Posizionare il ratto perpendicolarmente all'operatore.
   1. Impostare lo stereomicroscopio su 5× per le procedure generali e su 12,5× durante l'anastomosi vascolare. Usa la seta 5-0 per la legatura e 8-0 Sutura sintetica in polipropilene per anastomosi vascolare. Posiziona il ratto su un termoforo per prevenire l'ipotermia durante l'operazione.
      NOTA: La portata dell'isoflurano era di 1,5 L/min. L'isoflurano è stato somministrato al 2,5% durante l'incisione addominale iniziale e ridotto all'1,5% durante l'intervento chirurgico. L'anestesia è stata confermata dall'assenza di riflesso del dito del piede a seguito di un pizzicamento del dito del piede. Se necessario, applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza dopo la conferma dell'anestesia.
2. Prima dell'intervento chirurgico, iniettare 0,5 mg/kg di tacrolimus per via intramuscolare. Praticare un'incisione sulla linea mediana (~5 cm) e aprire la cavità addominale.
3. Muovi l'intestino e il colon cranialmente e seziona il legamento di Treitz. Avvolgere l'intestino e il colon in una garza umida e posizionarli sul corpo del topo.
4. Sezionare il peritoneo sopra la vena cava inferiore (IVC) e l'aorta (Figura 1B2). Identificare e legare l'arteria gonadica e la vena destra. Individua l'uretere giusto.
5. Ruotare il ratto di 90° in senso antiorario in modo che la testa sia rivolta verso la sinistra dell'operatore. Bloccare l'IVC sopra la vena renale destra utilizzando un morsetto vascolare Bulldog curvo.
6. Incidi la parete IVC con le forbici per creare un'apertura ovale. Lavare con soluzione fisiologica e posizionare una sutura a stecchino sul bordo caudale dell'IVC (Figura 1B3-1). Assicurarsi che l'apertura anastomotica venosa sia ampia (~1 cm) e allungare adeguatamente la parete fotovoltaica in corrispondenza dell'anastomosi.
7. Posizionare l'innesto sul lato sinistro del ratto, posizionando la PV e la SMA vicino all'IVC e all'aorta. Orientare l'ileo distale verso la testa. Avvolgere l'innesto in una garza fredda e umida e applicare del ghiaccio per mantenere una bassa temperatura.
8. Far passare l'ago da sutura a tenuta stagna (sutura in polipropilene sintetico 8-0) attraverso il bordo caudale del PV. Utilizzare una pinza antizanzare per controllare la tensione della sutura.
9. Sutura e lega il bordo cranico del PV all'IVC (PV to IVC). Anastomizzare la parete PV posteriore (da IVC a PV) (Figura 1B3-2). Legare la sutura di stazionamento sul bordo destro del PV. Successivamente, anastomizzare la parete PV anteriore (da PV a IVC).
   1. Prima di completare l'anastomosi, bloccare il PV dell'innesto e iniettare soluzione salina eparinzzata. Legare la sutura e rilasciare il morsetto IVC (Figura 1B3-3).
      NOTA: Il sanguinamento iniziale può verificarsi durante l'anastomosi, ma in genere è controllato spontaneamente.
10. Bloccare l'aorta sopra la biforcazione dell'arteria iliaca con un morsetto Bulldog curvo.
11. Incidere la parete aortica. Posizionare una sutura a stecchino (sutura in polipropilene sintetico 8-0) sul bordo cranico dell'aorta e della SMA (~4-5 mm) (Figura 1B4-1). Tenere la sutura dello strallo con una pinza antizanzare per controllare la tensione.
12. Passa un altro 8-0 ago attraverso il bordo caudale della SMA e dell'aorta. Legare e iniziare l'anastomosi sul lato destro del ratto (Figura 1B4-2). Legare la sutura di soggiorno.
13. Ruotare il ratto di 180° in modo che la testa sia rivolta verso la destra dell'operatore. Completare l'anastomosi SMA-aorta sul lato sinistro. Prima della sutura finale, bloccare il PV dell'innesto e iniettare soluzione salina eparinizzata. Legare la sutura (Figura 1B4-3).
14. Rilasciare i morsetti aortico e PV per la riperfusione (Figura 1B5). Può verificarsi un sanguinamento iniziale, ma può essere controllato con una leggera pressione utilizzando un batuffolo di cotone. La mucosa dell'innesto dovrebbe diventare rosa in pochi minuti (Figura 1B6).
15. Ruota il ratto di 90° in modo che la testa sia rivolta verso il lato opposto. Praticare due incisioni cutanee di 8 mm sull'addome destro ed esteriorizzare le estremità prossimale e distale dell'innesto ileale.
    1. Sutura la pelle e innesto di sierosa utilizzando 5-0 polidiossanone (PDS) (Figura 1B7). Chiudere l'incisione della linea mediana con PDS 5-0 per completare l'intervento chirurgico.
       NOTA: I ratti post-operatori devono essere attentamente monitorati fino al completo recupero di coscienza. Non tornare nella gabbia fino a quando non si è raggiunta la decubito sternale.

4. Gestione post-operatoria

1. Per mantenere l'innesto durante la fase acuta, iniettare tacrolimus a 0,5 mg/kg per via intramuscolare nei giorni post-operatori (POD) 1-13, 20 e 27⁷.
   NOTA: Somministrare iniezioni consecutive a gambe alternate. In alternativa, il tacrolimus può essere somministrato per via sottocutanea.
2. Iniettare meloxicam a 0,4 mg/kg per via sottocutanea su POD 1-3.
   NOTA: I ratti riceventi in genere perdono peso fino al POD 7, con recupero dal POD 14. Possono essere somministrate iniezioni di soluzione salina sottocutanea per mitigare la disidratazione dovuta alla perdita di liquidi dall'ileostomia. La mortalità inaspettata si verifica in circa il 20% dei casi prima del POD 7. La sopravvivenza e la salute generale sono in genere stabili in seguito.

5. Valutazione dell'immagine dello stato di salute dell'innesto intestinale

1. Aprire un'immagine dell'ileostomia in ImageJ. Converti l'immagine in una pila RGB selezionando Tipo > immagine > Pila RGB.
   NOTA: Se l'immagine non è già in formato RGB, convertirla prima in colore RGB utilizzando Tipo di > immagine > Colore RGB.
2. Selezionare una regione di interesse (ROI) che includa solo l'area della mucosa visibile dell'ileostomia.
3. Misura l'intensità di ciascun canale (rosso, verde e blu) all'interno del ROI selezionato.
4. Calcola il punteggio di salute dell'innesto utilizzando la seguente formula:
   Punteggio =
   NOTA: Normalizzare il punteggio finale in modo che: Se il punteggio > 10, assegnare un valore di 10; Se Punteggio < 0, assegnare un valore pari a 0.

Le immagini rappresentative dei principali punti di controllo chirurgici sono mostrate nella Figura 1. Il tasso di successo della riperfusione è stato di quasi il 100% e il tasso di sopravvivenza post-operatoria è stato dell'80,0% (20 su 25 interventi chirurgici). Quando le procedure sono state eseguite correttamente e il tacrolimus è stato somministrato al dosaggio e al programma specificati, l'ileostomia esteriorizzata è diventata tipicamente biancastra - un'indicazione di rigetto del trapianto - a partire dalla terza settimana dopo l'intervento chirurgico (Figura 2A, B). Al contrario, gli innesti singenici (LEW→LEW), che non suscitano una risposta di rigetto, hanno mantenuto una buona salute a lungo termine (Figura 2B). Il monitoraggio longitudinale dell'aspetto dell'ileostomia utilizzando un modello di regressione tricromatica (i dettagli sulle prestazioni dell'allenamento e sull'output della regressione sono forniti nel File supplementare 1) ha fornito informazioni quantitative sullo stato di salute e di rigetto dell'innesto (Figura 2A, C). L'analisi istologica ha rivelato la perdita di strutture epiteliali, come villi e cripte - caratteristiche chiave per la funzione e il mantenimento intestinale - insieme all'ispessimento della sottomucosa ricca di matrice extracellulare (ECM) nei giorni post-operatori 28 e 45 (Figura 3A, B).

Figura 1: Immagini operative rappresentative del trapianto intestinale di ratto. (A) Chirurgia del donatore. (1) L'intestino tenue del ratto donatore; La regione di innesto prevista è indicata dalle frecce bianche. (2) L'innesto a seguito di dissezione di rami mesenterici. PV: vena porta; SMV: vena mesenterica superiore; SMA: arteria mesenterica superiore. (3) Dissezione del peritoneo attorno all'aorta e alla radice della SMA. L'arteria renale destra (RRA) è identificata tra l'aorta e la vena cava inferiore (IVC). (4) L'innesto prima dell'estrazione. Le frecce indicano le estremità prossimale e distale del segmento intestinale da estrarre; Le linee tratteggiate nere segnano i siti di transezione. (B) Preparazione del tavolo posteriore e chirurgia del ricevente. (1) L'innesto a seguito di perfusione SMA con soluzione fisiologica, evidenziato dal suo aspetto sbiancato. (2) L'aorta e l'IVC del ricevente; Gli ovali rossi e blu indicano i siti previsti per l'anastomosi. (3-1) L'IVC ricevente prima dell'anastomosi, con una sutura di stazionamento sul bordo caudale dell'apertura IVC. (3-2) Completamento dell'anastomosi della parete posteriore tra la vena porta (PV) e l'IVC. (3-3) Anastomosi PV-IVC completa; il PV dell'innesto viene bloccato e l'IVC viene aperto. (4-1) Anastomosi tra l'aorta del ricevente e la SMA del donatore, con una sutura di soggiorno sul bordo cranico. (4-2) Completamento dell'anastomosi della parete sinistra. (4-3) Anastomosi SMA-aorta completa. (5) L'innesto prima della riperfusione. (6) L'innesto dopo una riperfusione riuscita. (7) Posizionamento di ileostomie dalle estremità prossimale e distale dell'innesto, posizionate a destra dell'incisione della linea mediana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Monitoraggio basato su immagini della salute del trapianto intestinale attraverso la valutazione dell'ileostomia. (A) Schema che mostra lo sviluppo di un modello di regressione lineare per calcolare i punteggi dello stato di salute del trapianto in base alle intensità RGB dalle immagini dell'ileostomia. (B) Immagini rappresentative e punteggi calcolati dello stato di salute dell'ileostomia durante la sequenza temporale del rigetto. Un'immagine di un innesto singenico il giorno post-operatorio (POD) 127 è mostrata come riferimento per la salute del trapianto a lungo termine. Ogni regione dell'ileostomia rappresenta un'area di 1 cm × 1 cm. Barre della scala: 1 mm. (C) Monitoraggio dell'andamento temporale dei punteggi dello stato di salute per due innesti. POD: giorno post-operatorio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi istologica dell'innesto intestinale. (A) Immagini al microscopio confocale della distribuzione della matrice cellulare ed extracellulare (ECM) in criosezioni da 14 μm dell'innesto presso i POD indicati, con inserti sottomucosi. (B) Colorazione con rosso Sirio del collagene in criosezioni da 6 μm da innesti raccolti su POD 45. Barre di scala: 100 μm; 20 μm negli inserti. Gli asterischi indicano la superficie epiteliale intestinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Abbondanza di macrofagi intestinali omeostatici S1 come marcatore prognostico della salute del trapianto. (A) Visualizzazione UMAP di trascrittomi a singola cellula che mostrano il raggruppamento di macrofagi intestinali omeostatici Cx3cr1+, Mrc1+ e Timp2+ (punte di freccia), basata su un set di dati pubblico GSE167460. (B) Il punteggio di identità basato su MIKA conferma una forte identità dei macrofagi S1 in queste popolazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Metriche delle prestazioni di addestramento e dati di output del modello di regressione tricromatica utilizzato per il monitoraggio longitudinale dell'aspetto dell'ileostomia. Clicca qui per scaricare questo file.

Ka.T. è un fondatore scientifico, azionista e ha ricevuto finanziamenti per la ricerca da StemRIM Inc. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.