Articolo metodologico

Bioprinting di fette tumorali in idrogel come modello 3D per il linfoma mantellare

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DOI:

10.3791/68417

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12 settembre 2025

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1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della generazione, della coltura e dell'analisi del linfoma mantellare in fette tumorali di idrogel stampate in 3D.

Abstract

Il linfoma mantellare (MCL) è una neoplasia rara e aggressiva delle cellule B che recidiva frequentemente e mostra solo una risposta limitata alla chemioterapia convenzionale. Una delle principali sfide nella ricerca sull'MCL è la coltura di cellule MCL primarie ex vivo, poiché le cellule tendono a subire l'apoptosi spontanea quando vengono coltivate in coltura in sospensione 2D. Sebbene sia noto che i modelli 3D ricapitolano meglio la situazione in vivo dei tumori solidi, la loro applicazione è ancora poco esplorata nei linfomi. Lo sviluppo di modelli 3D che replicano le condizioni in vivo di MCL all'interno del linfonodo potrebbe migliorare la loro sopravvivenza, facilitare lo studio del crosstalk MCL-microambiente tumorale e imitare la risposta ai farmaci in vivo . Qui, è stato stabilito un modello stampato in 3D di MCL sotto forma di fette tumorali di idrogel, insieme a un metodo di coltura ottimizzato. È stato sviluppato un processo standardizzato utilizzando linee cellulari MCL o cellule MCL primarie, in cui le cellule vengono immerse in un idrogel contenente alginato, collagene di tipo I e matrice di membrana basale mediante bioprinting in un bagno di supporto in gelatina. Le fette tumorali di idrogel MCL risultanti vengono coltivate su un supporto filtrante per mantenerne la stabilità durante tutto il periodo di coltura. I trattamenti farmacologici possono essere applicati al sistema. La risposta delle singole cellule all'interno della fetta tumorale in idrogel può essere monitorata mediante imaging a fluorescenza 3D in tempo reale a quattro colori. Le cellule MCL primarie hanno dimostrato una vitalità stabile quando coltivate nelle fette tumorali di idrogel. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della generazione, della coltura e dell'analisi delle cellule MCL in fette tumorali di idrogel. Imitando da vicino il microambiente tumorale e utilizzando una coltura di interfaccia aria-liquido, il modello presentato migliora la rilevanza fisiologica rispetto alla tradizionale coltura 2D. Offre un potenziale significativo per l'avanzamento degli studi sia biologici che terapeutici sull'MCL.

Introduzione

Il linfoma mantellare (MCL) è un linfoma non-Hodgkin a cellule B raro e aggressivo che origina dalla zona mantellare dei linfonodi1. La zona del mantello è composta da un anello di piccoli linfociti che circondano il centro germinale del follicolo delle cellule B. Tipicamente, l'MCL mostra un decorso clinico aggressivo, con frequenti recidive dopo la chemioterapia iniziale. Grazie a una migliore comprensione della formazione della malattia1 e allo sviluppo di nuovi trattamenti, tra cui l'immunochemioterapia2, gli inibitori della tirosin-chinasi di Bruton3 o i coniugati anticorpo-farmaco4, le opzioni terapeutiche per i pazienti con MCL hanno portato a un miglioramento dei tassi di risposta e a una sopravvivenza libera da progressione prolungata. Tuttavia, la resistenza ai farmaci e le recidive rendono ancora la malattia incurabile5. In parte, questa è una conseguenza della sua eterogeneità e dell'influenza del microambiente tumorale sullo sviluppo del tumore e sulla resistenza ai farmaci6. Una sfida nello studio dell'MCL è la difficoltà di coltivare cellule MCL primarie in colturain sospensione 7, poiché le cellule subiscono l'apoptosi spontanea ex vivo 4,5. Ciò evidenzia la necessità di approcci alternativi per modellare meglio l'MCL nei modelli preclinici.

In vivo, i tumori sono strutture tridimensionali (3D) composte da vari componenti cellulari, tra cui cellule tumorali, cellule immunitarie e cellule stromali, nonché componenti non cellulari come la matrice extracellulare (ECM). La MEC, che consiste di macromolecole come il collagene e la laminina, forma una complessa rete fibrosa di fibre elastiche altamente idrofile, creando un ambiente gelatinoso 2,8,9,10. Per replicare meglio queste condizioni in vivo dei tumori ex vivo, è stata sviluppata una varietà di modelli 3D. Negli ultimi anni, questi modelli sono diventati cruciali per lo studio della farmacologia e della biologia del cancro, concentrandosi principalmente sui tumori solidi11.

Ad oggi, questo campo rimane poco esplorato nei linfomi, poiché le cellule tumorali ematologiche hanno la capacità di crescere sia in sospensione che in ambienti stromali come i linfonodi, il midollo osseo o i tessuti linfoidi secondari12. In vivo, le cellule MCL si disseminano dalla zona del mantello dei linfonodi nel sangue o nel midollo osseo, sebbene proliferino principalmente all'interno dei linfonodi da cui hanno origine13,14. All'interno dei linfonodi, le cellule MCL sono circondate da cellule T, macrofagi e cellule stromali mesenchimali, che hanno dimostrato di controllare la sopravvivenza o la risposta ai farmaci delle cellule MCL 14,15,16,17,18. Inoltre, il crosstalk MCL-microambiente tumorale, così come la porosità e le proprietà meccaniche, sono fattori importanti che possono influenzare le risposte e la resistenza ai farmaci 6,14. Pertanto, per studiare l'MCL primario sono necessari modelli tumorali 3D standardizzati e riproducibili di MCL che simulino il microambiente nativo. Finora, sono stati stabiliti principalmente modelli basati su cellule cellulari come sferoidi o organoidi di cellule MCL primarie 6,19. Migliorano con successo la vitalità e la coltura a lungo termine delle cellule MCL primarie. Tuttavia, la matrice extracellulare è sottorappresentata in questi modelli. In questo contesto, il bioprinting 3D avanzato offre un approccio promettente. Assemblando direttamente cellule viventi e idrogel, questa tecnologia consente la generazione di modelli di linfonodi 3D basati su idrogel fisiologicamente rilevanti.

Qui, è stato stabilito un modello biostampato in 3D di MCL sotto forma di fette tumorali di idrogel, insieme a un metodo di coltura ottimizzato. Le cellule sono incorporate in fette di collagene di tipo I, alginato e idrogel a base di Matrigel mediante incorporazione reversibile a forma libera di idrogel sospesi (FRESH)bioprinting 20. Le fette tumorali di idrogel vengono coltivate su un supporto filtrante, che consente alle cellule MCL di crescere in un ambiente che ricapitola fedelmente le condizioni in vivo del linfonodo.

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della generazione, della coltura e dell'analisi delle cellule MCL in fette tumorali di idrogel. Utilizzando l'imaging a fluorescenza 3D in tempo reale a quattro colori, è possibile monitorare la vitalità o la risposta al farmaco delle singole cellule all'interno della fetta tumorale in idrogel. Le cellule MCL primarie hanno dimostrato una migliore sopravvivenza quando coltivate nelle fette tumorali di idrogel. Questo modello fornisce uno strumento per studiare la biologia dell'MCL e la risposta al trattamento, aprendo la strada alla comprensione delle influenze microambientali e della variabilità dei pazienti con MCL.

Protocollo

Il lavoro con le cellule MCL primarie deve essere approvato dal comitato etico locale. In questo studio, il comitato etico della Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard-Karls e dell'Ospedale Universitario di Tubinga ha approvato la raccolta e l'esame dei campioni dei pazienti e dei donatori sani (numero di progetto 159/2011BO2) e il consenso informato scritto dei pazienti è stato ottenuto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Le cellule MCL primarie utilizzate qui sono state isolate da interi linfonodi di pazienti MCL e quindi includevano non solo cellule MCL, ma anche altre cellule come cellule immunitarie e fibroblasti.

1. Preparazione dell'impasto gelatinoso per il bagno di supporto

NOTA: L'impasto di gelatina fungerà da bagno di supporto durante il processo di bioprinting 3D. Induce la reticolazione del bioink, consentendo la formazione di una struttura 3D. La preparazione dell'impasto gelatinoso deve essere effettuata in condizioni sterili all'interno di una cappa di coltura cellulare.

  1. Preparare una soluzione di gelatina al 4,5% (p/v) in 10 mM di HEPES e 11 mM di CaCl2 sciogliendo 6,75 g di gelatina in polvere in 1,5 mL di 1 M HEPES, 15 mL di 110 mM di CaCl2 e 133,5 mL di H2O sterile in un barattolo di vetro sterile con coperchio. Assicurati che il barattolo di vetro sia adatto per la miscelazione in un mixer ad alte prestazioni.
  2. Incubare la soluzione a 37°C per 4 ore o fino a quando non si osservano strisci durante l'agitazione della soluzione, indicando che la gelatina è completamente disciolta. Raffreddare la gelatina a 4°C per una notte o per almeno 12 ore.
  3. Preparare un tampone di lavaggio sterile composto da 10 mM di HEPES e 14,4 mM di CaCl2. Preraffreddare il tampone di lavaggio a 4°C.
  4. Rompere la gelatina solidificata al 4,5% in più pezzi usando un cucchiaio sterile.
  5. Riempi completamente il barattolo di vetro contenente il 4,5% di gelatina con il tampone di lavaggio pre-raffreddato, assicurandoti che il tampone rimanga freddo durante tutto il processo di preparazione dell'impasto di gelatina.
  6. Congelare il barattolo di vetro contenente gelatina a -20°C per 45-60 minuti, fino a quando la sospensione di gelatina raggiunge 0°C, ma non ha ancora iniziato a formare cristalli di ghiaccio. Utilizzare un termometro per monitorare la temperatura.
  7. Fissare il coperchio e la lama del mixer al barattolo di vetro, quindi montare il barattolo di vetro sul mixer. Frullare la sospensione di gelatina per 120 s utilizzando l'impostazione a impulsi.
    NOTA: Potrebbe essere necessario regolare le impostazioni del frullatore quando si utilizza un tipo diverso di frullatore.
  8. Trasferire la sospensione miscelata in provette da 50 ml preraffreddate. Centrifugare a 3.800 x g per 2 min a 4°C. Assicurarsi che la sospensione sia separata in un impasto di gelatina solida nella parte inferiore e nel tampone di lavaggio liquido nella parte superiore.
  9. Eseguire il seguente passaggio sul ghiaccio: Lavare l'impasto di gelatina. Aspirare lo strato superiore di liquido, cercando di rimuovere le bolle visibili sulla parte superiore del tampone di lavaggio. Aggiungere 20 ml di tampone di lavaggio fresco a 4°C nella provetta. Agitare il tubo per mescolare l'impasto di gelatina con il tampone di lavaggio.
  10. Ripetere il processo di centrifugazione e lavaggio almeno 3 volte o fino a quando non sono visibili bolle nella parte superiore del tampone di lavaggio. Dopo il lavaggio finale, rimuovere eventuali residui di liquido di lavaggio mediante aspirazione. L'impasto di gelatina può essere conservato a 4°C per diverse settimane.

2. Preparazione del bioink carico di cellule

  1. Preparare una soluzione sterile di alginato al 5% 1-2 giorni prima della stampa. Aggiungere 1 g di alginato a 20 ml di PBS sterile in una provetta da 50 ml. Per evitare residui secchi di polvere di alginato, aggiungere il PBS a piccoli incrementi, vorticando tra le aggiunte. Incubare la soluzione in un bagnomaria a 37 °C per diverse ore o per una notte su un rullo provetta a temperatura ambiente. Una volta che l'alginato è completamente sciolto, conservare la soluzione a 4 °C fino al momento del bisogno.
  2. Se si lavora con una linea cellulare MCL, coltivare le cellule in sospensione in un matraccio T75. Il giorno della stampa, assicurarsi che siano disponibili 1,4 x 107 cellule per la preparazione di 1 ml di bioink, che produrrà 9-10 fette tumorali di idrogel.
  3. Se si lavora con cellule MCL primarie, le cellule non devono essere coltivate in coltura in sospensione prima del bioprinting. Scongelare le cellule MCL primarie crioconservate direttamente prima del bioprinting. Trasferire le cellule MCL primarie in una provetta da 50 mL con terreno di coltura. Per rimuovere il mezzo di congelamento rimanente, centrifugare immediatamente la provetta a 340 x g per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di terreno fresco per il conteggio delle cellule.
  4. Il giorno della stampa, preparare il bioink adatto alle cellule di interesse. Per le cellule Jeko-1, preparare un bioink composto da alginato allo 0,5% (p/v), collagene di tipo I al 20% (v/v), 1x RPMI e 2 mM HEPES. Miscelare 100 μL di alginato al 5%, 200 μL di collagene di tipo I, 100 μL di 10x RPMI, 200 μL di 10 mM HEPES e 350 μL di PBS per 1 mL di bioink. Le celle verranno aggiunte nel passaggio 2.6.
  5. Per le cellule MCL primarie, preparare un bioink composto da alginato allo 0,5% (p/v), collagene di tipo I al 20% (v/v), 1x RPMI e 0,5 mM HEPES. Miscelare 100 μL di alginato al 5%, 200 μL di collagene di tipo I, 100 μL di 10x RPMI, 50 μL di 10 mM HEPES e 500 μL di matrice della membrana basale per 1 mL di bioink. Le celle verranno aggiunte nel passaggio 2.6. Se si lavora con una linea cellulare MCL, trasferire la sospensione cellulare dal pallone di coltura a una provetta da 50 mL.
  6. Mescolare le celle con lo 0,4% di blu di tripano in un rapporto 1:1. Contare le cellule vitali (non colorate) utilizzando un contacellule o una camera Neubauer. Calcolare il volume della sospensione cellulare per 1 mL di bioink, che equivale a 1,4x107 cellule. Trasferire il volume calcolato in una nuova provetta da 50 mL. Centrifugare a 340 x g per 5 min, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet di cellule nel bioink preparato per generare il bioink finale carico di cellule.
    NOTA: È stato stimato che il pellet di cella ha un volume di terreno di 50 μl. Insieme al bioink preparato al punto 2.4, si otterrà 1 mL di bioink.

3. Bioprinting in bagno

NOTA: Se possibile, eseguire il processo di stampa 3D in un ambiente sterile, ad esempio sotto una cappa per colture cellulari. La stampante 3D utilizzata è stata modificata per la stampa FRESH aggiungendo un estensore della pompa a siringa, come descritto in Hinton et al.20.

  1. Accendi la biostampante e collegala al software della stampante 3D. Aprire il file .stl contenente il progetto per le fette tumorali di idrogel. È possibile stampare fino a 5 sezioni contemporaneamente. Assicurarsi che ogni fetta di tumore in idrogel abbia un diametro di 8 mm e un'altezza di 1,5 mm. Impostate la densità di riempimento su 85%. Home la testina di stampa.
    NOTA: Il file STL è stato progettato con Fusion 360 e si trova nel file di codifica supplementare 1. Per la stampa 3D è stato utilizzato il software Cura versione 15.04.5.
  2. Trasferire l'impasto di gelatina precedentemente preparato in una capsula Petri di 35 mm di diametro fino a riempirla a metà. Assicurarsi che non rimangano vuoti d'aria nell'impasto di gelatina. Estrarre l'acqua in eccesso dall'impasto utilizzando salviette di precisione usa e getta per generare un bagno di supporto in gelatina, che è pastoso e mantiene la forma fino a quando non viene applicata una forza sufficiente.
  3. Trasferire il bioink carico di cellule in una siringa di vetro da 2,5 ml e collegarlo a un ugello smussato da 0,8 mm. Capovolgere la siringa ed espellere con cautela l'aria in eccesso e le bolle d'aria. Una volta preparata la siringa, inserirla nella biostampante. Utilizzando il software della stampante 3D, estrudere il bioink fino a quando non inizia a essere espulso dall'ugello. Pulisci la goccia di bioink espulsa usando una salvietta di precisione scientifica usa e getta per evitare l'intasamento dell'ugello.
  4. Posizionare il bagno di supporto della gelatina proprio sotto l'ugello della siringa. Abbassare la testina della stampante fino a posizionare l'ugello all'interno della gelatina, 2 mm sopra il fondo del bagno di supporto.
  5. Avvia il processo di stampa tramite il software della stampante 3D.
  6. Una volta completato il processo di stampa, rimuovere l'eventuale impasto di gelatina in eccesso dall'ugello per evitare l'intasamento. Estrarre il bagno di supporto contenente le fette di idrogel tumorale e coprirlo con un coperchio per mantenere la sterilità.
  7. Incubare il bagno di supporto contenente le fette tumorali di idrogel stampate a 37 °C per consentire alla gelatina di sciogliersi. Questo passaggio rilascerà le fette tumorali di idrogel stampate dal bagno di supporto.
  8. Preriscaldare il tampone di lavaggio e il terreno di coltura cellulare a 37 °C. Mentre la gelatina si scioglie, preparare una piastra a 6 pozzetti per lavare le fette tumorali di idrogel. Riempire due pozzetti con 10 mM di HEPES, 14,4 mM di tampone di lavaggio CaCl2 (lo stesso tampone utilizzato per il lavaggio dell'impasto di gelatina) e due pozzetti con terreno di coltura cellulare.
  9. Una volta che la gelatina si è sciolta, utilizzare una spatola sterile per trasferire le fette tumorali di idrogel nel tampone di lavaggio. Lavare le fette per 1 minuto ciascuna, prima nei due pozzetti contenenti il tampone di lavaggio, poi nei due pozzetti contenenti il mezzo. Le fette tumorali di idrogel cariche di cellule sono ora pronte per la coltura.
  10. Conserva il bioink rimanente per ripetere il processo di stampa.

4. Coltura e trattamento della fetta tumorale in idrogel

  1. Per coltivare le fette di idrogel, trasferirle su un supporto filtrante (dimensione dei pori di 0,4 μm) posto all'interno di una piastra a 6 pozzetti. Coltura fino a 5 fette di idrogel su un unico supporto filtrante. Aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura cellulare sotto il supporto del filtro. Aggiungi una goccia di terreno sopra le fette tumorali di idrogel per evitare che si secchino.
  2. Per il trattamento farmacologico delle fette tumorali di idrogel, aggiungere la quantità desiderata di farmaco al terreno di coltura cellulare. Qui, le fette di idrogel tumorale sono state trattate con 0,33 μM-27 μM di Doxorubicina per 48 ore o 72 ore. Coltura sempre di un set di fette senza trattamento come controllo.
  3. Posizionare la piastra a 6 pozzetti con le fette tumorali di idrogel in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO2 per il periodo di coltivazione desiderato.

5. Analisi di vitalità di cellule mediante saggio di esclusione del blu di tripano

  1. Per valutare la vitalità cellulare dopo la coltura o il trattamento, sciogliere le fette tumorali di idrogel. Trasferire una fetta di tumore in idrogel in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 500 μl per fetta di un tampone di dissoluzione contenente 30 mM di EDTA, 55 mM di citrato di sodio e 150 mM di cloruro di sodio (pH 6,8). Pipettare su e giù fino a quando l'idrogel non si è completamente sciolto.
  2. Centrifugare la soluzione a 340 x g per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 μl di terreno per fetta di idrogel disciolto.
  3. Miscelare la sospensione cellulare in un rapporto 1:1 con lo 0,4% di blu di tripano. Contare le cellule vitali (non colorate) e quelle morte (colorate) con un contacellule o una camera di Neubauer. Registra il numero di cellule vive e morte per ulteriori analisi.

6. Imaging a fluorescenza 3D dal vivo in quadricromia

NOTA: La colorazione a quattro colori qui utilizzata consente la differenziazione tra cellule viventi (TMRM-positive), cellule apoptotiche (Fluorogenic Caspase-3 substrate-positive) e cellule morte (PicoGreen-positive)21,22,23. I nuclei vengono rilevati con DRAQ5. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato a qualsiasi altro colorante a fluorescenza specifico fotostabile per rilevare i biomarcatori, le strutture cellulari o i tipi di cellule di scelta. Prima di colorare, assicurarsi che il microscopio sia in grado di rilevare le lunghezze d'onda dei fluorofori utilizzati per la colorazione.

  1. Per una colorazione in quadricromia di una fetta tumorale di idrogel, preparare una soluzione colorante aggiungendo TMRM, DRAQ5 e substrato fluorogenico della Caspasi-3 a 1 mL di terreno di coltura cellulare a una concentrazione finale di 0,5 μM, 5 μM e 2 μM, rispettivamente.
  2. Utilizzando una spatola sterile, trasferire una fetta di tumore in idrogel su un vetrino coprioggetti a camera. Aggiungere la soluzione colorante preparata sopra la fetta di idrogel fino a coprirla completamente. Incubare il campione per 20 minuti a 37 °C al buio.
  3. Dopo l'incubazione iniziale, raccogliere la soluzione colorante che copre la fetta tumorale in idrogel e aggiungere 0,7 μL/mL di PicoGreen. Pipettare nuovamente la soluzione colorante sulla fetta di idrogel e incubare per altri 10 minuti a 37 °C al buio.
  4. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il terreno in eccesso lasciando una quantità sufficiente di soluzione colorante per mantenere umida la fetta di idrogel.
  5. Analizza immediatamente la fetta utilizzando un microscopio confocale. Per prevenire la fototossicità e il fotosbiancamento, ridurre al minimo la dose di fotoni applicata riducendo l'intensità del laser e il tempo di eccitazione. Gli spettri di eccitazione/emissione dei coloranti sopra descritti sono riportati nella Tabella 1.
  6. Per ottenere una panoramica della distribuzione cellulare della cellula nell'idrogel, catturare le sezioni z. Se durante l'imaging sono state eseguite sezioni Z, generare ricostruzioni 3D delle fette tumorali in idrogel utilizzando il software appropriato. Queste ricostruzioni consentiranno un'analisi approfondita della distribuzione spaziale e dello stato cellulare delle cellule nelle fette tumorali di idrogel.
  7. Seguire le istruzioni e lo script forniti nel File supplementare 1 e nel File supplementare 2 per eseguire la segmentazione e la ricostruzione cellulare.

Risultati

Le fette tumorali di idrogel contenenti cellule MCL sono state generate con il protocollo sopra descritto. Le fasi del flusso di lavoro per la stampa 3D e la coltura delle fette tumorali di idrogel sono mostrate nella Figura 1A. La stampante 3D utilizzata è stata modificata per la stampa FRESH con l'aggiunta di un estensore della pompa a siringa, come descritto in Hinton et al.20 (Figura 1B). Sono state stampate fino a cinque fette contemporaneamente (Figura 1C) e coltivate su un supporto filtrante (Figura 1D). Il terreno è stato aggiunto sotto il supporto del filtro per fornire un apporto di nutrienti alle fette tumorali di idrogel. Una goccia di terreno è stata aggiunta sopra ogni fetta tumorale di idrogel per evitare che si secchiassero. Una panoramica di cinque fette tumorali di idrogel coltivate su un supporto filtrante è mostrata nella Figura 1E, insieme a immagini ravvicinate di una fetta di idrogel. Durante un periodo di coltura di 3 giorni, le fette tumorali di idrogel sono rimaste stabili e hanno mantenuto la loro struttura (Figura 2A). Subito dopo la stampa, le bolle d'aria erano presenti nelle fette tumorali di idrogel, ma sono scomparse durante la coltivazione (Figura 2A).

La vitalità della linea cellulare MCL Jeko-1 coltivata in fette tumorali di idrogel (3D) rispetto alle cellule Jeko-1 coltivate in coltura in sospensione (2D) è stata valutata mediante saggio di esclusione del blu di tripano (Figura 2B). Dopo 3 giorni di coltura, l'80% delle cellule era vitale, rispetto a una vitalità iniziale dell'88% delle cellule Jeko-1 prima della stampa. Le cellule Jeko-1 coltivate in 2D hanno mantenuto la vitalità iniziale dell'88%. Non c'era alcuna differenza significativa tra le cellule Jeko-1 coltivate in 2D e 3D. Per valutare se le cellule di Jeko-1 proliferano nelle fette di idrogel, è stato determinato il numero medio di cellule di Jeko-1 per fetta di idrogel (Figura 2C). Mentre 5x105 cellule Jeko-1 erano contenute in ogni fetta subito dopo la stampa (d0), questo numero è quasi raddoppiato a 9,3x105 cellule dopo 3 giorni di coltura.

La distribuzione e lo stato delle cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel sono stati valutati mediante imaging a fluorescenza live a quattro colori (Figura 2D) direttamente dopo la stampa o dopo 3 giorni di coltura. Dopo la stampa, le ricostruzioni 3D delle fette di idrogel Jeko-1 hanno mostrato una distribuzione omogenea delle cellule. La maggior parte delle cellule era positiva per TMRM, un marcatore per il potenziale di membrana mitocondriale22. Una minoranza di cellule era positiva per l'attività della caspasi-3, un marcatore per l'induzione dell'apoptosi23, così come per il marcatore di cellule morte PicoGreen21. Dopo 3 giorni di coltura, è stato osservato un aumento del numero di cellule insieme alla formazione di cluster cellulari. La maggior parte delle cellule è rimasta positiva al TMRM, mentre solo poche cellule sono risultate positive per l'attività della caspasi-3 o del PicoGreen (Figura 2C).

Per analizzare se le cellule MCL in fette di idrogel rispondono ai chemioterapici, le cellule Jeko-1 coltivate in coltura in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) sono state trattate con il farmaco chemioterapico Doxorubicina, che fa parte del trattamento standard per i pazienti con MCL24. La struttura complessiva delle fette di idrogel è stata mantenuta durante il trattamento con doxorubicina (Figura 3A). La vitalità delle cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel è diminuita in modo dose-dipendente in risposta al trattamento con doxorubicina. L'IC50 della doxorubicina nelle cellule Jeko-1 è aumentato quando le cellule sono state coltivate in fette di idrogel (IC50=5,8 μM) rispetto alle cellule Jeko-1 coltivate in coltura in sospensione 2D (IC50=2,0μM; Figura 3B). L'imaging a fluorescenza dal vivo a quattro colori ha mostrato una riduzione del TMRM e un aumento del segnale PicoGreen nelle cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel in risposta al trattamento con doxorubicina, confermando una riduzione della vitalità indotta dal trattamento. Le immagini ottenute dall'imaging a fluorescenza dal vivo a quattro colori sono state ricostruite in 3D, segmentate in base al segnale dei nuclei DRAQ5 e analizzate utilizzando lo script Python descritto nel file supplementare 1. Una maschera di segmentazione esemplare è mostrata nella Figura 1 supplementare. Il numero di cellule identificato dal segnale DRAQ5 è stato utilizzato per determinare il numero totale di cellule. Il numero di cellule positive per l'attività di TMRM, PicoGreen e Caspasi-3 è stato utilizzato per identificare la percentuale di cellule vitali, morte o apoptotiche, rispettivamente. Le quantificazioni della colorazione a fluorescenza viva a quattro colori di cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel per 3 giorni con o senza 9 μM di doxorubicina hanno mostrato una vitalità paragonabile al saggio di esclusione del blu di tripano (Tabella 2).

Oltre alle linee cellulari MCL consolidate, le cellule MCL primarie di tre diversi pazienti con MCL sono state coltivate in coltura in sospensione 2D o in fette di idrogel 3D (Figura 4, Figura 2 supplementare). Come verificato da un patologo, tutti e tre gli MCL (pazienti 1-3) erano di morfologia classica/comune con indici Ki67 del 20%-50%. Le cellule MCL primarie includevano tutti i tipi di cellule isolate dai linfonodi dei pazienti con MCL e quindi contenevano non solo cellule MCL ma anche altri tipi di cellule immunitarie o cellule stromali. La vitalità delle fette primarie di idrogel MCL è stata valutata mediante il test di esclusione del blu di tripano. Dopo 4 giorni di coltura, le cellule MCL primarie in fette di idrogel hanno mantenuto una vitalità del 43,6% (45,7% il giorno 3) rispetto a una vitalità basale del 71,0% prima della stampa (Figura 4A). Ciò rappresenta una maggiore vitalità rispetto alle cellule coltivate in sospensione (2D), che avevano una sopravvivenza del 19,6% dopo quattro giorni di coltura (28,4% il giorno 3). Questa vitalità è stata visualizzata mediante imaging a fluorescenza dal vivo a quattro colori, in cui la maggior parte delle cellule erano TMRM-positive e vitali, mentre una sottopopolazione era positiva per l'attività della Caspasi-3 e di PicoGreen, indicando rispettivamente apoptosi e morte cellulare (Figura 4B). I dati di quantificazione della Figura 4B sono mostrati nella Tabella 2. Le cellule primarie di altri due pazienti con MCL hanno mostrato una maggiore sopravvivenza delle cellule quando coltivate nelle fette di idrogel (3D) rispetto alla rispettiva coltura in sospensione 2D (Figura 1 supplementare).

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Figura 1: Flusso di lavoro della stampa 3D di fette tumorali di idrogel . (A) Flusso di lavoro della stampa 3D e della coltura di cellule in fette tumorali di idrogel. (B) Configurazione della stampante utilizzata per la biostampa 3D di fette di idrogel in un bagno di supporto in gelatina. (C) Stampa di un progetto nel software della stampante 3D. Sono state stampate fino a cinque fette di idrogel contemporaneamente. (D) Rappresentazione schematica della coltura di fette di idrogel. Le fette di idrogel sono state coltivate su un supporto filtrante in una piastra a 6 pozzetti. Una goccia di terreno è stata aggiunta sopra ogni fetta di idrogel per mantenerne l'umidità. È possibile coltivare fino a cinque fette di idrogel su un supporto filtrante. (E) Fette di idrogel stampate in 3D coltivate su un supporto filtrante, come mostrato da un'immagine panoramica o da immagini ravvicinate. Le barre della scala rappresentano 5 mm, 1 mm o 200 μm come indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Coltura di una linea cellulare di linfoma mantellare (MCL) in fette di idrogel stampate in 3D. (A) Primo piano di una fetta di idrogel rappresentativa contenente la linea cellulare MCL Jeko-1 dopo la stampa (d0) o dopo 3 giorni di coltura (d3). La barra della scala rappresenta 1 mm. (B) Vitalità delle cellule Jeko-1 coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) per 2 giorni, come valutato mediante saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la media ± SD di tre esperimenti di bioprinting indipendenti. (C) Numero di cellule Jeko-1 contenuto in ogni fetta di idrogel subito dopo la stampa (d0) o dopo un massimo di 3 giorni di coltura (d1-d3). Viene mostrata la media ± SD di tre esperimenti di bioprinting indipendenti. Non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa (n.s., p > 0.05, test di Mann-Whitney). (D) Ricostruzione tridimensionale di fette di idrogel Jeko-1 il giorno della stampa (d0) o dopo 3 giorni di coltura (d3). Il modello è stato generato da z-stack di un'imaging a fluorescenza 3D in tempo reale a quattro colori. Le cellule viventi sono mostrate in rosso (TMRM), le cellule apoptotiche in giallo (attività enzimatica della caspasi-3), le cellule morte in verde (PicoGreen) e i nuclei in blu (DRAQ5). La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Trattamento farmacologico di una linea cellulare di linfoma mantellare (MCL) in fette di idrogel. (A) Primo piano di una fetta di idrogel rappresentativa contenente la linea cellulare MCL Jeko-1 trattata con 3 μM di Doxorubicina per 3 giorni (d3). La barra della scala rappresenta 1 mm. (B) Le cellule Jeko-1 coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) sono state trattate con concentrazioni crescenti dell'agente chemioterapico Doxorubicina per 2 giorni. La vitalità delle cellule è stata valutata mediante il saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la SD media ± di quattro esperimenti di bioprinting indipendenti. (C) Ricostruzione tridimensionale di fette di idrogel Jeko-1 trattate con 9 μM di Doxorubicina (Doxo) per 3 giorni (d3). Il modello è stato generato da z-stack di un'imaging a fluorescenza 3D in tempo reale a quattro colori. Le cellule viventi sono mostrate in rosso (TMRM), le cellule apoptotiche in giallo (attività enzimatica della caspasi-3), le cellule morte in verde (PicoGreen) e i nuclei in blu (DRAQ5). La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Coltura di cellule MCL primarie in fette di idrogel stampate in 3D. (A) Vitalità di cellule MCL primarie coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) per un massimo di 4 giorni, come valutato mediante saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la fattibilità media di un esperimento. (B) Ricostruzione tridimensionale di cellule MCL primarie coltivate in fette di idrogel (3D) per 3 giorni. Gli Z-stack sono stati generati da fette di idrogel colorate con una colorazione live a quattro colori e analizzate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (CLSM). Le cellule viventi sono mostrate in rosso (TMRM), le cellule apoptotiche in giallo (attività enzimatica della caspasi-3), le cellule morte in verde (PicoGreen) e i nuclei in blu (DRAQ5). La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

MacchiaTMRMDRAQ5Substrato NucView405 Caspasi-3PicoGreen
Eccitazione/Emissione548 nm/574 nm647 nm/681 nm429 nm/ 469 nm488 nm/ 520 nm

Tabella 1: Massimi di eccitazione/emissione dei coloranti utilizzati per l'imaging a fluorescenza 3D in quadricromia.

Campione% di celle
TMRM (Cellule vitali)PicoGreen (Cellule morte)Caspasi-3 (Cellule apoptotiche)
Jeko-1 Ctrl8323.618.3
Jeko-1 Doxo 9 μM27.681.386.6
Paziente MCL primario 175.231.133.1

Tabella 2: Quantificazione di ricostruzioni 3D di colorazione dal vivo in quadricromia di fette tumorali di idrogel coltivate. Le fette tumorali di idrogel sono state coltivate per 3 giorni e contenevano cellule Jeko-1 coltivate con o senza trattamento con 9 μM di doxorubicina o cellule MCL primarie (paziente 1).

Figura 1 supplementare: Identificazione cellulare da ricostruzioni 3D di colorazione live in quadricromia. Ricostruzioni 3D di immagini confocali marcate con DRAQ5 ottenute da (A) colorazione live a quattro colori e (B) un'immagine segmentata su questo canale generata utilizzando la pipeline di analisi delle immagini Python. La barra della scala rappresenta 200 μm. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figure 2 supplementare: Coltura di cellule MCL primarie dei pazienti 2 e 3 in fette tumorali di idrogel . Vitalità delle cellule MCL primarie del paziente (A) 2 o (B) del paziente 3 coltivate in sospensione (2D) o in fette di idrogel (3D) per un massimo di 4 giorni, come valutato mediante saggio di esclusione del blu di tripano. Viene mostrata la fattibilità media di un esperimento. Clicca qui per scaricare questa figura.

File supplementare 1: Istruzioni per l'analisi delle ricostruzioni 3D ottenute dalla colorazione in quadricromia. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Script Python per l'analisi di ricostruzioni 3D ottenute dalla colorazione in quadricromia. Clicca qui per scaricare questo file.

Supplementary Coding File 1: file Stl. contenente il progetto per le fette tumorali di idrogel. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Le fette tumorali di idrogel descritte in questo protocollo offrono un modello di MCL che imita la struttura linfonodale, consentendo lo studio della sopravvivenza delle cellule MCL e della risposta ai farmaci in un microambiente tumorale 3D generato dal bioprinting.

I metodi di bioprinting più utilizzati si basano sull'estrusione, in cui il bioink viene espulso attraverso un sistema di erogazione. Nella stampa a getto d'inchiostro, ad esempio, i bioink vengono rapidamente reticolati dopo la deposizione per formare strutture3D 25. Tuttavia, questo approccio presenta dei limiti, in particolare in termini di viscosità dei materiali utilizzati e capacità di impilare strati. Al contrario, il bioprinting 3D con estrusione basata su siringa incorporata, come il bioprinting FRESH utilizzato in questo protocollo, applica un approccio gel-in-gel. Ciò consente la stampa di bioink a bassa viscosità, come il collagene, in costrutti stabili, rendendo possibile l'imitazione del complesso microambiente tumorale20,26. Mentre le stampanti 3D sviluppate specificamente per il bioprinting possono essere costose, il metodo qui presentato offre un punto di ingresso più accessibile. Può essere adattato alle stampanti di estrusione standard con modifiche relativamente semplici. Queste modifiche possono essere stampate in 3D con filamenti economici e i progetti sono disponibili come risorse open source, ad esempio, da Hinton et al.20. Tuttavia, è importante notare che la preparazione del bagno di supporto in idrogel per il bioprinting FRESH è altamente sensibile alla temperatura e richiede un'attenzione particolare durante la preparazione dell'impasto.

Spesso, i modelli tumorali stampati in 3D vengono coltivati in sistemi galleggianti, privi del gradiente di ossigeno 25 in vivo, o in colture di chip microfluidici27, che catturano un alto grado di complessità ma hanno una bassa produttività e richiedono un'elevata manutenzione. Questi ostacoli possono essere superati con le fette tumorali di idrogel descritte qui. La configurazione della coltura di un massimo di cinque fette tumorali di idrogel su un'interfaccia aria-liquido deriva dalla coltura di fette tumorali tagliate con precisione di tumori solidi28. La membrana del supporto filtrante utilizzato in questo protocollo è composta da una membrana in politetrafluoroetilene (PFTE) con pori di 0,4 μm, che consente lo scambio di nutrienti ma impedisce l'adesione cellulare o la migrazione cellulare29. La coltura sulla membrana in PTFE fornisce un supporto fisico alle fette per mantenerne la stabilità e impedirne la rottura o la disintegrazione. Inoltre, forniscono un'interfaccia aria-liquido, fornendo ossigeno principalmente dall'aria sopra e nutrienti dal mezzo sotto il filtro30. Il sistema incorpora quindi variazioni spazio-temporali nell'apporto di nutrienti, nella proliferazione cellulare e nell'ossigenazione, come possono verificarsi in vivo25. Coltivate nelle fette tumorali di idrogel su un supporto filtrante, le cellule MCL primarie hanno mantenuto una vitalità di oltre il 40% per 4 giorni, che era superiore alla vitalità osservata nella coltura in sospensione 2D (Figura 3A, Figura supplementare 2). Ulteriori indagini dovrebbero riguardare la possibilità di ottenere una vitalità prolungata mediante l'aggiunta di citochine o la co-coltivazione con fibroblasti che esprimono CD40L, come è stato descritto negli sferoidi e negli organoidi del tumore primario del linfoma a cellule B 6,19,30 o nelle co-colture di cellule MCL primarie con cellule L dei fibroblasti che esprimono CD40L14. L'incorporazione di tali approcci nelle fette tumorali di idrogel dovrebbe essere presa in considerazione per migliorare la coltura di cellule MCL primarie e la somiglianza con il microambiente nativo.

I linfonodi contengono una rete ben sviluppata di fibre della matrice extracellulare. A causa del loro modello, sono conosciute come fibre reticolari. Principalmente, queste fibre sono composte da collagene e componenti specifici della membrana basale 31,32,33. Per generare una matrice simile alla situazione in vivo nei linfonodi, il bioink utilizzato per generare le fette tumorali di idrogel è composto da collagene di tipo I e Matrigel, che consiste nelle quattro principali proteine della MEC della membrana basale laminina, collagene IV, entattina e perlecan34. Inoltre, l'alginato viene aggiunto al bioink per stabilizzare le fette tumorali di idrogel, consentendo una coltura prolungata e il trasporto da un vaso all'altro utilizzando una spatola. Il test di diversi idrogel contenenti collagene e alginato ha mostrato la massima vitalità cellulare in combinazione con una fetta di idrogel stabile e duratura quando si utilizza un bioink con lo 0,5% di alginato e il 20% di collagene (dati non mostrati). Oltre ai componenti, il diametro della fetta tumorale dell'idrogel di 0,8 cm assomiglia ulteriormente al diametro medio dei linfonodi di 1 cm35. L'imaging 3D dal vivo delle fette tumorali di idrogel ha inoltre mostrato una distribuzione uniforme delle cellule (Figura 2C).

Qui, la capacità di trattare le fette di idrogel con farmaci è stata dimostrata dal trattamento con doxorubicina, che fa parte della terapia R-CHOP (rituximab, ciclofosfamide, doxorubicina, vincristina, prednisone), una terapia standard per i sottogruppi di pazienti con MCL più anziani24. Rispetto alle colture 2D, le influenze del microambiente tumorale sugli effetti del trattamento possono essere studiate nelle fette tumorali di idrogel. Come mostrato nella Figura 3, le cellule Jeko-1 coltivate in fette di idrogel erano più resistenti al trattamento con doxorubicina rispetto alle cellule coltivate in 2D. Ciò è in linea con le osservazioni secondo cui la matrice extracellulare può influenzare le risposte ai farmaci e spesso migliorare la resistenza ai farmaci modulando la rigidità tumorale36, la comunicazione cellula-cellula37 e la somministrazione di farmaci38. Inoltre, l'analisi citofluorimetrica, così come la colorazione immunoistochimica o con immunofluorescenza multiplex, possono fornire informazioni più approfondite sulla risposta al trattamento delle singole cellule nelle fette tumorali di idrogel.

In conclusione, questo protocollo descrive la generazione e la coltura di fette tumorali di idrogel, che rappresentano un modello linfonodale 3D che imita la struttura linfonodale tridimensionale nativa. Ha il potenziale per espandere l'applicazione dalle cellule MCL ad altre indicazioni di linfoma primario.

Dichiarazioni

Questo studio è stato sostenuto dalla Robert-Bosch Stiftung e dal Ministero della Scienza, della Ricerca e delle Arti del Baden-Württemberg (3R-Network BW).

Ringraziamenti

Ringraziamo Kerstin Willecke per la sua eccellente assistenza tecnica e Yang Zhang per la sua preziosa assistenza nell'analisi delle immagini 3D.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
µ-slide 8 pozzetti fondo in vetroibidi GmbH80827Vetrini con fondo in vetro utilizzati per l'imaging dal vivo di fette di idrogel
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1Componente Bioink
10X RPMI-1640 medioSigma-AldrichCodice: R1145Componente Bioink
Siringa a tenuta di gas da 2,5 ml modello 1002 TLLHamilton81420Siringa per bioprinting
Stampante 3D per estrusione, PrintrBot SimplePrintrbotAuto-modificato per consentire la stampa di bioink
Piastra a 6 pozzettiTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790Coltura delle fette di idrogel
Sistemi di filtrazione sottovuoto per bottiglie, membrana PES, 500 ml, 0,22 & micro; m dimensione dei pori, 70  mm di diametro membranaCorning Inc.513-3355Filtrazione sterile di tamponi
Cloruro di calcio disidratatoCarl Roth GmbH + Co.KGT885.2Componente del tampone di lavaggio e della sospensione gelatinosa
Collagene I da rattoCorning Inc.CLS354249Componente Bioink
Software Cura versione 15.04.5 per la stampa 3DUltimakerSoftware utilizzato per la stampa 3D
DRAQ5Biostatus SADR50050Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel
Sale disodico diidrato dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma-AldrichE5134Componente del tampone di dissoluzione dell'alginato
Contatore automatico di celle EVENano EnTek Inc.10027-452Contatore di celle
Piastre di Petri batteriologiche Falcon con coperchio, diametro 35 mmFalcone351008Riempito con impasto gelatinoso per formare il bagno di supporto per il bioprinting
Provette Falcon, 50 mLSarstedt AG & Co.KG62.547.254
Siero fetale di vitelloSigma-AldrichS0615Integratore di terreno per colture cellulari
Gelatina dalla pelle suinaSigma-AldrichG1890Componente principale dell'impasto gelatinoso
HEPES, acido libero, grado di biologia molecolareMerck KGaACAS 7365-45-9Componente del tampone di lavaggio e della sospensione gelatinosa
Linea cellulare Jeko-1 MCLATCCCRL-3006Linea cellulare MCL
KIMTECH Science Salviette di precisioneSocietà Kimberly Clark7551Utilizzato per aspirare l'acqua in eccesso dall'impasto di gelatina e per rimuovere le goccioline dall'ugello della stampante 3D
Software LAS X versione 3.5.7.23225LeicaSoftware utilizzato per le ricostruzioni 3D
Leica TCS SP8 Microscopio a scansione laser confocaleLeicaTCS SP8Microscopio confocale per l'imaging dal vivo
Barattolo di vetro Pinta regolare 16 ozSocietà BallG001Barattolo in cui viene preparato l'impasto di gelatina
Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) MatrigelCorning Inc.356231Componente Bioink
Inserto per colture cellulari Millicell, 0,4 µ m Dimensione dei poriMerck KGaAPICMORG 50Supporto filtro per fette di idrogel
Substrato NucView 405 Caspasi-3, 1 mM in 1x PBSBiozio10405Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel
Frullatore Oster Professional SeriesOsterBPST02-B00Frullatore per generare impasto di gelatina
Penicillina/StreptamicinaGibco15140163Integratore per terreno di coltura cellulare MCL
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienInvitrogenP7589Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel
Rotina 35 RHettich24573Centrifugazione delle cellule
Centrifuga ROTINA 38/38RHettichZ720109Centrifugazione di fanghi di gelatina
RPMI-1640+GlutaMAXGibco61870036Base del terreno di coltura per cellule MCL
Alginato di sodioCooperazione FMCGQ9109901Componente Bioink
Cloruro di sodioMerck KGaA1.06404Componente del tampone di dissoluzione dell'alginato
Citrato di sodioCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1Componente del tampone di dissoluzione dell'alginato
Cannule Sterican per applicazione smussata 21G 0,8x22 mmB.Braun9180109Ugello per la stampa 3D
Tetrametilrodamina-metilestere-perclorato (TMRM)Sigma-AldrichT5428Colorante per l'imaging dal vivo di fette di idrogel
Blu di tripano, 0,4%Sigma-AldrichT8154Colorazione per analisi di vitalità
Termometro a tenuta stagnaVWR620-2099Termometro per monitorare la temperatura dell'impasto di gelatina

Riferimenti

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