Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia e delle interazioni con le sinapsi nella retina murina malata

Summary

Questo articolo dimostra un metodo per visualizzare e quantificare la motilità della microglia e il contatto con i punti postsinaptici nella retina utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Abstract

La microglia sono i macrofagi residenti del sistema nervoso centrale (SNC) che rispondono a infezioni tissutali e lesioni. Oltre al loro ruolo nell'infiammazione, la microglia svolge un ruolo nello sviluppo del raffinamento dei circuiti attraverso la potatura sinaptica. Tuttavia, i meccanismi di potatura sinaptica nella neuroinfiammazione e nella neurodegenerazione rimangono sconosciuti. In questo protocollo, utilizziamo un modello di explant retina del topo per studiare la dinamica della microglia ex vivo. Per esaminare la motilità della microglia e le loro interazioni con le proteine postsinaptiche, etichettamo le sinapsi con AAV-PSD95-RFP e registriamo video timelapse di microglia mobile colocalizzata con proteine postsinaptiche utilizzando microscopia confocale a disco rotante. Successivamente realizziamo ricostruzioni superficiali e puntuali della microglia e del PSD95 utilizzando software di analisi delle immagini. Dati come la lunghezza dello spostamento della microglia, la velocità del processo e il contatto con punti postsinaptici possono quindi essere estratti da queste superfici per comprendere il comportamento della microglia sia negli stati omeostatici che dopo un danno neuronale. Questo protocollo può essere utile per esaminare il ruolo della microglia nella potatura sinaptica nelle malattie neurodegenerative retiniche.

Introduction

La funzione dei circuiti e l'omeostasi si basano su un attivamento sinapsiale altamente regolato e altre interazioni uniche tra vari tipi^{cellulari 1}. Fungendo da macrofagi residenti del sistema nervoso centrale (SNC), le microglie sono una popolazione non neuronale nella retina che svolge un ruolo unico nella potatura sinaptica. Durante lo sviluppo del SNC, la microglia pota le sinapsi non funzionali o deboli per raffinare i circuiti^{neurali 2}. La microglia nel cervello in via di sviluppo esamina il loro ambiente e viene preparata a un ruolo neuroprotettivo durante i periodi^{critici 3}. Nello sviluppo del sistema visivo, la microglia è un regolatore chiave nello sviluppo dei neuroni corticali e degli interneuroni, oltre a mostrare cambiamenti morfologici durante i periodi critici di rimodellamento^{sinaptico 4}. Analogamente, nella retina in via di sviluppo, la microglia libera le cellule apoptotiche per far spazio a nuove connessioni sinaptiche, confermate dalla regolazione all'alza del marcatore omeostatico P2Ry12 durante questi eventi^{di pulizia 5}. Tuttavia, recenti scoperte evidenziano che la microglia potrebbe non svolgere un ruolo definitivo nel perfezionamento dei circuiti neurali nel sistema visivo^{in via di sviluppo,} sottolineando che esiste controversia riguardo al ruolo della microglia nello sviluppo dei circuiti visivi.

Nei contesti di lesioni, la microglia cambia morfologia in uno stato attivo e può svolgere un ruolo neurodegenerativo. Ad esempio, la microglia nei modelli per la malattia di Alzheimer ha mostrato un aumento dell'inghiottimento delle placche amiloide-beta⁷ e dei marcatori sinaptici come SPH e PSD95⁸. Nella neurodegenerazione retinica, molti gruppi di ricerca hanno trovato microglia con materiale sinaptico avvolto, ma nessuna evidenza chiara di un inghiottimento attivo di sinapsi^intatte 9,10,11,12,13. Ad esempio, He et al. hanno scoperto che la microglia aumenta il numero e aumenta il volume di materiale sinaptico avvolto in un modello di retinite^{pigmentosa 9}, ma non è chiaro se ci sia stata fagocitosi delle sinapsi intatte o se la rimozione dei detriti. Inoltre, le tradizionali classificazioni microgliali — come "riposo vs. attivato" o "M1 vs. M2" — sono semplificate e sempre più imprecise secondo le intuizioni moderne. La microglia esiste in un gradiente di stati, non in categorie^{discrete 12}. Pertanto, Paolicelli et al. hanno chiesto uno spostamento da classificazioni binarie obsolete verso una nomenclatura più sfumata e rigorosamente definita per gli stati microgliali, al fine di comprendere e definire meglio la morfologia e l'attività delle^{microglie 12}. Pertanto, strategie per valutare la funzione microgliale ex vivo e in vivo aumenteranno la capacità del campo di discernere gli stati e l'attività della microglia sia in contesti di sviluppo che di malattia.

Sebbene esistano strategie per studiare la funzione della microglia sia ex vivo che in vivo, l'imaging live ex vivo presenta diversi vantaggi. Innanzitutto, la chiarezza corneale o lo sviluppo della cataratta non ostacoleranno l'imaging retinico, creando una chiara visualizzazione dei processi minimi e dei punti sinaptici. Inoltre, l'imaging in vivo richiede maggiore abilità tecnica per essere allestita, il che rende le preparazioni ex vivo con una capacità di maggiore produttività, portando a più animali fotografiati per esperimento. Nonostante i benefici teorici che l'imaging in vivo può offrire, è necessaria un'elevata potenza laser (100-230 μW) per catturare la motilità del processo microglial per l'imaging^{longitudinale 14,15}. Tuttavia, l'imaging ex vivo della microglia con una potenza laser inferiore e un supporto di imaging adeguato può fornire la stessa qualità di imaging dell'imaging in vivo con la giusta preparazione, anche se il tessuto non è più in situ.

Abbiamo dimostrato che la microglia aumenta in numero, complessità e movimento del processo dopo l'elevazione transitoria della pressione intraoculare (IOP^{) 10}. Nel tessuto fisso, questa microgliosi porta a un aumento della colocalizzazione con le proteine^{sinaptiche 10}. Lavori precedenti hanno inoltre dimostrato la perdita precoce delle sinapsi e la degenerazione dei dendriti delle cellule gangliari retiniche (RGC) nel modello murino di ipertensione oculare indotta da laser (LIOH) e in altri modelli neurodegenerativi 10,16,17,18,19,20. Tuttavia, non è ancora noto se svolgano un ruolo attivo nella potatura delle sinapsi o un ruolo più passivo nella rimozione dei detriti cellulari, comprese le sinapsi smontate. Poiché il disassemblaggio delle sinapsi è un primo segno distintivo della neurodegenerazione, comprendere la dinamica della microglia e il loro ruolo nello smontaggio delle sinapsi è fondamentale ^8,10. Qui, utilizziamo imaging in tempo reale per comprendere la dinamica della microglia e la loro interazione con la proteina di densità postsinaptica eccitatoria (PSD95) sulle dendriti degli RGC.

Protocol

Gli animali venivano ospitati all'Università della California, San Francisco, con cicli di luce di 12 ore di luce e 12 ore di luce e 12 ore di scurezza, ricevute acqua e dieta standard ad libitum, salvo indicazione. Tutte le procedure sono state approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università della California, San Francisco. Consulta la Tabella dei Materiali per i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. Una panoramica della procedura sperimentale, dall'iniezione intravitrea all'imaging e all'analisi, è mostrata nella Figura 1.

1. Produzione ed efficienza del virus AAV-PSD95-TagRFP

1. Costruire AAV-PSD95-tagRFP prendendo la sequenza PSD-95pTagRFP (plasmide Addgene #52671; RRID:Addgene_52671) e inserirlo a valle del promotore CMV in AAV-CMV-GFP dopo aver rimosso il GFP (plasmide Addgene #67634; RRID: Addgene_67634).
2. Preparare il virus usando HEK293T triplicemente trasfettato, purificato con PEG/cloroformio e concentrato fino a un titolo di^10,12 ip/mL (come descritto da Negrini et al.).²¹.
   NOTA: Questo metodo di produzione virale produce tipicamente un titolo inferiore rispetto all'ultracentrifugazione, ma per questi esperimenti è auspicabile avere cellule scarsamente^{infette 21}. La versione capside/sierotipo utilizzata in questi esperimenti era 7m8 (plasmide di Addgene # 64839; RRID: Addgene_64839).
   1. Testare l'efficienza dell'AAV prima di procedere con il protocollo completo di imaging.
      NOTA: I lettori che implementano questo protocollo dovrebbero puntare a un'etichettatura scarna degli RGC, poiché l'obiettivo è identificare e isolare i singoli dendriti RGC.
3. Verifica la trasfezione riuscita e poi fissa la retina con PFA al 2% in 1x ACSF. Per le proteine sinaptiche, controllare il segnale al microscopio confocale a 63x per verificare la risoluzione chiara della marcatura fluorescente.
   NOTA: La concentrazione più leggera della fissazione aiuta a preservare l'etichettatura delle proteine sinaptiche. Se l'AAV utilizzato non è per componenti sinaptiche, i lettori possono scegliere di utilizzare invece il 4% di PFA.

2. Gestione del topo e iniezioni intravitree AAV-PSD95-TagRFP

1. Incrocio maschio e femmina di topi albini CD-1 (ceppo 022) con B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (ceppo 005582) per produrre topi albini CD-1 con microglie che esprimono EGFP. Aspettare almeno quattro generazioni di retroincroci per utilizzare maschi e femmine di topi eterozigoti Cx3cr1 negli esperimenti. Mantenere e rinfrescare la ceppa dopo 10 generazioni sul fondo CD-1 per prevenire la deriva genetica.
2. Anestetizzare gli animali (P30-P60) utilizzando anestesia isoflurano tramite una camera di induzione con anestetico al 3-5% di ossigeno con una portata di 1 L/min di ossigeno. Posizionare l'animale su uno stereomicroscopio, assicurandosi che l'isoflurano venga somministrato continuamente attraverso un cono nasale. Per confermare che l'animale sia anestetizzato, pizzica il dito almeno 3 volte per confermare.
3. Aggiungi una goccia di proparacaina allo 0,5% prima di iniettare l'AAV. Iniettare lentamente 2 μL di AAV-PSD95-RFP intravitrealmente in entrambi gli occhi al limbo superotemporale usando una siringa 26s G 10 μL. Rimuovere lentamente l'ago per evitare il reflusso dell'AAV attraverso il sito di iniezione. Applica una pomata antibiotica sugli occhi dopo l'iniezione.
4. NOTA: L'ago non deve attraversare più della metà della circonferenza della camera vitrea. In questo modo, la retina e il cristallino possono essere danneggiati dalla punta dell'ago, portando a una trasfezione irregolare o addirittura fallita. Lo sviluppo o emorragia della cataratta indica una tecnica di iniezione difettosa.
5. Dopo l'iniezione, verifica che gli animali siano vigili prima di riportarli nelle loro gabbie e stanze di alloggio originali. Se un animale manifesta dolore post-iniezione, somministrare buprenorfina tramite iniezione intraperitoneale. Aspetta 3 settimane per l'espressione dell'AAV. Se viene utilizzato un modello induttibile per aumentare la pressione intraoculare (o per eseguire altre manipolazioni), attendere 3 settimane prima di indurre una pressione intraoculare elevata in un occhio, utilizzando l'occhio controlaterale o gli occhi di un animale ingenuo come controllo.

3. Eutanasia e montaggio retinico a pianaggio

1. Prepara una soluzione fresca 1x di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF, pH 7,4) in 1x PBS contenente i seguenti componenti in mM: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl_{2,6H 2}O, 2,5 CaCl_{2,2H 2}O, 1 NaHPO₄, 11 glucosio e 20 HEPES.
2. Ossigena la soluzione per almeno 15 minuti prima di usarla per la dissezione acuta. Collega il tubo a una bombola d'ossigeno e posiziona un tappo con un foro al centro per evitare che il gas fuori.
3. Eutanasia il topo con almeno 1 mL di anestesia isoflurana in una piccola camera di induzione, seguita da una lussazione cervicale. Segna il lato nasale della cornea con un marcatore prima di enucleare, così da poter tracciare la posizione della retina durante tutto l'esperimento.
   1. Per enucleare gli occhi iniettati con microperle o laser, esegui una peritomia congiuntiva limitata e posiziona le forbici dietro l'occhio per sezionare l'occhio alla base del nervo ottico. Questo permette all'occhio delicato di rimanere intatto.
4. Utilizzando un microscopio a dissezione si può forare un piccolo foro con un ago da 23 G o 25 G nella cornea, permettendo così all'ACSF ossigenato di perfondere l'occhio. Inserisci le forbici in questo foro per fare un taglio fiduciario all'estremità nasale.
5. Taglia il resto della cornea e dell'iride al limbo.
6. Rimuovi l'iride e la lente. Se la retina si attacca al cristallino, separalo usando una pinza.
7. Separare la retina dalla sclera usando le pinze per sezionare delicatamente tra l'EPR e la retina neurale.
8. Posizionare la retina sul lato non grigliato di una carta filtrante a membrana Mixed Cellulose Esters (MCE) per una visualizzazione e una visualizzazione chiara e una ricognizione di imaging.
9. Fai piccoli tagli rilassanti nella retina negli altri tre quadranti, con il taglio più lungo nella retina nasale per tracciare la posizione retinica.
   NOTA: La retina dovrebbe sembrare un quadrifoglio.
10. Trasferisci la retina dalla carta filtro a una salvietta da laboratorio. Usa una goccia di ACSF per inumidificare la retina e poi usa la salvietta per asciugare la carta filtrante. Ripeti per almeno 8-10 gocce per far aderire la retina alla carta filtrante.
11. Inserire la retina in una camera di ossigenazione mentre si disseziona l'occhio controlaterale.
12. Una volta pronta per l'immagine, asciuga la carta filtro come menzionato nel passo 3.10 e inverti la retina su una piastra di Petri Matek. Appesantisci la retina con perline di metallo o un anello. Aggiungi 3-5 gocce di ACSF.
    NOTA: Le piccole perle metalliche, come quelle provenienti da un bagno di perline metalliche o da un anello, hanno dimensioni e peso sufficienti per evitare la deriva senza compromettere l'integrità retinica.
13. Crea un anello prendendo un filo d'acciaio e corde di nylon tese, incollandolo e aggiungendo un peso per ottenere un anello con fili paralleli fissi e tesi.
    1. Avvolgi il filo attorno a un cilindro di mezzo pollice di diametro e tira con una pinza tesa. Taglia ogni anello dal cilindro e appiattiscilo tra una morsa.
    2. Carteggia l'anello su una faccia per avere un lato ruvido e piatto. Allunga le corde di nylon sopra l'apertura di una bottiglia di diametro 1-2 pollici e tene-le in posizione con elastici.
    3. Posiziona l'anello sopra le corde di nylon e incollalo con cura applicato piccole quantità di colla lungo il perimetro interno dell'anello. Successivamente, posiziona un peso leggero sopra l'anello, ad esempio una moneta o un sottile filo metallico, per tenere l'anello in posizione.
    4. Dopo l'asciugatura, taglia i fili in nylon dal bordo esterno dell'anello usando forbici di precisione. Il risultato sono corde parallele fisse che estendono con forza il diametro dell'anello.
    5. Se la densità della corda in nylon all'interno dell'anello è troppo alta, taglia singole corde con forbici a molla a microdissezione per adattarle alle esigenze dell'esperimento.
       NOTA: Il processo di sezionamento e montaggio dovrebbe richiedere solo ~5 minuti. Più velocemente il tessuto viene posizionato in condizioni fisiologiche equilibrate ex vivo, più sano sarà il tessuto.

4. Acquisizione confocale del disco rotante

NOTA: Accendi la camera di umidificazione al 5% di_CO2 e falla funzionare per almeno 1 ora prima dell'immagini. Permettere al sistema e al campione di raggiungere l'equilibrio termico aiuterà a ridurre la deriva.

1. Inizia a scansionare l'oculare a 10x per mettere a fuoco la microglia. Quando si scansiona il tessuto per le aree da immagine, si utilizza il canale microgliale come riferimento e concentrati solo sulle microglie che presentano punti sinaptici luminosi colocalizzati (entro 10-20 μm). Poiché la marcatura dell'AAV non è omogenea in tutto il tessuto, si scansionano le aree che hanno sia microglia che punti colocalizzati nello stesso piano. Una volta individuata un'area che soddisfa questi criteri, passa a 60x per mettere a fuoco e passa alla modalità fotocamera cliccando sul pulsante della fotocamera .
   1. Utilizzando il software del sistema di imaging, clicca con il tasto destro sullo schermo per trovare la navigazione xy. Apparirà una schermata di anteprima che può scansionare il tessuto creando un telaio 3 x 3, 5 x 5, oppure una dimensione personalizzata per selezionare le aree ottimali. Usa la dimensione del fotogramma 3 x 3 o 5 x 5 e lo schermo con un canale di riferimento per evitare il fotodecoloramento continuo.
      NOTA: Per questo protocollo, abbiamo utilizzato il canale microglia.
2. Visualizza rapidamente la retina montata usando un microscopio confocale a disco rotante dotato di un obiettivo 60x (NA 1,49).
3. Per visualizzare l'esempio, clicca con il tasto destro sullo schermo, seleziona Live e clicca sul pulsante di regolazione automatica così il sistema può modificare la visuale in base alle LUT attuali. Per regolare le impostazioni del laser, seleziona prima ogni canale singolarmente e regola potenza ed esposizione laser secondo necessità. Poi, clicca con il tasto destro sul fluoroferano per Assegna le impostazioni al microscopio e salva le impostazioni personalizzate, poiché il software non le salva quando si passa a un altro canale.
   1. Cambia canale successivo e regola secondo necessità. Clicca con il tasto destro sul fluoroforo per salvare le impostazioni. Se acquisisci più canali nello stesso frame, inserisci gli stessi valori usati dopo aver anteprodotto ogni canale singolarmente. Clicca con il tasto destro sul fluoroforo per salvare le impostazioni.
   2. Per l'acquisizione multicanale, seleziona i canali di interesse nella scheda Lambda . Per l'imaging in tempo reale, si combinano tutti i canali in un unico canale per catturare rapidamente il movimento fine dalla cella di interesse, permettendo che ogni canale venga acquisito simultaneamente, anziché separatamente, il che può creare un ritardo nel timelapse a seconda della velocità della cella.
4. Procedi con l'acquisizione di un timelapse per il tempo desiderato.
   1. Nella scheda del tempo in basso a sinistra, inserisci un time lapse di 5-10 minuti con intervalli di 20 secondi.
   2. Nella scheda delle impostazioni acquisizione a destra, imposta la risoluzione dell'immagine a 608 x 832 con una dimensione del pixel di 0,12 μm.
   3. Raccogliere immagini in 10 - 20 μm utilizzando una dimensione di passo di 0,3 μm per garantire una risoluzione accettabile dei processi microgliali fini e dei punti sinaptici lungo l'asse z. Per garantire un tracciamento delle celle efficace, mantenere l'intervallo di tempo tra i fotogrammi a 20 - 30 secondi.
      NOTA: A causa della fragilità del tessuto ex vivo, si raccomanda di visualizzare prima la retina sperimentale e per non più di un'ora. Questo serve a normalizzare la condizione dell'occhio di controllo controlaterale, che dovrebbe trovarsi in una camera ossigenata durante l'imaging della prima retina.
5. Usa questo protocollo per visualizzare gli strati più superficiali della retina. Acquisendo time laps superiori a 20 μm, diventa più difficile catturare il movimento fine del processo durante gli intervalli di 20 secondi. Pertanto, solo microglia delle immagini che rientrano nello stack a 20 μm.

5. Tracciamento, analisi ed esportazione dei dati

1. Rendering superficiale per la microglia
   1. Converti il file timelapse in formato IMS usando il software di convertimento file. Inserisci le seguenti dimensioni dei voxel in base alle proprietà dell'immagine acquisite dal passo 4.2: x = 0,1272423 micron, y = 0,1272423 micron, z = 0,3 micron.
   2. Una volta lanciato, il software di analisi inizierà in Arena. Clicca sulla cartella Osserva per aprire il file precedentemente convertito. Assicurati che l'immagine sia in visuale 3D.
   3. Per rilevare intere microglie individuali, clicca sull'icona della superficie blu nella Barra degli Oggetti . Seleziona le ultime tre opzioni nelle impostazioni algoritmi : Traccia Superfici (nel tempo), Classifica Superfici e Statistica Oggetto-Oggetto. Clicca sul pulsante blu play per passare al passo successivo.
      1. Nel caso di più microglie, selezionare Segmento solo una Regione di Interesse (ROI) per garantire che singole microglie esistano all'interno di un oggetto di superficie. Imposta i parametri x, y e z di conseguenza per creare una superficie solo delle singole microglie di interesse.
   4. Seleziona il canale per cui verrà creata una rendering della superficie. Se desiderato, seleziona Liscio per lisciare la creazione della superficie e usa un rapporto 1:1 - 1,25 rispetto alla dimensione voxel dell'immagine. Ad esempio, se l'immagine ha una dimensione voxel 0,12 x 0,12 x 0,3 μm, imposta il dettaglio superficiale su 0,15 - 0,16 μm. Sotto soglia seleziona Segmentazione di Machine Learning per addestrare il software a rilevare le celle di interesse.
      NOTA: Questo prossimo passo consiste nel fornire dati di addestramento a Imaris AI tramite Segmentazione tramite Machine Learning.
   5. Sotto Dati di Addestramento, osserva i due strumenti a pennello: Sfondo (per rilevare lo sfondo) e Primo piano (per rilevare il vero segnale del campione). Disegna le pennellate selezionando il pennello desiderato e usando Shift + Click sinistro . Assicurati che Interpolare Display sia selezionato sotto Impostazioni. Seleziona Traina e Predice per inserire i dati di addestramento dai pennelli realizzati.
      NOTA: Somministrare più di sei colpi comporta un tempo di elaborazione più lungo per l'IA e una cattura imprecisa della cellula.
      1. Usa il puntatore giallo al centro per muoverti attraverso la pila z. Disegna più pennellate attraverso i piani x, y e z, così come in alcuni (non tutti) intervalli temporali del timelapse. Fai 3-5 pennellate brevi per ogni voce, perché l'IA impara meglio con piccoli pezzi di informazione alla volta. Regola questo passaggio iterativamente ad ogni voce finché non viene creata una superficie precisa della cella.
      2. Seleziona il rettangolo giallo per alternare tra il display di allenamento e la superficie reale creata come controllo finale. Controlla anche durante il timelapse che la superficie rappresenti accuratamente la cella.
   6. Una volta raggiunta la renderizzazione accurata della superficie, si passa al passo successivo. Deseleziona gli oggetti divisi.
   7. Regola il numero di voxel nell'istogramma. Sposta la soglia in modo da rimuovere piccoli oggetti non collegati alla superficie principale.
      NOTA: Questo passaggio serve a rimuovere eventuali piccole superfici indesiderate create a causa del rumore di fondo. L'obiettivo è rimuovere eventuali superfici non collegate al corpo cellulare principale di interesse.
   8. Successivamente, modifica la superficie secondo necessità. Elimina manualmente qualsiasi oggetto che non faccia parte della superficie principale o taglia i bordi usando lo strumento forbice, se necessario.
   9. Se desiderato, stabilire una soglia di spazi permessi che possa comunque essere associata all'oggetto. Seleziona l'algoritmo di tracciamento per la cella in movimento.
      NOTA: Il moto autoregressivo è lo strumento più comunemente utilizzato per il tracciamento delle cellule, poiché traccia il movimento continuo durante tutto il timelapse.
      1. La distanza massima e la dimensione massima del gap sono numeri definiti dall'utente che stabiliscono punti significativi da cui la superficie può deviare. Imposta una distanza massima di 0,96 μm e una dimensione massima di 3 (impostazioni predefinite).
   10. Simile a come gli oggetti di superficie sono stati filtrati nel passo 5.1.7, traccia di filtro non associata alla superficie principale. Questo viene anche regolato tramite un istogramma. Definisci dove impostare la soglia cercando quando le piccole tracce spot che durano non più di cinque intervalli temporali vengono rimosse dalle regolazioni del filtro.
   11. Poi, imposta le classificazioni se lo desideri. Ad esempio, categorizza la lunghezza di spostamento tra 0 - 1 μm e 1+ μm per determinare piccoli movimenti di processo o spostamenti significativamente grandi di processo o cellula.
   12. Infine, applica etichette corrette su determinati eventi utilizzando le classificazioni del passaggio precedente.
       NOTA: Questo passaggio è meglio utilizzato una volta generati i punti per il segnale postsinaptico.
2. Classificazione spot per PSD95
   1. Per rilevare intere microglie individuali, clicca sull'icona della superficie blu nella Barra degli Oggetti . Seleziona le ultime tre opzioni nelle impostazioni algoritmi : Traccia Superfici (nel tempo), Classifica Superfici e Statistica Oggetto-Oggetto. Clicca sul pulsante blu play per passare al passo successivo.
   2. Seleziona il canale sorgente per il marcatore sinaptico. Disattiva lo slicer e qualsiasi altro canale per visualizzare solo PSD95. Usa il pulsante ctrl e lo strumento di selezione del puntatore per stimare il diametro xy del punto.
      1. Scegli alcuni punti luminosi che durano per tutto il timelapse (dimensioni che variano tra 0,6 μm e 1,2 μm).
      2. Disattiva la sottrazione dello sfondo. Se l'immagine richiede la sottrazione dello sfondo, usa lo strumento di sottrazione dello sfondo sotto Elaborazione immagini prima di elaborare il timelapse.
   3. Poi, aggiungi un filtro basato sulla qualità del punto. Trascina l'istogramma in modo che tutti i punti PSD95 vengano catturati accuratamente durante tutto il timelapse.
      NOTA: La qualità si basa sull'intensità del centro dello spot⁹. Questo filtro cattura con maggiore precisione il segnale effettivo del PSD95, rispetto al numero di filtri voxel o al diametro.
   4. Successivamente, rimuovi eventuali macchie generate dal rumore usando il passaggio di modifica. Alterna tra il cursore a cubo o quello a cerchio per rimuovere rispettivamente punti singolari o multipli, che compaiono solo per 1-2 intervalli di tempo a causa del rumore.
   5. Se desiderato, stabilire una soglia di spazi permessi che possa comunque essere associata all'oggetto. Seleziona l'algoritmo di tracciamento appropriato per il marcatore sinaptico.
      1. La distanza massima e la dimensione massima del gap sono numeri definiti dall'utente che stabiliscono punti significativi da cui le macchie possono deviare. Imposta una distanza massima di gap di 14,6 μm e una dimensione massima di gap di 3 (impostazioni predefinite).
   6. Similmente a come gli oggetti spot sono stati filtrati nel passo 5.2.3, traccia di filtro non associata a punti distinti. Questo viene anche regolato tramite un istogramma. Per definire dove impostare la soglia, si verifica quando vengono rimosse le tracce di piccoli oggetti.
   7. Imposta le classificazioni se lo desideri. Ad esempio, distingui tra punti inghiottiti, contattati o non contattati usando la classificazione Distanza Minima alla Superficie. Inserito come qualsiasi punto < 0 μm all'interno della superficie, contattati tra 0 e 0,5 μm dalla superficie, o non contattati come 0,5+ μm dalla superficie.
   8. Infine, applica etichette corrette su determinati eventi utilizzando le classificazioni del passaggio precedente.
3. Una volta che superfici e macchie rappresentano accuratamente la microglia e i punti di interesse, esporta tutte le statistiche da ciascun oggetto nella scheda statistiche . Assicurati che le statistiche dettagliate vengano estrate, che includeranno la lunghezza dello spostamento, la velocità e gli eventi di contatto classificati.
   1. Molte statistiche, come area, volume, lunghezza di spostamento e velocità, provengono da Imaris. Esportare lunghezza e velocità di spostamento superficiale per definire la dinamica della microglia nell'esperimento.
      1. Definisci la lunghezza di spostamento come la distanza tra la posizione iniziale e la posizione finale della superficie, misurata in μm²².
      2. Definisci la velocità come la velocità istantanea della superficie da un intervallo di tempo all'altro, misurata in μm/s²².
         NOTA: Gli eventi di contatto sono un fenomeno descritto dagli autori come punti postsinaptici intatti che condividono una distanza di 0 μm tra le singole microglie per almeno cinque intervalli di tempo costanti all'interno del timelapse.

Results

La microglia delle retine murine CX3CR1-GFP è stata fotografata utilizzando il protocollo descritto. I topi variavano da P30 a P60 al momento dell'iniezione AAV-PSD95-RFP, e erano passati almeno 21 giorni per permettere l'espressione di AAV. Immagini rappresentative della microglia e delle loro interazioni con i punti PSD95 prima e dopo l'analisi sono mostrate nella Figura 2. Per indurre l'attivazione della microglia, abbiamo...

Discussion

Questo protocollo consente la visualizzazione e il tracciamento delle singole interazioni microgliali con i siti postsinaptici lungo le dendriti degli RGC. In una malattia neurodegenerativa come il glaucoma, la microglia colocalizza con le sinapsi nello strato interno plexiforme (IPL) della retina. Il ruolo della microglia nello smontaggio delle sinapsi non è ben compreso. Tuttavia, la microglia può contribuire tramite diversi meccanismi potenziali, tra cui l'inghiottimento aberrante del...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ago calibro 25	Alcon	8065420920
26s Gauge 10 & micro; Siringa L	Hamilton	701RNWG
7m8	Addgene	64839	http://n2t.net/addgene:64839
Filo in acciaio inox multiuso 304 Bend-and-Stay	Materiali Avanzati di Stanford	SS3368	Filo d'acciaio per fare anelli
Cloruro di calcio esaidrato	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Microscopio disseczionale	Amscope		Dissezionare e montare retine
Forbici per la dissezione	FST	15024-10
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Pinza	Dumont	11252-21
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Imaris 10.0.2	Oxford Instruments		Software di analisi
Convertitore di file Imaris	Oxford Instruments
Controllo Gel Ultra Super Colla Loctite	Loctite	1363589	Colla per realizzare anelli
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M9272-100G
Carta filtrante a membrana MCE (13 mm)	Millipore	HABG01300	0,45 μ m Dimensione dei pori
Camera Microambientale	Tokai Hit	STXG-TIZBX-SET
Microscopio rovesciato Nikon Eclipse Ti2-E	Nikon
Elementi NIS	Nikon
Neomicina e Polimixina B Sulfae e Bacitracina Zinc Optalamica Opulenta, USP	Bausch + Lomb	24208-780-55
Pennello Dimensione 00	Amazon
Prisma 8.0	GraphPad
Soluzione optalmica di cloridrato di proparacaina USP, 0,5%	Sandoz	61314-0016-01
Piastra di Petri rivestita con PDL (35 mm)	Matek	P35GC-1.5-14-C	Copertura n. 1.5
PSD95_pTagRFP	Addgene	52671	http://n2t.net/addgene:52671
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Monoidrato monobase fosfato di sodio	Sigma-Aldrich	S9638-25G