Costruzione di microarray tissutali a base di colla per la ricerca su tumori e malattie

Summary

Questo protocollo descrive una produzione a basso costo e un metodo di convalida efficiente per la costruzione di TMA a base di colla, fornendo una comoda piattaforma di diagnosi patologica per la ricerca su tumori e malattie.

Abstract

La tecnologia dei microarray tissutali (TMA) è una piattaforma ad alto rendimento per il rilevamento e l'analisi simultanei di più campioni di tessuto, facilitando un'efficiente ricerca sui biomarcatori di tumori e malattie. Tuttavia, i metodi convenzionali di costruzione TMA spesso incontrano limitazioni come complessità operativa, procedure che richiedono tempo e precisione variabile. Per superare queste sfide, è stato sviluppato un metodo di costruzione TMA a base di colla, che offre una migliore fissazione del nucleo tissutale e una maggiore stabilità strutturale. La convalida sistematica ha incluso la valutazione istologica (colorazione HE), la profilazione immunoistochimica delle proteine bersaglio e l'analisi dell'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH). I risultati hanno dimostrato che il metodo basato sulla colla ha mantenuto un'eccellente integrità della fetta, un migliore rapporto segnale/rumore e ha garantito una riproducibilità costante da lotto a lotto. Sebbene l'approccio sia limitato al funzionamento manuale, rappresenta un'opzione affidabile ed economica per la produzione di TMA a velocità moderata. Questo metodo è particolarmente adatto agli ambienti di ricerca che valorizzano la flessibilità e la diversità dei campioni rispetto all'automazione su larga scala, ampliando l'utilità della TMA in contesti accademici e diagnostici.

Introduction

Il Tissue Microarray (TMA) è una tecnica ad alto rendimento per l'analisi di campioni di tessuto ^1,2,3. Si ottengono più nuclei di tessuto del donatore e i blocchi di paraffina del donatore vengono trasferiti nei blocchi di tessuto del ricevente per l'analisi molecolare differenziale e comparativa simultanea nelle stesse condizioni di prestazione ^2,4. Il modo classico per costruire un microarray tissutale (TMA) consiste nell'utilizzare un perforatore per estrarre nuclei di tessuto da un campione di tessuto del donatore e disporli in sequenza in un blocco di paraffina ricevente. Questo metodo è adatto per blocchi di paraffina donatori di profondità simile e consente l'analisi efficiente di più campioni su una singola fetta, migliorando notevolmente l'efficienza dello studio e la coerenza dei dati ^5,6,7. Tuttavia, questo metodo presenta ancora alcune limitazioni, tra cui una manipolazione inadeguata del nucleo di tessuto durante il processo di inclusione, che può comportare una colorazione incoerente dei campioni nelle analisi successive⁸.

Il secondo metodo di costruzione TMA è il metodo del nastro ^9,10. Questo metodo inverte il processo di costruzione fondendo il blocco attorno a nuclei verticali rovesciati che, una volta completati, sono a filo con la parte superiore del TMA, indipendentemente dalla lunghezza del nucleo^11,12. Tuttavia, questo metodo richiede di garantire il corretto posizionamento del nucleo di tessuto e l'efficacia del nastro, e limita anche il numero di campioni che possono essere elaborati rispetto alle tecniche tradizionali.

Questo studio propone un metodo innovativo per la costruzione di TMA, con l'obiettivo di risolvere problemi come l'insufficiente stabilità dei nuclei di tessuto e il funzionamento complesso che esistono nelle tecniche tradizionali¹³. Questo metodo utilizza la colla per fissare con precisione più nuclei di tessuto insieme e presenta i vantaggi di un funzionamento semplice e di una forte fermezza del campione. Rispetto ai metodi tradizionali di sezionamento o nastro, il metodo della colla può aumentare il tasso di ritenzione delle anime di tessuto e ridurre i costi. Questo metodo è applicabile a studi clinici con un campione di medie dimensioni ed è particolarmente adatto per disegni di ricerca che richiedono un adeguamento flessibile del piano sperimentale. Tuttavia, va notato che la capacità di elaborazione di questo metodo non soddisfa le esigenze di una produttività ultra elevata⁹. Nel frattempo, nel processo di applicazione vero e proprio, è necessario stabilire una serie completa di norme operative standardizzate e sistemi di controllo della qualità. Gli operatori devono ricevere una formazione sistematica e superare valutazioni professionali per garantire la standardizzazione delle operazioni tecniche e la ripetibilità dei risultati. Un'analisi completa indica che questa tecnologia raggiunge un buon equilibrio tra flessibilità operativa, economicità e affidabilità tecnica ed è particolarmente adatta per scenari di ricerca in cui le risorse sono limitate ma il controllo di qualità deve ancora essere garantito.

Protocol

Tutti i blocchi donatori sono stati ottenuti da campioni patologici d'archivio raccolti tra il 2016 e il 2018 presso l'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an No.1 dell'Università di Medicina di Nanchino. I campioni sono stati resi anonimi prima dell'uso e processati in conformità con i protocolli approvati (il comitato etico dell'Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, KY-2024-250-01).

1. Valutazione e marcatura del tessuto del donatore

1. Selezionare blocchi di tessuto con uno spessore di ≥5 mm e un'area di ≥15 mm × 15 mm. Garantire un margine di sicurezza di 2 mm ai bordi ed escludere le regioni che presentano necrosi, emorragia o calcificazione per mantenere l'integrità dei tessuti.
2. Identificazione e marcatura dell'area target
   1. Valutare le sezioni colorate con H&E utilizzando un microscopio ottico. Localizza l'area target attraverso la scansione a bassa potenza, quindi passa ad alta potenza per confermare le caratteristiche morfologiche cellulari. Contrassegna i confini dell'area di destinazione sulle diapositive.
   2. Mappare le coordinate dell'area selezionata sulla superficie del blocco di paraffina per completare la conversione della marcatura.

2. Estrazione del nucleo tissutale

1. Preparazione della puntura e pretrattamento del campione
   1. Scegliete una perforatrice portatile da 2 mm di diametro e confermate la scorrevolezza del suo tagliente e la facilità d'uso.
   2. Posizionare il blocco di paraffina donatrice su una piattaforma fredda a 4 °C per 15 minuti.
2. Allineare l'ago verticalmente con il punto contrassegnato e applicare una pressione di rotazione costante per raggiungere la profondità limite. Evitare di inclinare o vibrare durante il processo⁷ (Figura 1A).
3. Ruotare delicatamente l'ago in senso antiorario (≤2 giri/s) per estrarlo. Espellere con cautela il nucleo di tessuto dall'ago e trasferirlo in un pozzetto individuale di una piastra pre-raffreddata a 96 pozzetti. Registrare la posizione del nucleo in ciascun pozzetto (Figura 1B).
   NOTA: Se la parte inferiore del nucleo del tessuto è irregolare, livellarla con una lama. Dopo il taglio, ricontrollare l'integrità.
4. Registrare in anticipo tutti i numeri dei donatori e le corrispondenti posizioni dei pozzetti della piastra ELISA (A1-H12) nel modulo di registrazione. Durante l'operazione, ricontrollare per garantire una stretta corrispondenza tra il numero di donatori e le posizioni dei pozzetti.
5. Ispezionare immediatamente i nuclei per verificarne l'integrità. Scartare le anime fratturate, piegate o che presentano deviazioni di diametro >0,1 mm.
   NOTA: Garantire l'uniformità della lunghezza del nucleo (coefficiente di variazione, CV ≤5%) ed evitare graffi superficiali o artefatti di compressione.

3. Fissazione del nucleo tissutale

1. Utilizzare un pennarello impermeabile per disegnare una griglia direttamente sulla superficie dello stampo, garantendo linee chiare e uniformemente distanziate.
   1. Utilizzare uno stampo standard con un'area inferiore effettiva di 3,0 cm × 2,5 cm e riservare un'area di delimitazione vuota di 1,5 mm su ciascun lato.
   2. Utilizzare un pennarello impermeabile a punta fine da 0,5 mm per disegnare nove linee parallele equidistanti orizzontalmente e verticalmente, formando una griglia di posizionamento 9 × 9 (81 punti di intersezione in totale).
      NOTA: Prima di iniziare, pulire l'interno dello stampo con un batuffolo di cotone imbevuto di xilene per rimuovere i residui di paraffina, che possono causare delaminazione. Durante il processo di trafilatura, utilizzare un righello d'acciaio per garantire uno spessore uniforme della linea e punti di intersezione chiaramente distinguibili.
2. Utilizzare una pipetta per aspirare 5 μl di colla e posizionarla delicatamente al centro del vetrino pre-marcato per formare una singola gocciolina. Utilizzare immediatamente una pinzetta sottile per raccogliere verticalmente l'anima del tessuto con un angolo di 90° e premerla lentamente verticalmente nella goccia di colla (Figura 1C).
3. Inserire i nuclei nelle intersezioni della griglia corrispondenti sullo stampo utilizzando una pinzetta. Applicare una leggera pressione per 5 s per garantire un'adesione sicura (Figura 1D).
4. Se l'anima del tessuto viene spostata, regolarla e ripristinarla immediatamente utilizzando una pinzetta sottile prima che la colla si solidifichi (entro 30 s). Scartare le carote solidificate e disallineate per mantenere la qualità della preparazione preservando al massimo i campioni preziosi.

4. Installazione a cassetta e inclusione della paraffina

1. Posizionare verticalmente la cassetta di tessuto sopra lo stampo in acciaio, assicurandosi il contatto con le punte del nucleo senza applicare compressione. Fissare la cassetta utilizzando morsetti magnetici su tutti e quattro gli angoli e sigillare le cuciture con paraffina fusa.
2. Mettere in infusione la paraffina fusa con un angolo di 45° a zig-zag, mantenendo una velocità di flusso di 1 mL/s. Assicurarsi che il livello di paraffina superi le punte del nucleo di 2 mm (Figura 1E).
3. Raffreddare rapidamente il blocco su una piastra fredda a 4 °C per 5 minuti per formare uno strato di supporto rigido. Trasferire il blocco in un ambiente a 22 °C per 20 minuti per ridurre lo stress interno. Infine, utilizzare una pistola termica a 40 °C per levigare delicatamente la superficie ed eliminare i segni di ritiro.
4. Scaldare leggermente la paraffina per ammorbidirla, quindi tagliare con cura lungo i bordi della cassetta per allentare il blocco. Sollevare delicatamente la cassetta e rimuovere eventuali residui di paraffina per garantire l'integrità dei nuclei di tessuto (Figura 1F).

Results

Nel presente studio, sono stati costruiti microarray di tessuti di alta qualità utilizzando il metodo della colla. Per verificare l'efficacia del metodo, sono stati eseguiti una serie di esperimenti, tra cui la colorazione H&E, la rilevazione immunoistochimica di proteine specifiche e l'analisi di ibridazione in situ a fluorescenza (FISH). Una componente critica del processo di costruzione è la presenza di punti di nucleo di tessuto nelle posizioni e alle distanze previste l'uno dall'altro, che viene valutat...

Discussion

Come metodo innovativo per la costruzione di microarray tissutali (TMA), il metodo della colla ha mostrato vantaggi significativi grazie alla facilità delle procedure di costruzione e all'economicità. Rispetto al tradizionale metodo ad aghi, che si basa su strumenti sofisticati^14,15, il metodo della colla consente la fissazione del campione mediante incollaggio, che può essere eseguita solo con strumenti di base, riducendo notevo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di rilevamento HER2 per cancro al seno	Anbiping	2502001	Kit di rilevamento HER2 per cancro al seno
Anticorpo CDHR4	Abcam	ab166914	Anticorpo CDHR4 Anticorpo
CDK1 Abcam		ab265590	Anticorpo CDK1 Anticorpo
CRTAC1 Abcam		ab254691	Anticorpo CRTAC1
DNASE1L3 anticorpo	Abcam	ab203669	Macchina per
l'inclusione	P.S.J MEDICAL	BM450A	Macchina per l'inclusione
Essiccatore tissutale completamente automatico	Leica Biosystems	ASP3005	Essiccatore tissutale completamente automatico
Vetrini per microscopio	in vetro Citotest	250124A1	Vetrini per microscopio in vetro
Colla	TIZO	200	Colla
GPR146 anticorpo	Abcam	ab117104	GPR146
anticorpo IGSF10 anticorpo	Abcam	ab197671	IGSF10 anticorpo
ITIH1 anticorpo	Abcam	ab233032	ITIH1 anticorpo
Lame per microtomo a basso profilo	Thermo Fisher	3052835	Lame per microtomo a basso profilo
Pennarello	Deli	SK109	Pennarello
Microtomo	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Microtomo
Cera di paraffina	Solarbio	YA0012	Cera di paraffina
Anticorpo SMAD9	Abcam	ab262940	Anticorpo SMAD9 Anticorpo
TARBP1 Anticorpo	Abcam	ab115896	Anticorpo TARBP1
Anticorpo ZCCHC24	Anticorpo Abcam	ab88756	ZCCHC24