Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Summary

Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.

Abstract

Le microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, mostrano profili trascrizionali specifici per regione e contesto durante lo sviluppo e la malattia. Questo protocollo presenta due metodi complementari per lo studio delle popolazioni microgliali nel tessuto cerebellare di topo: la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Come primo metodo utilizzato, il protocollo basato sulla citometria a flusso è ottimizzato per i cervelli postnatali precoci, garantendo un robusto isolamento cellulare e coerenza in condizioni sperimentali. Inizia con la dissociazione tissutale mediante digestione enzimatica, seguita dalla rimozione della mielina tramite centrifugazione in gradiente di densità Percoll per produrre una sospensione di cellule neurali di alta qualità e una strategia di gating basata sull'espressione di CD45 e CD11b. La colorazione viva/morta garantisce la vitalità cellulare e gli anticorpi coniugati con fluorocromo vengono utilizzati per profilare l'espressione di marcatori di superficie selezionati sulla microglia. I controlli di compensazione vengono eseguiti utilizzando perle di lattice con strategie di gating convalidate utilizzando il controllo a fluorescenza meno uno (FMO).

Il secondo metodo prevede il sequenziamento dell'RNA a singola cellula utilizzando 10X Genomics, seguendo le stesse fasi di isolamento a monte, che consentono la profilazione trascrittomica della microglia in tutte le condizioni. I cluster microgliali vengono identificati utilizzando l'analisi dell'espressione genica e l'analisi dell'espressione differenziale viene condotta tra i gruppi sperimentali. Un classificatore forestale casuale viene applicato esclusivamente per distinguere i campioni maschili e femminili quando multiplexati.

Insieme, questi protocolli riproducibili e adattabili forniscono un solido quadro per studiare la diversità microgliale nel cervelletto durante lo sviluppo precoce del cervello e la sua potenziale alterazione a seguito di perturbazioni sperimentali.

Introduction

Il primo periodo postnatale è una fase critica per lo sviluppo del cervello, caratterizzata da complessi processi cellulari e molecolari che gettano le basi per le funzioni cognitive, emotive e comportamentali¹. Tuttavia, questo periodo è anche caratterizzato da vulnerabilità, poiché le interruzioni possono alterare le traiettorie dello sviluppo neurologico e portare a disturbi neurologici o psichiatrici a lungo termine. Le microglia, le cellule immunitarie residenti nel cervello, svolgono un ruolo centrale nel plasmare il cervello in via di sviluppo attraverso la potatura sinaptica, la fagocitosi, la sorveglianza immunitaria e le risposte agli insulti ambientali ^2,3. Queste cellule mostrano una notevole plasticità, adottando profili trascrizionali che variano a seconda della regione cerebrale, dello stadio di sviluppo e del contesto patologico ^4,5.

Un'analisi accurata dell'attivazione della microglia nel cervello in via di sviluppo richiede metodologie robuste e ripetibili in grado di analizzare i loro fenotipi dinamici nel contesto di tessuti cerebrali immaturi. La citometria a flusso fornisce una soluzione affidabile, consentendo la caratterizzazione ad alto rendimento delle popolazioni cellulari e l'espressione dei marcatori⁶. Tuttavia, la sua applicazione nello studio delle microglia provenienti da cervelli postnatali precoci è tecnicamente impegnativa a causa della natura delicata del tessuto e della necessità di efficienti protocolli di isolamento e arricchimento cellulare ^7,8.

Il protocollo qui presentato combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) per isolare e caratterizzare le microglia da cervelli di topo postnatale precoce, con particolare attenzione al cervelletto dal 3° giorno postnatale (P3) al 30° giorno postnatale (P30)⁹, una regione e uno stadio di sviluppo per i quali i riferimenti metodologici dettagliati rimangono limitati.

Questo flusso di lavoro include la dissociazione enzimatica, la centrifugazione in gradiente di densità per la rimozione dei detriti e l'arricchimento cellulare e l'immunocolorazione utilizzando un pannello di marcatori extracellulari e intracellulari. Per caratterizzare la diversità della microglia, viene impiegata una serie di marcatori di superficie e intracellulari^10,11. Invece di assegnare etichette fisse (infiammatorie o riparative), il protocollo definisce sottopopolazioni basate su profili di espressione di marcatori discreti. Ad esempio, le microglia che esprimono CD80, CD86 e iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 o CD163 e CD206 sono identificate e analizzate come sottogruppi molecolarmente distinti. Questi marcatori riflettono diversi stati della microglia attivata^10,11 e sono presentati come profili di espressione.

Questa strategia di gating multiparametrica consente l'identificazione precisa di sottogruppi microgliali in base all'espressione di marcatori di superficie, offrendo un quadro semplificato per l'analisi dell'eterogeneità immunitaria durante lo sviluppo cerebrale postnatale. Per estendere la profilazione fenotipica e scoprire la diversità trascrizionale, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula viene eseguito dopo l'isolamento cellulare. Questo studio stabilisce un flusso di lavoro coerente e scalabile per far progredire la comprensione dei processi di sviluppo neurologico e dell'impatto a lungo termine dell'attivazione microgliale. Integrando la citometria a flusso ottimizzata e lo scRNA-seq all'interno di un quadro informato sullo sviluppo e sulla regione, questo protocollo funge da potente strumento per studiare la biologia microgliale nelle prime fasi di vita e la sua rilevanza per gli esiti dello sviluppo neurologico.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state esaminate e approvate dal comitato etico del Centro di ricerca CHU Sainte-Justine e sono conformi alle linee guida e alle politiche del Centro di ricerca Ste-Justine e dell'Università di Montreal (Montreal, Quebec, Canada).

1. Isolamento cellulare dal cervello

1. Dopo le procedure di anestesia/eutanasia, rimuovere rapidamente l'intero cervello dalla cavità cranica e inserirlo in una provetta da 15 ml contenente terreno di coltura di cellule microgliali (vedere Tabella dei materiali). Mantieni il tubo sul ghiaccio. Ripetere la stessa procedura per altri topi, se necessario.
   Tutti i topi utilizzati in questo studio sono stati derivati da colonie riproduttive interne nel laboratorio del Dr. Tremblay. I topi sperimentali sono stati generati incrociando topi B6.129-Cx3Cr1 ^{CreERT2-EYFP/WT} con topi B6-Rosa26^iDTR/WT, entrambi originariamente provenienti dai Jackson Laboratories. Questa strategia di allevamento ha prodotto prole eterozigote per l'allele IDTR, consentendo la deplezione condizionale delle cellule che esprimono Cx3Cr1 (principalmente microglia) attraverso un sistema Cre-loxP inducibile dal tamoxifene. Prima della raccolta dei tessuti, i topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (150 μg/g) e xilazina (10 μg/g). L'eutanasia veniva eseguita mediante decapitazione in anestesia profonda, in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali.
2. Conservare l'intero cervello o procedere con la dissezione di regioni specifiche, se lo si desidera. Eseguire la dissezione in una piccola piastra di Petri contenente terreno di coltura cellulare microgliale (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare.
   NOTA: Questo protocollo è stato convalidato per l'intero cervello e il cervelletto da P1 a P30.
3. Rimuovere il terreno di coltura cellulare microgliale e tagliare finemente il tessuto cerebrale usando un bisturi in una capsula di Petri.
4. Per la digestione enzimatica, trasferire il tessuto omogeneizzato in provette da 5 mL. Aggiungere 2 mL di HBSS (1x) integrati con 2 mg/mL di collagenasi D e 14 μg/mL di DNasi I (vedere Tabella 1). Sigillare i tappi delle provette con parafilm. Incubare le provette in un bagnomaria a 37 °C per 15 minuti, agitando la provetta ogni 5 minuti. Per fermare la digestione, posizionare i tubi sul ghiaccio.
5. Far passare l'omogeneizzato attraverso un filtro a rete metallica da 140 μm (vedere la tabella dei materiali) per rimuovere i detriti di grandi dimensioni. Usa un pestello di vetro per dissociare le cellule.
6. Lavare il filtro più volte con terreno di coltura cellulare microgliale (3 ml per lavaggio).
7. Raccogliere il filtrato utilizzando una pipetta da 10 ml e trasferirlo in una provetta da 15 ml. Centrifugare la soluzione a 500 g per 7 minuti a 4 °C.
8. Eliminare il surnatante capovolgendo con cura il tubo. Risospendere il pellet raschiando delicatamente su una griglia.
9. Aggiungere 10 mL di una soluzione di terreno colloidale a base di silice al 37% (vedere Tabella 1) per rimuovere la mielina e i detriti. Centrifugare la soluzione a 500 g per 10 minuti a 4 °C con una forza frenante minima.
10. Aspirare lo strato di mielina nella parte superiore della soluzione utilizzando una pipetta da 10 mL.
    NOTA: L'aspirazione continua impedisce alla mielina di rimescolarsi nella soluzione.
11. Lavare le celle aggiungendo 10 mL di HBSS (1x) e centrifugare a 500 × g per 7 minuti a 4 °C.
12. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet raschiando delicatamente con un rack, quindi aggiungere 10 mL di tampone di selezione cellulare attivato fluorescente (FACS) (vedere Tabella 1). Centrifugare la soluzione a 500 g per 10 minuti a 4 °C.
13. Scartare il surnatante, risospendere il pellet finale e conservare le cellule. Le cellule isolate sono ora pronte per la colorazione con citometria a flusso o per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
14. Per l'isolamento del sequenziamento dell'RNA di una singola cellula, contare le cellule al microscopio utilizzando reagenti fluorescenti stabili al banco ( Tabella dei materiali) per distinguere le cellule nucleate vive e morte, insieme al blu di tripano ( Tabella dei materiali). Assicurarsi che le cellule siano in condizioni eccellenti, con vitalità fino al 90%, e raggiungere una concentrazione di 1000 cellule/μL). I passaggi successivi sono descritti nella sezione 9.1.
    NOTA: Mantenere le provette sul ghiaccio per tutto il protocollo. Tutte le fasi di centrifugazione devono essere eseguite a 4 °C con un freno massimo, ad eccezione della fase Percoll, per la quale è specificato un freno minimo. Per ottenere i migliori risultati, eseguire l'intero protocollo lo stesso giorno. Per il filtro del protocollo di sequenziamento dell'RNA a cellula singola tutte le soluzioni utilizzate per l'isolamento, nel passaggio 1.11, utilizzare HBSS (1x) per il secondo lavaggio e, nel passaggio 1.12, trattenere 70-100 μL della soluzione cellulare.

2. Protocollo di colorazione extracellulare con citometria a flusso

1. Trasferire tutte le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo conico (vedere la Tabella dei materiali). Centrifugare la piastra a 500 g per 5 min a 4 °C.
2. Capovolgere rapidamente la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento.
3. Risospendere il pellet cellulare in 25 μL di soluzione bloccante (vedere Tabella 1). Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Per preparare la miscela di colorazione extracellulare degli anticorpi (vedere Tabella 2), centrifugare le scorte di anticorpi a 10.000 × g per rimuovere potenziali aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare con cura il volume desiderato dal surnatante per preparare la miscela colorante e regolare il volume a 25 μl con il tampone FACS.
5. Aggiungere 25 μl della miscela di anticorpi extracellulari a ciascun pozzetto. Incubare per 20 minuti a RT.
   NOTA: Prima dell'uso sperimentale, tutti gli anticorpi sono stati titolati su sospensioni di singole cellule cerebellari (o cerebrali) per determinare la concentrazione di lavoro ottimale. La titolazione è stata eseguita mediante diluizioni seriali per generare una curva di saturazione ed è stata selezionata la diluizione corrispondente a un plateau del segnale con fondo minimo per la stadiazione del segnale.
6. Senza miscelare, aggiungere 150 μL di tampone FACS ai pozzetti. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento.
7. Risospendere il pellet della cella in 200 μL di tampone FACS. Centrifugare la piastra a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento. Ripetere il lavaggio ancora una volta utilizzando 200 μl di tampone FACS nelle stesse condizioni.

3. Colorazione intracellulare

1. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone saponina-paraformaldeide (PFA) (vedi Tabella 1) per fissare e permeabilizzare le cellule. Incubare per 10 minuti a RT, al riparo dalla luce.
2. Senza mescolare, aggiungere 100 μl di tampone saponinico (vedere la tabella 1). Centrifugare la piastra a 500 × g per 6 minuti a 4 °C. Capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento.
3. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone saponina. Preparare i controlli di compensazione aggiungendo 20 μl di perline (vedere la tabella dei materiali) a 11 pozzetti vuoti. Centrifugare la piastra a 500 × g per 6 minuti a 4 °C. Capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento.
4. Per preparare la miscela di colorazione intracellulare degli anticorpi (vedere Tabella 3), centrifugare le scorte di anticorpi a 10.000 × g per rimuovere potenziali aggregati. Senza disturbare il pellet, aspirare con cura il volume desiderato dal surnatante per preparare la miscela colorante e regolare il volume a 50 μl con tampone saponina.
5. Risospendere il pellet in 50 μl di miscela di anticorpi intracellulari (vedere nella Tabella 3). Aggiungere 1 μl di ciascun anticorpo ai pozzetti delle microsfere. Incubare per 30 minuti a RT.
6. Senza mescolare, aggiungere 150 μL di tampone saponina a ciascun pozzetto del campione cellulare e aggiungere 100 μL di tampone FACS a ciascun pozzetto contenente i controlli di compensazione per lavare le sfere. Centrifugare la piastra a 500 × g per 6 minuti a 4 °C. Capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento.
7. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone saponina e risospendere i controlli di compensazione in 200 μL di tampone FACS. Centrifugare la piastra a 500 × g per 6 minuti a 4 °C. Capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante con un solo movimento. Ripetere il lavaggio ancora una volta utilizzando 200 μl di tampone saponinico nelle stesse condizioni.
8. Risospendere le celle e i controlli di compensazione in 200 μL di tampone FACS. Trasferire la sospensione in una provetta FACS e conservarla a 4 °C fino all'acquisizione della citometria a flusso.
   NOTA: Assicurarsi che tutte le fasi che coinvolgono reagenti sensibili alla luce siano eseguite in condizioni di luce minima. Un pozzetto della perlina non contiene anticorpi, il che corrisponde al tubo della perlina non colorato.

4. Acquisizione della citometria a flusso

1. Accendere il citometro a flusso e poi il computer.
2. Aprire il software del citometro a flusso e avviare l'avvio della fluidica selezionando Esegui nella scheda del citometro.
3. Per creare una nuova cartella dell'esperimento, fare clic su Nuova cartella e assegnare un nome. Quindi fare clic su Nuovo esperimento per assegnare un nome all'esperimento e selezionare Nuova provetta per aggiungere un campione e una provetta campione.

5. Impostare i controlli di compensazione

1. Preparare cordoni di compensazione con colorazione singola per ogni fluorocromo utilizzato nel pannello, insieme a un controllo non colorato.
2. Caricare i tubi di compensazione sul citometro. Impostare le tensioni di dispersione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) a circa 250.
3. Regolare le tensioni per ciascun canale fluorescente in modo che la popolazione negativa si trovi nella prima decade dell'asse.
4. Ottieni almeno 5.000 eventi per tubo.
5. Utilizzare la matrice di compensazione per regolare la sovrapposizione spettrale fino a quando tutti i picchi positivi non sono chiaramente separati dalla popolazione negativa e centrati sopra 10⁴ sul rispettivo asse.
   NOTA: I controlli di compensazione devono essere eseguiti per ogni esperimento, poiché le impostazioni del citometro o le prestazioni del fluorocromo possono influenzare in modo significativo la sovrapposizione spettrale. Sebbene i controlli di compensazione basati su cellule siano raccomandati in alcune applicazioni del tessuto cerebrale, in questo protocollo sono state utilizzate perle di cattura anticorpale a causa del minor numero di microglia ottenibili dal cervelletto di topo P3, che limita la fattibilità della compensazione basata su cellule. La fluorescenza degli anticorpi è stata inizialmente convalidata su cellule derivate dal cervello e si è rivelata paragonabile ai segnali basati su perline. Includere una sospensione cellulare non colorata derivata dal cervello durante l'ottimizzazione iniziale del pannello per valutare l'autofluorescenza tissutale e stabilire i livelli di segnale di base. Questo controllo è essenziale per impostare correttamente le popolazioni negative in ciascun canale fluorescente.

6. Preparare e acquisire i controlli FMO

1. Per ogni marcatore chiave, preparare un controllo a fluorescenza meno uno (FMO) che includa tutti gli anticorpi tranne quello da testare.
2. Eseguire i controlli FMO utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione dei campioni completamente colorati.
3. Utilizza i grafici FMO per definire le soglie di gating per popolazioni basse o sovrapposte e per discriminare i veri positivi dal rumore di fondo.
   NOTA: I controlli FMO devono essere eseguiti durante l'ottimizzazione iniziale del pannello per definire confini di gating accurati e affidabili, specialmente nei tessuti con elevata autofluorescenza, come il cervello. Se il pannello di colorazione, le impostazioni dello strumento o le condizioni sperimentali vengono modificati, i controlli FMO devono essere ripetuti. Per gli esperimenti successivi che utilizzano le stesse impostazioni convalidate del pannello e del citometro, le soglie di gating precedentemente definite possono essere riutilizzate per garantire la coerenza tra le repliche biologiche.

7. Preparare e acquisire i controlli isotipici

1. Colorare il campione di controllo con anticorpi di controllo isotipo abbinati in fluorocromo e concentrazione agli anticorpi di prova.
2. Acquisisci i dati utilizzando le stesse impostazioni del citometro.
3. Utilizzare i controlli isotipici solo per valutare il potenziale legame non specifico, in particolare nel caso di marcatori intracellulari o anticorpi scarsamente caratterizzati. Non utilizzare i controlli isotipici per il gating, poiché non riflettono la stessa cinetica di legame degli anticorpi specifici.
   NOTA: I controlli isotipici non sono adatti per il gating e non devono essere utilizzati per definire le popolazioni. Il loro uso è facoltativo e dovrebbe essere riservato alla convalida della specificità anticorpale in casi selezionati.

8. Strategia di gating per citometria a flusso

1. Creare i seguenti dot plot per il gating sequenziale:
   FSC-A vs. SSC-A per escludere i detriti
   FSC-A vs. FSC-H per selezionare i singolettoni.
   FSC-A vs. Amcyan (colorante di vitalità) per il gate delle cellule vive.
2. Identificare la microglia come CD11b⁺CD45⁺ utilizzando CD11b (FITC) vs CD45 (AF700).
   NOTA: A causa dello stadio di sviluppo (P3-P15), del contesto infiammatorio e della digestione enzimatica, TMEM119 e P2RY12 non erano affidabili per separare chiaramente la microglia da altre popolazioni mieloidi mediante citometria a flusso. La strategia di gating CD11b⁺CD45⁺ , precedentemente convalidata nel cervello postnatale, è stata quindi utilizzata per identificare le popolazioni di microglia minimizzando la contaminazione. In condizioni di controllo, la resa tipica varia da 30.000 a 200.000 cellule microgliali per intero cervello da P3 a P15. Per gli esperimenti incentrati specificamente sul cervelletto, la resa media è di circa 5.000 cellule microgliali per cervello.
3. Utilizzare i controlli FMO per definire le soglie di gating per i marcatori di attivazione.
4. Identificare le sottopopolazioni di microglia in base all'espressione di marcatori immuno-correlati:
   CD80⁺ (Super Luminoso 436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Caratterizzare ulteriormente i sottogruppi di microglia mediante combinazioni di espressione di marcatori:
   CD206⁺ (APC)^{quindi Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE) ^{poi CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600) ^{poi CD206+} (APC)
   NOTA: Le combinazioni di marcatori sono utilizzate per descrivere l'eterogeneità molecolare all'interno della popolazione microgliale. Questi sottogruppi sono riportati sulla base della sola espressione del marcatore e non sono assegnati ruoli funzionali specifici, in conformità con gli attuali standard che riconoscono la plasticità microgliale e i fenotipi dipendenti dal contesto.
6. Caricare il campione sperimentale. Impostare FSC su 300 e SSC su 200. Utilizzare una portata bassa e registrare il numero di eventi desiderato.
7. Dopo l'acquisizione, lavare il citometro ed esportare i dati come . File FSC per l'analisi.
8. Analizza i dati utilizzando il software del citometro a flusso.

9. Campione di sequenziamento dell'RNA a singola cellula

1. Utilizzando lo stesso protocollo di isolamento cellulare descritto per la citometria a flusso (vedere il passaggio 1.14), risospendere le cellule dissociate nel tampone FACS. Utilizzare il tampone FACS nelle provette di raccolta e in tutte le successive fasi di manipolazione per mantenere la stabilità delle celle.
2. Non eseguire lo smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) se l'obiettivo è catturare tutti i tipi di cellule da una regione del cervello. Tuttavia, se l'esperimento richiede l'arricchimento per la microglia, includere una fase di smistamento FACS prima del sequenziamento.
3. Valutare immediatamente la vitalità cellulare utilizzando coloranti fluorescenti stabili al banco e blu di tripano (vedere Tabella dei materiali). Contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro (vedi Tabella dei materiali).
4. Verificare che la sospensione cellulare presenti una vitalità di almeno il 90% e regolare a una concentrazione finale di circa 1.000 cellule/μL prima di procedere con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
5. Conservare tutti i campioni su ghiaccio ed elaborarli immediatamente dopo la dissociazione per ridurre al minimo lo stress cellulare e i cambiamenti trascrizionali.
6. Multiplexare i campioni in coppia seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Un maschio e una femmina dello stesso gruppo sperimentale sono stati raggruppati per ridurre i costi sperimentali.
7. Preparare le librerie scRNAseq (vedere la Tabella dei materiali) e seguire le linee guida consigliate dal produttore.
   NOTA: La preparazione della libreria è stata eseguita dalla Piattaforma di Genomica dell'Istituto di Ricerca in Immunologia e Cancro (IRIC) dell'Università di Montreal.
8. Sequenziare le librerie scRNA-seq utilizzando un sistema di sequenziamento a una profondità media di 3200 milioni di letture per corsia.
   NOTA: Il sequenziamento è stato eseguito presso Genome Quebec a Montreal.

10. Analisi del sequenziamento dell'RNA su singola cellula

1. Esegui l'analisi del conteggio dell'identificatore molecolare univoco (UMI) utilizzando il software Cell Ranger di 10X Genomics (v8.0.0) con il genoma di riferimento Mouse GRCm39 2024-A. Utilizzare il pacchetto Seurat R (v5.1) per l'analisi a valle.
2. Condurre il controllo di qualità escludendo le cellule con RNA mitocondriale superiore, ad esempio, al 30% dell'RNA totale (Figura 1A), o una soglia più rigorosa scelta per rimuovere le cellule con potenziale stress. Filtra le cellule di bassa qualità con log10GenesPerUMI maggiore di 0,75 (Figura 1B), conteggio delle caratteristiche uniche ("nUMI") inferiore a 500 e numero di geni rilevati per cellula ("nGene") maggiore di 300 (Figura 1C). Quindi, rimuovi le goccioline con il pacchetto "scDblFinder" in R. Con un grafico di correlazione di nUMI e nGene che mostra le soglie, l'effetto di filtraggio dovrebbe ora essere visibile (Figura 1D).
3. Mitiga gli effetti batch identificando 2.000 geni altamente variabili per campione utilizzando la funzione SelectIntegrationFeatures di Seurat.
4. Integra i set di dati utilizzando l'analisi di correlazione canonica (CCA) ed esegui l'analisi delle componenti principali (PCA) per la riduzione della dimensionalità. Utilizza la funzione RunPCA con 50 componenti principali (PC), ridimensionando i dati e facendo regredire le fonti di variazione indesiderate (ad esempio, il contenuto mitocondriale). Valuta il numero di PC trattenuti in base al grafico del gomito e all'analisi di JackStraw.
5. Visualizza i cluster utilizzando l'algoritmo UMAP (Uniform Manifold Apimation and Projection) tramite la funzione RunUMAP di Seurat. Identifica i profili di espressione genica specifici del cluster con la funzione FindAllMarkers . Annotare i cluster in base alle firme trascrizionali incrociando i geni marcatori identificati con risorse curate di singole cellule come PanglaoDB e CellMarker (Figura 2). I tipi di cellule, comprese le microglia, sono dedotti da questi profili trascrittomici piuttosto che da un marcatore di superficie predefinito.

11. Separazione cellulare basata sul sesso

1. Identificare cellule maschili e femminili in base all'espressione di geni sesso-specifici: quattro femminili (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) e tre maschili (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Classificare le popolazioni maschili e femminili filtrando le cellule che esprimono conteggi UMI normalizzati > 1 per uno qualsiasi di questi geni utilizzando la funzione del sottoinsieme di Seurat.
3. Genera oggetti Seurat sottoincaricando separatamente le celle maschili e femminili. Archiviare e analizzare questi oggetti in modo indipendente per i confronti downstream.
4. Convalida la classificazione visualizzando l'espressione genica specifica del sesso utilizzando le funzioni FeaturePlot e VlnPlot , garantendo una chiara separazione tra le popolazioni cellulari maschili e femminili.
   NOTA: I passaggi 12.1 e 12.2 devono essere eseguiti solo quando il campione è stato multiplexato mescolando un maschio e una femmina.

12. Classificazione delle microglia basata su modelli statistici

1. Costruisci cinque modelli statistici in R (foresta casuale, regressione logistica, Naive Bayes, macchina a vettori di supporto, albero decisionale) utilizzando un set di addestramento di ~1.000 celle con etichette di gruppo note.
2. Valutare le prestazioni del modello utilizzando la convalida incrociata a 10 volte e le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) (Figura 3). Identificare i geni chiave che contribuiscono alla classificazione utilizzando la funzione FindAllMarkers in Seurat.
3. Selezionare il modello con l'area più alta sotto la curva ROC (AUC). Il modello di foresta casuale è stato selezionato in base al punteggio AUC superiore.
4. Applicare il modello selezionato alle celle non classificate utilizzando la funzione di previsione del pacchetto RandomForest R. Unisci le classificazioni previste con i set di dati precedentemente annotati in Seurat utilizzando l'unione.
5. Convalida le classificazioni visualizzando l'espressione genica dei marcatori con FeaturePlot e VlnPlot. Per garantire la coerenza delle identità cellulari previste, valutare gli arricchimenti del set di geni marcatori che si sovrappongono prima e dopo l'aggiunta delle cellule classificate con un test statistico appropriato (ad esempio, il test esatto di Fisher).

13. Analisi dell'espressione genica differenziale della microglia

1. Esegui l'analisi dell'espressione genica differenziale (DEG) tra due gruppi specifici di interesse utilizzando la funzione di Seurat "FindMarkers", dove ident.1 rappresenta il gruppo di interesse e ident.2 rappresenta il gruppo di riferimento.
   NOTA: L'output elenca i geni che sono espressi in modo differenziale in ident.1 rispetto a ident.2. In questo contesto, i geni sovraregolati sono quelli con una maggiore espressione in ident.1 rispetto a ident.2, mentre i geni sottoregolati mostrano un'espressione inferiore in ident.1. I loro confronti vengono utilizzati per generare grafici vulcanici e interpretare il cambiamento trascrizionale specifico della condizione.
2. Identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) con un valore P aggiustato≤ 0,05. Per i confronti tra due gruppi specifici, utilizzare la funzione FindAllMarkers con i seguenti criteri: geni espressi in almeno il 10% delle cellule (min.pct = 0,1) e una soglia di variazione log2 di 0,25 (logfc.threshold=0,25). Per confronti multigruppo tra tutte le microglia, utilizzare la funzione FindAllMarkers con gli stessi parametri. I geni con un valore P aggiustato ≤ 0,05 sono considerati significativamente espressi in modo differenziale. Per visualizzare i modelli di espressione DEG, generare un grafico del vulcano utilizzando la funzione integrata nel pacchetto EnhancedVolcano (Figura 4).
3. Confronta i risultati della citometria a flusso esaminando prima i marcatori citometrici utilizzati per trovare la microglia, in particolare CD45⁺ e CD11b⁺, che corrispondono ai geni PtprceItgam. Conferma l'espressione genica utilizzando le funzioni FeaturePlot in Seurat.
4. Valutare i marcatori comunemente associati a stati microgliali distinti, tra cui CD80eNOS2, nonché Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163. Utilizzare le funzioni FeaturePlot e DotPlot di Seurat per visualizzare la loro espressione tra i cluster di cellule.
5. Genera un grafico a punti utilizzando la funzione DotPlot in Seurat per riassumere le espressioni dei marcatori e convalidare la classificazione della popolazione.

Results

Questo protocollo utilizza efficacemente la citometria a flusso per caratterizzare le popolazioni di cellule microgliali in campioni di cervello di topo, sulla base dell'espressione di marcatori di superficie e intracellulari selezionati. Le sezioni seguenti descrivono in dettaglio i risultati ottenuti dalle fasi chiave del flusso di lavoro, evidenziando la distribuzione e l'eterogeneità dei sottogruppi di microglia in risposta alle condizioni sperimentali.

Convalida della strategia di compensazione e gating
Le perle di compensazione sono state utilizzate per calibrare i segnali di fluorescenza e correggere la sovrapposizione spettrale tra i fluorocromi. Le popolazioni positive e negative per ciascun fluorocromo sono state chiaramente separate, consentendo un'accurata generazione di matrici di compensazione. Le soglie di gating sono state inizialmente convalidate utilizzando il controllo FMO (Fluorescence Minus One) durante l'ottimizzazione del pannello per distinguere il segnale reale dal fondo, in particolare per i marcatori poveri o sovrapposti. Queste soglie sono state successivamente riutilizzate in tutti gli esperimenti utilizzando le stesse impostazioni del pannello di colorazione e del citometro per garantire la coerenza. I controlli isotipici sono stati inclusi per monitorare il potenziale legame non specifico, in particolare per i marcatori intracellulari, ma non sono stati utilizzati per le decisioni di gating.

Identificazione delle cellule microgliali
La strategia di gating cellulare vivo/morto (Amciano) ha escluso con successo le cellule morte. La strategia di gating ha isolato efficacemente le popolazioni di cellule microgliali in base all'espressione di CD45 (AF700) e CD11b (FITC). I parametri di dispersione diretta (FSC) e laterale (SSC) sono stati ottimizzati (FSC = 300, SSC = 200) per centrare la popolazione di microglia all'interno del dot plot (Figura 5).

Fenotipizzazione delle cellule microgliali
L'analisi a punti ha permesso l'identificazione di sottopopolazioni di microglia in base all'espressione differenziale di marcatori di superficie e intracellulari. Utilizzando specifiche strategie di gating nel software FlowJo, è stato identificato un sottoinsieme di cellule microgliali che esprimono CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) e iNOS (PE-eFluor 610) (Figura 6A). Il doppio gating è stato utilizzato anche per definire sottogruppi che esprimono CD206 (APC) e Arg1 (PE-Cy7) (vedere la Figura 6B). Altre popolazioni sono state caratterizzate dalla co-espressione di CD86 (PE) e CD64 (PerCP-eFluor 710), nonché di CD163 (Super Bright 600) e CD206 (APC) (Figura 6C, D). Questi profili fenotipici riflettono l'eterogeneità definita dai marcatori all'interno della popolazione microgliale e dimostrano la capacità di questo protocollo di distinguere più sottogruppi trascrizionalmente e immunologicamente distinti senza dedurre stati funzionali fissi.

Analisi di microglia su singola cellula
L'approssimazione e la proiezione uniforme del collettore (UMAP) sono state utilizzate per visualizzare l'eterogeneità cellulare e identificare i cluster di cellule microgliali tra altri tipi di cellule cerebrali. Ogni punto rappresenta una singola cellula e il cluster è codificato a colori in base alla somiglianza trascrizionale (Figura 2).

L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita all'interno del cluster di microglia per identificare i geni modulati in condizioni sperimentali. I geni con un valore P aggiustato ≤ 0,05 sono stati considerati espressi in modo differenziale.

È stato generato un grafico a vulcano per visualizzare questi geni differenzialmente espressi di cellule microgliali, evidenziando quelli con un'elevata variazione di piega e significatività statistica (Figura 4).

Per confrontare questi risultati di singole cellule con i dati della citometria a flusso, è stata esaminata l'espressione dei marcatori microgliali CD45 e CD11b (Ptprc e Itgam). Un UMAP mostra la loro espressione all'interno di diverse popolazioni cellulari (Figura 7).

Infine, è stata valutata l'espressione di marcatori immuno-correlati selezionati per caratterizzare l'eterogeneità trascrizionale tra le cellule microgliali. Un grafico di Violin mostra l'espressione di geni come CD80 e NOS-, così come Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 a livello di singola cellula (Figura 8). Questi modelli di espressione dei marcatori consentono il confronto con la profilazione basata sulla citometria a flusso ed evidenziano la diversità molecolare dei sottogruppi microgliali in condizioni sperimentali.

Figura 1: Controllo di qualità dei dati trascrittomici su singola cellula. (A) Distribuzione del contenuto di RNA mitocondriale tra le cellule. Le cellule con >30% di RNA mitocondriale sono state escluse per rimuovere le cellule potenzialmente stressate o morenti. (B) Le cellule con un log10GenesPerUMI > 0,75 sono state filtrate per garantire un rapporto gene-UMI coerente e ridurre il rumore proveniente da librerie a bassa complessità. (C) Sono state escluse anche le cellule con meno di 500 trascritti rilevati (nUMI) o più di 300 geni rilevati (nGENE) per eliminare cellule multiple o di scarsa qualità. (D) Grafico di correlazione di NUMI rispetto a nGene che illustra l'impatto delle soglie di filtraggio. I doppietti rilevati sono stati rimossi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Visualizzazione UMAP di trascrittomi a singola cellula. Grafico UMAP che mostra la distribuzione di singole cellule in base ai profili trascrittomici ottenuti da due singoli animali. Ogni punto rappresenta una cella, codificata a colori in base all'identità del cluster. Il cluster di cellule microgliali viene identificato tra le altre popolazioni cellulari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Curva ROC del classificatore Random Forest valutata mediante cross-validation. Curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che illustra le prestazioni del modello Random Forest utilizzato per distinguere la microglia da altri tipi di cellule cerebrali in base ai profili di espressione genica. Il modello è stato addestrato su un set di ~1000 celle con etichette note e valutato utilizzando la convalida incrociata 10-fold. Tra i cinque modelli statistici testati (Random Forest, regressione logistica, naive Bayes, support vector machine e decision tree), il modello Random Forest ha ottenuto le prestazioni di classificazione più elevate. L'area sotto la curva (AUC) riflette l'accuratezza del modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'espressione genica differenziale in cellule microgliali. Grafico del vulcano che rappresenta la variazione log2 volte rispetto al valore P aggiustato per i geni espressi in modo differenziale nella microglia tra i due gruppi sperimentali (controllo vs. lesione cerebrale cerebellare). Il gene sovraregolato è più espresso nel gruppo di interesse (ident.1) e i geni sottoregolati mostrano un'espressione ridotta rispetto al gruppo di riferimento (ident.2). Vengono marcati i geni chiave espressi in modo significativamente differenziale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Strategia di gating per l'identificazione della microglia mediante citometria a flusso. (A) Strategia di gating applicata a cellule cerebellari da un topo di controllo postnatale al 3° giorno (P3). (B) Le canottiere sono state selezionate per escludere i doppietti. (C) le cellule vitali sono state identificate utilizzando un colorante vitale; gli eventi con basso FSC-A sono stati esclusi per rimuovere i detriti e garantire l'analisi delle cellule intatte. (D) Le microglia sono state identificate come CD45⁺ e CD11b⁺ con due popolazioni distinte: CD45 low-CD11b^int per la microglia quiescente e CD45^int -CD11b^high per la microglia attivata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Caratterizzazione dei profili di espressione dei marcatori della microglia mediante citometria a flusso. (A) Gating sequenziale di cellule CD45⁺ CD11b⁺ basato sull'espressione di CD80, CD86 e iNOS. (B) Identificazione di un sottogruppo che esprime CD206, seguita da gating basato sull'espressione di Arg1. (C) Identificazione di un sottogruppo che esprime CD86, seguita da gating basato sull'espressione di CD64. (D) Identificazione di un sottogruppo che esprime CD163, seguita da gating basato sull'espressione di CD206. Queste strategie di gating illustrano l'eterogeneità fenotipica delle popolazioni di microglia in base all'espressione di marcatori di superficie e intracellulari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Conferma dell'identità della microglia utilizzando l'espressione di Itgam e Ptprc nei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. UMAP mostra il panorama trascrizionale delle cellule cerebellari a P15, con l'espressione genica di Itgam e Ptprc sovrapposta in cluster. La co-espressione di questi marcatori mieloidi canonici supporta l'identificazione delle popolazioni di microglia e si allinea con i marcatori utilizzati nella citometria a flusso, fornendo una convalida incrociata tra le analisi trascrittomiche e a livello proteico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Profili di espressione di geni immuno-correlati selezionati in cellule microgliali identificati mediante sequenziamento dell'RNA a singola cellula. I grafici a violino mostrano la distribuzione dell'espressione genica per CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 tra le singole cellule microgliali. Questi marcatori sono comunemente associati a processi immuno-correlati e illustrano l'eterogeneità trascrizionale osservata all'interno della popolazione microgliale. I dati sono mostrati sia per il controllo che per le condizioni di lesione cerebrale cerebellare (CBI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate per l'isolamento e la colorazione delle cellule neurali. Questa tabella fornisce una composizione dettagliata delle soluzioni necessarie per l'isolamento e la colorazione delle cellule, comprese le rispettive concentrazioni e componenti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Concentrazioni della miscela di anticorpi per la colorazione extracellulare. Questa tabella descrive in dettaglio le concentrazioni di anticorpi e soluzione viva/morta utilizzati per la colorazione extracellulare, specificando i volumi e le diluizioni richiesti per ciascun anticorpo nella miscela colorante per un campione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Concentrazioni della miscela di anticorpi per la colorazione intracellulare. Questa tabella descrive in dettaglio le concentrazioni di anticorpi utilizzati per la colorazione intracellulare, specificando i volumi e le diluizioni richiesti per ciascun anticorpo nella miscela di colorazione per un campione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questo studio presenta un protocollo dettagliato e ottimizzato che combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule microgliali durante lo sviluppo cerebrale postnatale precoce. Sebbene la citometria a flusso rimanga una tecnica economica e accessibile, la sua integrazione con la trascrittomica a singola cellula fornisce informazioni complementari collegando l'espressione dei marcatori a livello proteico con i profili trascrizionali a livello genico. Il protocollo affronta le sfide tecniche specifiche del tessuto cerebrale immaturo, tra cui l'efficiente dissociazione, la rimozione di detriti e mielina e l'ottimizzazione delle strategie di immunocolorazione, per garantire la riproducibilità e l'affidabilità nell'analisi delle popolazioni microgliali in punti chiave dello sviluppo.

La citometria a flusso è stata utilizzata per identificare sottogruppi microgliali in base all'espressione di marcatori di superficie e intracellulari selezionati. Piuttosto che dedurre gli stati funzionali, i sottoinsiemi si distinguevano in base ai loro profili di espressione dei marcatori, come CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ; CD206⁺/Arg1⁺ ; Fenotipi CD86⁺/CD64⁺ o CD163⁺/CD206⁺ . Queste popolazioni definite da marcatori riflettono l'eterogeneità molecolare all'interno del compartimento della microglia e forniscono un approccio pratico per la caratterizzazione ad alto rendimento. Sebbene queste classificazioni basate su marcatori di superficie potrebbero non catturare l'intera complessità della diversità delle microglia, rimangono informative, specialmente in contesti in cui gli strumenti molecolari ad alta dimensione potrebbero non essere disponibili. Le classificazioni binarie come il paradigma M1/M2 sono state deliberatamente evitate, riconoscendo la natura spettrale e dipendente dal contesto dei fenotipi microgliali, come descritto nella letteratura recente¹².

Queste osservazioni sono coerenti con studi precedenti che evidenziano il ruolo della microglia sia nella normale maturazione cerebrale che in risposta a stimoli ambientali o patologici ^13,14. La capacità di differenziare l'eterogeneità della microglia offre preziose informazioni su come la polarizzazione delle cellule microgliali possa contribuire ai disturbi dello sviluppo neurologico^15,16.

Sebbene il sequenziamento dell'RNA a singola cellula offra una risoluzione più elevata e consenta l'identificazione di sottopopolazioni di cellule microgliali trascrizionalmente distinte, il suo costo e la complessità analitica ne limitano l'accessibilità. Nell'attuale set di dati raccolto al 15° giorno postnatale dopo la lesione perinatale, il picco di risposta infiammatoria è in gran parte risolto, determinando un basso numero di microglia attivate. Di conseguenza, le tecniche di riduzione della dimensionalità come l'UMAP non hanno recuperato sottocluster microgliali ben separati e l'analisi trascrizionale a livello di cluster non è stata inclusa in questo manoscritto del protocollo.

Un'innovazione significativa di questo protocollo è la sua ottimizzazione per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule microgliali del cervelletto durante le prime fasi postnatali (da P3 a P30). Questa regione e il contesto specifico dell'età presentano sfide distinte, tra cui la bassa resa cellulare, il contenuto di mielina e l'aumento della fragilità dei tessuti. Per affrontare questi vincoli, il protocollo integra un flusso di lavoro di dissociazione adattato, un'efficiente rimozione di detriti e mielina e condizioni di immunocolorazione accuratamente regolate adatte al tessuto cerebellare di piccolo volume. Nonostante il crescente riconoscimento delle microglia cerebellari come funzionalmente e trascrizionalmente distinte da quelle in altre regioni cerebrali, i protocolli dettagliati per il loro isolamento e analisi rimangono limitati. L'attuale metodo offre un flusso di lavoro affidabile e accessibile, particolarmente adatto per gli studi sullo sviluppo della microglia cerebellare.

L'obiettivo principale di questo manoscritto è quello di fornire un quadro metodologico riproducibile e adattabile piuttosto che riportare specifiche scoperte biologiche. Il flusso di lavoro è adatto per l'adattamento ad altre fasi di sviluppo o a modelli sperimentali in cui gli stati microgliali trascrizionalmente distinti possono essere più prominenti. In tali contesti, la citometria a flusso rimane uno strumento prezioso, soprattutto se integrata con saggi complementari.

Uno dei punti di forza di questo protocollo è la sua adattabilità alle varie fasi dello sviluppo, che vanno dal 3° giorno postnatale (P3) al 30° giorno postnatale (P30). Ciò consente l'analisi longitudinale del fenotipo della microglia man mano che la maturazione cerebrale progredisce. L'uso combinato della citometria a flusso e dello scRNA-seq consente di studiare non solo i marcatori di superficie, ma anche le vie di segnalazione intracellulare e i fattori di trascrizione coinvolti nelle cellule microgliali.

Ciononostante, la digestione enzimatica può influenzare l'espressione di alcuni marcatori di superficie, richiedendo un'attenta ottimizzazione delle condizioni di digestione per specifici obiettivi sperimentali^17,18. Inoltre, né la citometria a flusso né il sequenziamento a singola cellula forniscono dati a livello di popolazione, che potrebbero non catturare completamente le sfumature spaziali e funzionali delle interazioni delle cellule microgliali all'interno del loro ambiente nativo. L'incorporazione di tecniche spaziali a singola cellula potrebbe aiutare ad affrontare questa limitazione preservando il contesto spaziale delle cellule microgliali. Studi futuri che combinano questo protocollo con tecniche di imaging, come l'immunoistochimica, l'imaging in vivo, il western blot o la trascrittomica spaziale a singola cellula, potrebbero offrire intuizioni complementari sulla dinamica delle cellule microgliali.

Questo metodo apre nuove strade per studiare come gli insulti precoci, come l'infiammazione, l'ipossia o i fattori di stress ambientale, influenzino i fenotipi delle cellule microgliali e contribuiscano agli esiti a lungo termine dello sviluppo neurologico. Consentendo una caratterizzazione precisa e affidabile degli stati di attivazione delle cellule microgliali, facilita l'identificazione di bersagli terapeutici per modulare le risposte microgliali nei primi anni di vita, con l'obiettivo di prevenire o mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico.

In conclusione, questo protocollo offre un quadro robusto e accessibile per lo studio della diversità delle cellule microgliali durante lo sviluppo precoce del cervello. La combinazione di citometria a flusso e sequenziamento dell'RNA a singola cellula consente un'applicazione flessibile in varie fasi di sviluppo e modelli sperimentali, facilitando un'esplorazione più approfondita della biologia della microglia in contesti sia fisiologici che patologici.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 µ m filtro a rete metallica	Sigma-Aldrich	S3895
Provetta da 15 mL	Sarstedt	62.554.205
Provetta da 5 mL	Sarstedt	55.526.006
Piastra a 96 pozzetti con fondo conico	Sarstedt	82.1583.001
Arginasi 1 - Coniugato Pecy7 - Clone : A1exF5	Thermo Fisher Scientifico	25-3697-82
Reagenti fluorescenti stabili da banco	Invitrogen	Codice: A49905
CD11b - Coniugato Fitc - Clone : M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Coniugato SB600 - Clone : TNKUPJ	Thermo Fisher Scientifico	63-1631-82
CD206 - APC coniugato - Clone : C068C2	BioLeggenda	141708
CD45 - Coniugato A700 - Clone : 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Coniugato PerCP-eF710 - Clone : X54-5/7.1	Thermo Fisher Scientifico	46-0641-82
CD80 - Coniugato SB436 - Clone : 16-10A1	Thermo Fisher Scientifico	62-0801-82
CD86 - Pe coniugato - Clone : GL-1	BioLeggenda	105008
Collagenasi D	Sigma– Aldrich	11088866001
DNasi I	Sigma– Aldrich	10104159001
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma– Aldrich	F1051
HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) 10x	Wisent Bioproducts	Codice 311506CL
Emocitometro	VWR Internazionale	82030-470
HEPES	Wisent Bioproducts	330.050.EL
iNOS - PE coniugato - eF610 - Clone : CXNFT	Thermo Fisher Scientifico	61-5920-82
Kcl	Thermo Fisher Scientifico	BP366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Scientifico	BP362-500
Vivo/Morto Amcyan	Thermo Fisher Scientifico	L34957
Terreni di coltura cellulare microgliale	Tecnologie per la vita	Codice A12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Scientifico	BP332-500
NaCl	Thermo Fisher Scientifico	BP358-212
Paraformaldeide	Sigma– Aldrich	P6148
Topo antiratto CD16/CD32	BD Bioscienze	553142
Saponina	Sigma– Aldrich	S7900
Librerie scRNAseq	Genomica 10X	1000121
Mezzo colloidale a base di silice	Thermo Fisher Scientifico	45001747
Aziduro di sodio	Thermo Fisher Scientifico	BP922I-500
Tripan Blu	Gibco	1525006