Misurazione della guanosina monofosfato ciclico (cGMP) nei tessuti solidi mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico competitivo (ELISA)

Sommario

Questo protocollo misura le concentrazioni di guanosina monofosfato ciclico (cGMP) nei tessuti solidi utilizzando un saggio di immunoassorbimento enzimatico competitivo (ELISA). Il protocollo descrive come processare i tessuti solidi, eseguire ELISA competitivi, convertire le assorbanze in concentrazioni di cGMP in picomoli per millilitro e calcolare le concentrazioni finali come nanomoli di cGMP per grammo di tessuto.

Abstract

Una delle principali vie che produce guanosina monofosfato ciclico (cGMP) è la via dell'ossido nitrico (NO)-cGMP. In questa via, l'NO stimola l'attività catalitica della guanilil ciclasi solubile (sGC), che converte la guanosina trifosfato in cGMP. L'NO è interessante perché, nei mammiferi, agisce come principale vasodilatatore, inibitore dell'aggregazione piastrinica, mediatore della funzione immunitaria, neurotrasmettitore e per migliorare la resistenza durante l'attività fisica, tra gli altri ruoli fisiologici. Misurare l'abbondanza di NO in diversi tessuti potrebbe aiutare a chiarire le sue funzioni. Tuttavia, l'NO non può essere misurato direttamente a causa della sua emivita inferiore ai secondi. In genere, i metaboliti di NO, nitrati e nitriti, vengono misurati per stimare l'abbondanza di NO. Questo perché queste molecole possono essere interconvertite in vivo attraverso reazioni redox. Un metodo meno comune per stimare l'abbondanza di NO richiede la misurazione della concentrazione di cGMP, una molecola di segnalazione a valle dell'NO. Tuttavia, la misurazione del cGMP nei tessuti viene eseguita raramente, nonostante crei la possibilità di comprendere meglio le funzioni dell'NO negli organi. Pertanto, esiste la necessità di un protocollo per misurare le concentrazioni di cGMP negli organi e nei tessuti solidi. In questo protocollo, i tessuti suini raccolti sono stati omogeneizzati, è stato eseguito un ELISA competitivo su campioni processati e le assorbanze sono state convertite in nanomoli di cGMP per grammo di tessuto originale. In breve, questo protocollo delinea un metodo semplicistico per misurare le concentrazioni di cGMP nei tessuti solidi utilizzando il kit ELISA GMP ciclico.

Introduzione

La guanosina monofosfato ciclico (cGMP) è una molecola di segnalazione in grado di indurre cambiamenti fisiologici attraverso la via dell'ossido nitrico (NO)-cGMP. Nella via NO-cGMP, l'NO si lega alla guanilil ciclasi solubile, un enzima citosolico che converte la guanosina trifosfato in cGMP, aumentandone l'attività catalitica ^1,2. Il successivo aumento delle concentrazioni di cGMP attiva vie di segnalazione che promuovono la vasodilatazione³, portando a una diminuzione della pressione arteriosa ^4,5, la principale risposta fisiologica caratteristica della presenza di NO in vivo. Inoltre, è noto che l'NO influenza la funzione immunitaria⁶, migliora la resistenza durante l'attività fisica⁴ e previene la coagulazione del sangue inibendo l'aggregazione piastrinica⁷.

La misurazione diretta dell'NO è resa difficile dalla sua emivita inferiore ai secondi in vivo⁸ nella maggior parte dei tessuti biologici. Di conseguenza, chiarire gli effetti fisiologici dell'NO richiede un metodo per misurarne l'abbondanza ex vivo. Pertanto, i metodi quantitativi utilizzabili evitano la misurazione diretta di NO. Un metodo comune per stimare le concentrazioni di NO nei tessuti è quello di misurare i metaboliti più stabili dell'NO: nitriti e nitrati 4,5,9,10,11. La principale complicazione dell'utilizzo delle concentrazioni di nitriti e nitrati come misure dell'abbondanza di NO è che entrambi i metaboliti fungono anche da precursore di NO e molecola di stoccaggio, rispettivamente. I metaboliti di NO, in particolare il nitrato, sono abbondanti in alcuni alimenti. Pertanto, le variazioni delle concentrazioni di cGMP, essendo il cGMP a valle dell'NO, sono utili per stimare le quantità di NO attivo, e l'abbondanza di NO può essere determinata senza l'interferenza di nitriti e nitrati precedentemente presenti.

Ricerche precedenti si sono basate sulla misurazione delle concentrazioni di cGMP nel plasma¹² e nelle piastrine¹³, ma meno comunemente osservata è la misurazione delle concentrazioni di cGMP nei tessuti solidi. La capacità di misurare le concentrazioni di cGMP nei tessuti solidi consentirebbe la caratterizzazione dell'attività di NO in organi specifici. L'obiettivo era quello di identificare un metodo semplicistico per misurare le cGMP nei tessuti solidi utilizzando ELISA competitivo. Un vantaggio dell'utilizzo di ELISA competitivo è che richiede apparecchiature comunemente presenti nella maggior parte dei laboratori interessati all'NO, come un lettore di micropiastre spesso utilizzato per altri scopi. In confronto, alcuni altri metodi di misurazione richiedono apparecchiature utilizzate raramente durante gli esperimenti focalizzati sull'NO, come i microscopi^14,15, un contatore a scintillazione¹⁶ o un laser¹⁷. Oltre alla sua accessibilità, la misurazione delle cGMP con ELISA competitivo è sensibile; Le concentrazioni di cGMP possono essere rilevate fino a 0,1 picomoli (pmol) di cGMP/mL¹⁸. Con piccole modifiche al protocollo¹⁸ del kit ELISA (Table of Materials) cGMP, è stato messo a punto un metodo per misurare il cGMP nei tessuti solidi utilizzando l'ELISA competitivo.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con il protocollo di studio sugli animali del ramo di medicina molecolare approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del NIDDK (ASP K049-MMB-23). La raccolta dei tessuti ha seguito le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del MedStar Health Research Institute (numero di protocollo: 2006001373 2020-017). Nello studio sono stati utilizzati giovani maiali adulti dello Yorkshire (due maschi e due femmine), di 3 mesi di età e di peso compreso tra 30 e 35 kg. La Figura 1 illustra uno schema che mostra i passaggi del protocollo del kit ELISA cGMP. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

Figura 1: Schema del protocollo. Uno schema che illustra i passaggi del protocollo del kit ELISA cGMP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del campione di tessuto

NOTA: I tessuti sono stati perfusi con una soluzione di eparina sodica prima della raccolta e quindi conservati a -80 °C prima dell'uso. Fare riferimento a Park et ^al.19 per i dettagli sulla raccolta dei campioni di tessuto.

1. Elaborazione di campioni di tessuto
   1. Raffreddare un polverizzatore per tessuti, una pinzetta e un cucchiaio su ghiaccio secco per 10 minuti prima di iniziare la procedura.
   2. Pesare un eccesso di tessuto, poiché una parte potrebbe andare persa durante la polverizzazione (resa intorno al 90%).
      NOTA: In precedenza, un eccesso di 170 mg dava risultati positivi. La massa può essere aumentata o diminuita, se lo si desidera. Assicurarsi che la massa tissutale risulti in un volume di campione sufficiente per le fasi di acetilazione e diluizione del campione di tessuto.
   3. Aggiungere il fazzoletto al polverizzatore su ghiaccio secco.
   4. Congelare il tessuto con azoto liquido e lasciare che l'azoto liquido vaporizzi completamente.
   5. Riposizionare il coperchio del polverizzatore e colpirlo con un martello 15 volte.
      NOTA: Se la configurazione del polverizzatore non è disponibile o non può essere utilizzata, il campione deve essere tagliato in pezzi il più piccoli possibile utilizzando forbici o bisturi mentre viene conservato congelato o almeno refrigerato su ghiaccio. Questo passaggio assicura una buona omogeneizzazione ed è fondamentale, soprattutto per i tessuti più duri.
   6. Tarare una provetta omogeneizzatore di perline e trasferire il tessuto polverizzato nella provetta utilizzando il cucchiaio e le pinzette raffreddati.
   7. Registrare la massa del tessuto aggiunto alla provetta dell'omogeneizzatore di microsfere per convertire successivamente le concentrazioni da molarità a moli per massa. Conservare il campione sul ghiaccio.
   8. Alla provetta di omogeneizzazione, aggiungere un volume in microlitri di acido cloridrico 0,1 N pari ad un multiplo della massa tissutale in milligrammi.
      NOTA: Diluizioni appropriate fanno sì che i campioni misurati cadano sulla curva standard. Queste diluizioni si trovano per diversi tipi di tessuto attraverso tentativi ed errori. In esperimenti precedenti, un rapporto di diluizione di 1:10 per il tessuto muscolare scheletrico e un rapporto di diluizione di 1:5 per il tessuto epatico hanno dato risultati positivi. Per riferimento, se si diluiscono 100 mg di tessuto, un rapporto di diluizione 1:10 richiederebbe 1.000 μl di acido cloridrico 0,1 N e un rapporto di diluizione 1:5 richiederebbe 500 μl.
   9. Omogeneizzare i campioni di tessuto utilizzando un omogeneizzatore a microsfere o una tecnica comparabile.
      NOTA: Raffreddare occasionalmente il campione durante l'omogeneizzazione utilizzando il ghiaccio. Se non è disponibile un omogeneizzatore a microsfere, è possibile sostituirlo con altri metodi di omogeneizzazione che distruggono efficacemente le cellule e creano omogeneizzato tissutale, incluso l'uso di un omogeneizzatore rotativo o di un omogeneizzatore a ultrasuoni.
   10. La centrifuga omogeneizza per 30 minuti a una velocità di 17.000 x g mantenendo una temperatura del campione di 4 °C.
       NOTA: Gli omogeneizzati di tessuto muscolare scheletrico non sufficientemente diluiti diventano eccessivamente viscosi e gelatinosi. Questo può essere visto meglio dopo la centrifugazione.
   11. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga e centrifugare il surnatante per 10 minuti a 17.000 x g mantenendo una temperatura di 4 °C.
   12. Trasferire un'aliquota di surnatante in una provetta da microcentrifuga e mantenere il campione in ghiaccio.
       NOTA: L'acetilazione di 250 μl di surnatante ha dato risultati positivi. Per mettere in pausa il protocollo, congelare questi campioni a -80 °C e conservarli per un massimo di 48 ore. Si raccomanda di misurare il volume del surnatante per il processo di acetilazione il giorno dell'acetilazione.

2. Preparazione standard

NOTA: Preparare gli standard il giorno della preparazione della micropiastra ELISA.

1. Preparazione del tampone ELISA
   1. Aggiungere il concentrato tampone ELISA 10x scongelato in un flacone di vetro contenente 90 ml di acqua ultrapura.
      NOTA: Fare attenzione a sciacquare il concentrato di tampone ELISA 10x residuo con il tampone ELISA preparato e rimettere il tampone nel flacone di vetro. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
2. Preparazione standard dell'impasto
   1. Aggiungere 1 mL di tampone ELISA al flaconcino standard e agitare per scioglierlo.
      NOTA: Conservare a 4 °C per un massimo di 6 settimane.
3. Diluizione seriale standard
   1. Etichettare una provetta standard B e nove provette standard da 0 a standard 8.
   2. Aggiungere 9,9 mL di tampone ELISA alla provetta etichettata come standard B.
   3. Trasferire 100 μL dello stock standard (300 pmol/mL di cGMP) nella provetta B standard e agitare accuratamente.
   4. Trasferire 1.000 μl della soluzione nella provetta B standard alla provetta 1 standard.
   5. Aggiungere 500 μl di tampone ELISA alla provetta etichettata come standard 0 e alle provette etichettate come standard 2 allo standard 8.
   6. Vortex standard 1 e quindi trasferire 500 μL di soluzione dallo standard 1 allo standard 2.
   7. Vorticare lo standard 2 e quindi trasferire 500 μL di soluzione dallo standard 2 allo standard 3.
   8. Continuare a trasferire 500 μl dallo standard n-1 allo standard n, assicurandosi di agitare accuratamente gli standard dopo ogni aggiunta.
   9. Scartare 500 μl di soluzione dallo standard 8.
      NOTA: Assicurarsi di rispettare gli standard a vortice dove specificato per una curva standard ottimale. Gli standard da 0 a 8 hanno un volume di 500 μL. Conservare gli standard a 4 °C fino al momento dell'uso. Utilizzare gli standard il giorno della loro diluizione.

3. Acetilazione

NOTA: Durante la reazione di acetilazione, un gruppo acetilico viene aggiunto al gruppo ossidrile 2' della molecola cGMP, che modifica la struttura del cGMP e porta ad un aumento dell'affinità di legame degli anticorpi, migliorando la sensibilità del test ~10 volte. Nei campioni contenenti oltre 1,0 pmol/mL di cGMP, le misurazioni possono essere effettuate senza acetilazione e questo passaggio può essere omesso. La necessità di acetilazione deve essere determinata sperimentalmente, caso per caso.

1. Preparazione di idrossido di potassio
   1. Aggiungere 10 ml di acqua ultrapura al flacone di idrossido di potassio per creare una soluzione 4 M.
      NOTA: Non tappare il flacone poiché l'idrossido di potassio si dissolve. Conservare per mesi a temperatura ambiente.
2. Acetilazione di campioni di tessuto
   1. A un'aliquota di 250 μl del campione, aggiungere 50 μl (5:1) di idrossido di potassio 4 M e seguire rapidamente l'aggiunta con 12,5 μl (20:1) di anidride acetica.
   2. Vortice per 15 s.
   3. Aggiungere 12,5 μl di idrossido di potassio 4 M al campione e agitare brevemente.
   4. Facoltativo: se i campioni di muscolo scheletrico si solidificano dopo le fasi di acetilazione, centrifugare i campioni a 17.000 x g per 10 minuti.
3. Acetilazione degli standard
   1. Alla provetta etichettata con lo standard 0, aggiungere 100 μl di idrossido di potassio 4 M, immediatamente seguiti da 25 μl di anidride acetica.
   2. Vortice lo standard per 15 s.
   3. Aggiungere 25 μl di idrossido di potassio 4 M allo standard e agitare brevemente.
   4. Ripetere questi passaggi per gli standard numerati rimanenti.
      NOTA: Agitare tutti i campioni e gli standard per la stessa durata per garantire risultati coerenti.

4. Diluizione del campione di tessuto

1. Aggiungere rapporti predeterminati di tampone ELISA e un'aliquota di campione acetilato a una provetta per microcentrifuga.
   NOTA: Per ogni campione sono necessarie due diverse diluizioni. I rapporti di diluizione che fanno scendere le concentrazioni di cGMP misurate sulla curva standard sono stati individuati per tentativi ed errori. Le diluizioni devono essere determinate sperimentalmente per ogni tipo di tessuto in modo che la percentuale scenda tra il 20% e l'80%. In precedenti esperimenti di misurazione dei tessuti epatici, i rapporti di diluizione di 1:2 e 1:3 hanno prodotto risultati positivi con i valori percentuali appropriati. Questi rapporti hanno anche prodotto risultati positivi per il muscolo scheletrico. Tuttavia, le variazioni nel tessuto muscolare scheletrico possono richiedere campioni più diluiti.
2. Opzionale: se si forma un precipitato quando il campione di tessuto viene aggiunto al tampone ELISA, centrifugare il campione per 10 minuti a 17.000 x g.

5. Preparazione della micropiastra ELISA

1. Preparato tracciante per acetilcolinesterasi (AChE)
   1. Aggiungere 6 mL di tampone ELISA al flaconcino del tracciante AChE e agitare delicatamente per scioglierlo.
      NOTA: Conservare il campione a 4 °C per un massimo di 2 settimane. Non vortice.
2. Preparazione antisiero
   1. Aggiungere 6 ml di tampone ELISA al flaconcino di antisiero e agitare delicatamente per scioglierlo.
      NOTA: Conservare a 4 °C per almeno 4 settimane. Non vortice.
3. Incubazione del campione e dello standard
   1. Standard Vortex 0.
   2. Alla micropiastra ELISA, aggiungere 50 μL di aliquote standard da 0 a 5 pozzetti (NSB e B₀; Figura 2).
   3. A due dei pozzi (NSB; Figura 2) contenente lo standard 0, aggiungere 50 μL di tampone ELISA.
   4. Utilizzare un puntale per pipetta per aggiungere aliquote da 50 μl di standard da 1 a 8 alla micropiastra ELISA in duplicato. Iniziare con lo standard più diluito (standard 8) e poi procedere con il successivo più diluito fino a quando non vengono aggiunti tutti gli standard.
      NOTA: Aspirare ed erogare ogni standard più volte prima di aggiungerlo in un pozzetto. Standard di vortice prima di aggiungerli ai pozzi.
   5. Agitare ogni campione prima di aggiungere aliquote da 50 μl nei pozzetti in doppio o triplice copiato.
   6. Aggiungere 50 μl di tracciante AChE a ciascun pozzetto NSB, B₀, standard e campione (Figura 2).
   7. Aggiungere 50 μL di antisiero a ciascun pozzetto B₀, standard e campione (Figura 2).
   8. Coprire la micropiastra ELISA e incubare a 4 °C per 18 ore.
      NOTA: Assicurati di fare vortice ogni volta che ti viene chiesto di produrre risultati coerenti.
4. Preparazione del tampone di lavaggio
   1. In un flacone di vetro, aggiungere 200 ml di acqua ultrapura e 500 μl di concentrato di tampone di lavaggio 400x.
   2. Utilizzando una siringa, aggiungere 100 μL di polisorbato 20 al flacone di vetro.
   3. Agitare delicatamente il flacone per mescolare.
      NOTA: Conservare il tampone di lavaggio a 4 °C per un massimo di 2 mesi. Raddoppia i volumi di acqua ultrapura, 400x concentrato di tampone di lavaggio e polisorbato 20 per una micropiastra completa di campioni a 96 pozzetti.
   4. Trasferire il tampone di lavaggio in un flacone di lavaggio prima dell'uso.
5. Preparazione del reagente di Ellman
   NOTA: Preparare il giorno dello sviluppo della micropiastra ELISA.
   1. In un contenitore protetto dalla luce, aggiungere 20 ml di acqua ultrapura.
   2. Utilizzare un'aliquota dell'acqua ultrapura per sciogliere il reagente di Ellman.
   3. Trasferire il reagente di Ellman nel contenitore protetto dalla luce.
   4. Usa il reagente di Ellman per sciacquare la bottiglia in cui è arrivato.
   5. Trasferire tutta la soluzione nel contenitore protetto dalla luce utilizzando una pipetta.
6. Lavaggio per micropiastre ELISA
   1. Smaltire il contenuto della micropiastra ELISA capovolgendolo. Assicurarsi che i pozzetti siano svuotati picchiettando la micropiastra ELISA rovesciata su un tovagliolo di carta.
   2. Riempire i pozzetti con il tampone di lavaggio utilizzando il flacone di lavaggio.
   3. Agitare delicatamente la micropiastra ELISA per 5 secondi, quindi scaricare il tampone di lavaggio e picchiettare il liquido rimanente su un tovagliolo di carta.
   4. Riempire la micropiastra ELISA con il tampone di lavaggio, agitare delicatamente la micropiastra ELISA per 30 s e scaricarne il contenuto. Ripetere l'operazione quattro volte, picchiettando la micropiastra ELISA su un tovagliolo di carta dopo ogni scarico per rimuovere il liquido rimanente.
      NOTA: Evitare letture imprecise dell'assorbanza lavando accuratamente la micropiastra ELISA.
7. Sviluppo e lettura di micropiastre ELISA
   1. Trasferire il reagente di Ellman in un serbatoio.
   2. Lavorando rapidamente, utilizzare una pipetta multicanale per aliquotare 200 μl di reagente di Ellman nei pozzetti del bianco, NSB, B₀, TA, standard e campione.
   3. Aggiungere 5 μl di tracciante AChE al pozzetto TA.
   4. Coprire la micropiastra ELISA con parafilm, metterla in un contenitore protetto dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 60-90 minuti agitando.
      NOTA: Utilizzare i pozzetti B₀ come indicatori per il tempo di incubazione appropriato. I pozzetti ideali B₀ appaiono visibilmente gialli ma non scuri.
   5. Rimuovere la pellicola di paraffina e leggere la micropiastra ELISA a una densità ottica di 412 nm.
      NOTA: I pozzetti B₀ con un'assorbanza compresa tra 0,3 UA e 1,0 UA, con i bianchi sottratti, indicano che la micropiastra ELISA è adeguatamente sviluppata.
   6. Opzionale: Se la micropiastra ELISA è sottosviluppata, sostituire la pellicola di paraffina e lasciarla incubare in un contenitore protetto dalla luce per un ulteriore periodo. Se la micropiastra ELISA è troppo sviluppata, scaricare il reagente di Ellman, risciacquare una volta con il tampone di lavaggio e sviluppare nuovamente la micropiastra ELISA con il reagente di Ellman.

Figura 2: Layout delle micropiastre. Un esempio di layout di micropiastre per l'ELISA competitivo. NSB indica un pozzo di legame non specifico. B₀ indica un pozzo di legatura massimo. TA indica bene un'attività totale. Std. indica un pozzo standard con il suo numero corrispondente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Conversione in concentrazione

1. Calcoli del tracciante AChE legato
   1. Fare la media delle assorbanze dei due bianchi e sottrarre la media dalle assorbanze di ogni pozzetto.
      NOTA: Utilizzare le assorbanze sottratte in bianco per il resto dei calcoli.
   2. Calcola le assorbanze medie dei pozzetti NSB, B₀ e blank.
   3. Utilizzare la seguente equazione per calcolare l'assorbanza B₀ corretta:
      
      NOTA: Corr. sta per corretto, Abs. sta per assorbanza e Avg. sta per media. Se l'assorbanza media dei pozzetti bianchi (con la media del bianco sottratta) è un numero negativo, utilizzare zero per il calcolo.
   4. Calcola il rapporto per ogni standard e campione utilizzando la seguente equazione:
      
   5. Moltiplica il rapporto di ciascun campione per 100 per calcolare la percentuale .
      NOTA: I campioni tra il 20% e l'80% rientrano nella curva standard.
2. Calcoli di curve standard
   1. Fare la media del rapporto tra i pozzetti duplicati di ogni standard (da 1 a 8).
   2. Calcola il logit del rapporto medio di ogni standard utilizzando la seguente equazione:
      
   3. Utilizzando le concentrazioni note di ogni standard (Tabella 1) come valori X e il logit di ogni standard come valori Y, calcolare la pendenza e l'intercetta Y.
   4. Calcolare il coefficiente di determinazione utilizzando il log₁₀ delle concentrazioni standard cGMP note come valori X e il logit di ciascuno standard come valori Y.
      NOTA: Verificare che il coefficiente di determinazione sia vicino a 1.
3. Calcoli della concentrazione cGMP in pmol/mL
   1. Calcola il logit di ciascun campione utilizzando la seguente equazione:
      
   2. Per calcolare la concentrazione di cGMP in ciascun campione (in picomoli di cGMP per millilitro di campione), utilizzare la seguente equazione:
      
      NOTA: DR sta per rapporto di diluizione. L'omogeneizzato D.R. sum per campioni di fegato diluiti con un rapporto di diluizione 1:5 di acido cloridrico è pari a 6. La somma del tampone D.R. per i campioni di fegato diluiti con un rapporto di diluizione 1:2 del tampone ELISA è pari a 3. Pertanto, i termini raggruppati per parentesi vengono moltiplicati per 18.
4. Calcoli della concentrazione cGMP in nmol/g
   1. Calcola le nanomoli di cGMP per pozzetto con la seguente equazione:
      
   2. Calcolare i grammi di tessuto in ciascun campione acetilato con la seguente equazione:
      
      NOTA: "mg di tessuto" è la massa di tessuto aggiunta alla provetta di omogeneizzazione in milligrammi. "volume di HCl utilizzato": il volume di acido cloridrico 0,1 N utilizzato per diluire i campioni per l'omogeneizzazione.
   3. Calcolare i grammi di tessuto in ciascun campione diluito con tampone ELISA utilizzando la seguente equazione:
      
      NOTA: "volume di campione diluito" è il volume di campione diluito con tampone ELISA. "250 μL" è il volume del campione acetilato. I "reagenti" citati sono i reagenti di acetilazione 4 M KOH e l'anidride acetica.
   4. Calcola i grammi di tessuto per pozzetto con la seguente equazione:
      
      NOTA: "volume del tampone" è il volume del tampone ELISA utilizzato per diluire i campioni di tessuto prima di aggiungere i campioni ai pozzetti.
   5. Dividi le nanomoli di cGMP per pozzetto per i grammi di tessuto per pozzetto per calcolare la concentrazione di cGMP in nmol/g.

Numero standard	Concentrazioni di cGMP (pmol/mL)
Norma 1	3.0
Norma 2	1.5
Standard 3	0.75
Norma 4	0.375
Norma 5	0.1875
Standard 6	0.09375
Norma 7	0.046875
Standard 8	0.0234375

Tabella 1: Concentrazioni standard. Le concentrazioni note degli standard da 1 a 8.

Risultati

I suini domestici dello Yorkshire trattati con cloruro di sodio alimentare (0,15 mmol/kg) o nitrato marcato ^{con 15}N (0,15 mmol/kg) somministrato una volta al giorno per cinque giorni consecutivi come bolo in chow sono stati perfusi con una soluzione di eparina sodica (cloruro di sodio allo 0,9%) prima della raccolta dei tessuti; Tutti i dettagli della collezione sono stati precedentemente pubblicati¹⁹. Le concentrazioni di cGMP nei glutei, nei muscoli e nel fegato di quattro suini domestici dello Yorkshire sono state misurate in conformità con il protocollo ELISA descritto. I tessuti epatici sono stati diluiti in un rapporto di diluizione 1:5 e i muscoli glutei in un rapporto di diluizione 1:10, con acido cloridrico (HCl) 0,1 N per precipitare le proteine. Gli omogenati diluiti con HCl sono stati acetilati e quindi diluiti con tampone ELISA in un rapporto di diluizione 1:2 e 1:3 sia per i campioni di fegato che di muscolo gluteo. Le concentrazioni di cGMP sono state misurate come descritto sopra. Le assorbanze sono state convertite in picomoli di cGMP per millilitro di campione preparato e quindi in nanomoli di cGMP per grammo di tessuto (nmol/g di tessuto) come indicato nel protocollo di cui sopra.

Le concentrazioni di cGMP misurate nei tessuti epatici hanno prodotto risultati sperimentali ottimali nelle condizioni di cui sopra. Le concentrazioni di cGMP nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato con nitrati nel fegato suino sono rispettivamente 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g di tessuto e 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g di tessuto (Figura 3). Diversi valori confermano l'affidabilità dei risultati. Le assorbanze dei pozzetti B₀ con i bianchi sottratti, che vanno da 0,466 a 0,475, rientrano nell'intervallo da 0,3 UA a 1,0 UA, verificando un sufficiente sviluppo di micropiastre con il reagente di Ellman. L'alta qualità della curva standard è dimostrata sia dagli aumenti incrementali delle assorbanze dallo standard 1 allo standard 8 sia dalla linearità della curva standard, verificata da un coefficiente di determinazione di 0,99. La percentuale per ogni pozzetto misurato (31,5%-71,2%) è compresa tra il 20% e l'80%, a conferma del fatto che tutti i campioni rientrano nella curva standard. I campioni che possiedono le caratteristiche indicate sono adatti all'interpretazione.

Le concentrazioni di cGMP misurate nei tessuti muscolari glutei hanno prodotto risultati sperimentali non ottimali. L'etichetta subottimale viene assegnata ai risultati del muscolo gluteo perché la maggior parte dei valori percentuali dei pozzetti del muscolo gluteo (3,69%-27,3%) è scesa al di sotto del 20%, indicando che erano necessari campioni più diluiti affinché le assorbanze scendessero sulla curva standard. Le concentrazioni di cGMP nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato con nitrati nel muscolo gluteo suino sono rispettivamente di 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g di tessuto e 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g di tessuto (grafico non mostrato). I campioni di muscolo gluteo condividono le assorbanze dei pozzetti e degli standard B₀ dei campioni di fegato. L'utilizzo di questi campioni non ottimali può portare a conclusioni errate; pertanto, è necessaria la preparazione di campioni più diluiti e la rimisurazione delle concentrazioni di cGMP.

Figura 3: concentrazione di cGMP nel tessuto epatico. La concentrazione media di cGMP di fegato suino trattato con cloruro di sodio (0,15 mmol/kg) o nitrato marcato ^{con 15}N (0,15 mmol/kg) in nmol/g di tessuto. n = 4; le barre di errore indicano la deviazione standard; i dati sono stati analizzati dal t-test di Welch; NS sta per nessun significato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo fornisce istruzioni sui passaggi necessari per misurare le concentrazioni di cGMP nei tessuti solidi utilizzando ELISA competitivo. Le variazioni nelle concentrazioni di cGMP possono indicare differenze nell'abbondanza di NO nei tessuti. Studiando queste differenze nei tessuti solidi, è possibile chiarire le informazioni sull'NO in vari organi.

Nel protocollo, i campioni di tessuto sono stati prima omogeneizzati in preparazione per l'ELISA. Questo è iniziato congelando una massa di tessuto solido e poi polverizzandola. La rottura dei tessuti prima della fase di omogeneizzazione ha lo scopo di aiutare l'omogeneizzatore a microsfere a lisare le cellule. I tessuti sono stati omogeneizzati in acido cloridrico 0,1 N per precipitare le proteine, una tecnica utilizzata in altri metodi^20,21. Infine, i solidi e il precipitato sono stati separati dai componenti solubili mediante centrifugazione. Per realizzare la curva standard, uno stock di cGMP (300 pmol di cGMP/mL) è stato diluito in serie per ottenere otto diversi standard. Gli standard e i campioni sono stati acetilati per migliorare la sensibilità del test rilevando concentrazioni fino a 0,1 pmol di cGMP/mL. Questo aumento della sensibilità si ottiene quando il gruppo acetilico forma un legame con il cGMP, migliorando la capacità di ciascun anticorpo (presente nell'antisiero) di legarsi al cGMP¹⁸ acetilato. L'acetilazione sia degli standard che dei campioni garantisce l'uniformità del legame cGMP tra i pozzetti. La fase di acetilazione può essere omessa sia per gli standard che per i campioni se si prevede che la concentrazione di cGMP nei pozzetti delle micropiastre superi 1,0 pmol/mL¹⁸.

In preparazione per l'aggiunta di campioni ai pozzetti, i campioni sono stati ulteriormente diluiti con tampone ELISA. La diluizione aggiuntiva ha permesso ai campioni di cadere sulla curva standard e di assomigliare più da vicino al contenuto dei pozzetti NSB, B₀ e standard, creando uniformità. Insieme ai campioni e agli standard, nei pozzetti vengono miscelate diverse altre soluzioni. Nei pozzetti NSB, viene aggiunto un tampone ELISA (con e senza i reagenti di acetilazione) mentre l'antisiero viene sospeso. Questo serve a determinare la quantità di tracciante AChE (acetilcolinesterasi legata al cGMP) che si lega all'IgG di topo aderita al pozzetto in assenza dell'anticorpo specifico che comprende l'antisiero. I pozzetti B₀ contenevano tampone ELISA (con i reagenti di acetilazione), tracciante AChE e antisiero; pertanto, i pozzetti B₀ mostrano la capacità di legare del tracciante AChE senza la competizione del cGMP. Dopo che tutti i pozzetti sono stati riempiti in modo appropriato, la micropiastra viene incubata e quindi lavata. Il reagente di Ellman fu aggiunto ai pozzetti. Infine, un tracciante AChE è stato aggiunto al TA ben dopo l'aggiunta del reagente di Ellman. Questo ben rappresenta l'attività catalitica del tracciante AChE indipendentemente dalla quantità di tracciante legata alla micropiastra dagli anticorpi. La micropiastra è stata sviluppata a temperatura ambiente, consentendo al tracciante AChE di catalizzare una reazione colorimetrica.

Diverse fasi del protocollo possono alterare i risultati del test; È necessario prestare particolare attenzione quando si eseguono i passaggi che seguono per ottenere risultati ottimali. L'identificazione delle diluizioni appropriate per ogni tipo di tessuto per la fase di omogeneizzazione e dopo l'acetilazione è necessaria per garantire che i campioni rientrino nella curva standard. Durante la preparazione degli standard, le soluzioni devono essere accuratamente agitate o miscelate prima della rimozione di un'aliquota o dopo l'aggiunta di un'aliquota. Questo passaggio è importante per raggiungere le concentrazioni cGMP previste per ogni standard. Durante le fasi di acetilazione, ogni standard e campione deve essere agitato per la stessa durata per ottenere letture di assorbanza coerenti. Gli standard e i campioni devono anche essere vortex immediatamente prima dell'aggiunta di un'aliquota al pozzetto appropriato. Questa pratica si traduce in concentrazioni cGMP più accurate. Il lavaggio accurato della micropiastra migliora anche l'accuratezza dei valori di assorbanza, in quanto rimuove tutto il tracciante AChE non legato dal pozzetto. Dopo l'aggiunta del reagente di Ellman, deve essere concesso un tempo adeguato per lo sviluppo della micropiastra, prestando attenzione al colore e, soprattutto, alle assorbanze dei pozzetti B₀ . È importante riconoscere che la concentrazione di cGMP tra duplicati o triplicati può variare maggiormente nei campioni con livelli di cGMP più bassi rispetto a quelli con concentrazioni più elevate. La misurazione di un campione più concentrato può aiutare a risolvere questo problema. Inoltre, per tenere conto di eventuali variabilità tra le micropiastre, i campioni dello stesso tipo di tessuto devono essere misurati sulla stessa piastra, quando possibile. Seguire queste linee guida ci si aspetta che migliori la qualità dei dati risultanti dal test.

Il protocollo di cui sopra può essere estrapolato ad altri tessuti molli e solidi. L'ulteriore sviluppo della sottosezione della preparazione dei tessuti del protocollo di cui sopra può portare a un metodo adatto per il trattamento dei tessuti duri, compreso l'osso, che può essere interessante a causa della sua vascolarizzazione. Il continuo sviluppo di questa tecnica può portare a un metodo adatto a misurare le concentrazioni di cGMP in un'ampia varietà di tessuti solidi, risultando un metodo utile per raccogliere ulteriori informazioni sull'abbondanza di NO praticamente in qualsiasi tessuto. Sebbene il protocollo ELISA competitivo sopra indicato sia una tecnica utile per misurare il cGMP e stimare l'abbondanza di NO, presenta due notevoli limitazioni: (1) Questo test non distingue tra cGMP sintetizzato dalla guanilil ciclasi solubile e cGMP sintetizzato dalla guanilil ciclasi particellare (pGC). I peptidi natriuretici stimolano l'attivitಲ di pGC e, quindi, le modifiche al cGMP attraverso questa via non indicano cambiamenti nell'abbondanza di NO; (2) Inoltre, gli enzimi fosfodiesterasi (PDE) influenzano i risultati del test ELISA. Diverse PDE idrolizzano il cGMP, riducendone la concentrazione in seguito alla stimolazione di sGC da parte di NO²³. Pertanto, l'attività catalitica delle PDE può oscurare la connessione tra le concentrazioni di cGMP e l'abbondanza di NO. L'aggiunta di un inibitore della PDE5, come il sildenafil, per prevenire la perdita di cGMP è consigliabile per gli esperimenti incentrati principalmente sull'ottenimento di concentrazioni esatte di cGMP, anziché sull'ottenimento di misurazioni per osservare le tendenze delle concentrazioni di cGMP. Gli inibitori della PDE5 possono essere somministrati come sildenafil agli animali circa 1 ora prima della raccolta del campione (gli effetti durano fino a 4 ore^{e 24}) o, se tale somministrazione non è fattibile, il sildenafil può essere aggiunto ai campioni raccolti. Quando si inibiscono le PDE dopo la raccolta dei tessuti, aggiungere sildenafil all'acido cloridrico 0,1 N in modo che i tessuti siano omogeneizzati in presenza di sildenafil. È necessario effettuare misurazioni con e senza sildenafil per garantire che non vi siano interazioni incrociate tra il trattamento animale e il sildenafil.

Anche con i suoi limiti, il test viene utilizzato come informazioni informative sulla trasmissione a valle del segnale NO. In conclusione, l'abbinamento della misurazione delle concentrazioni di cGMP nei tessuti solidi con altri metodi di misurazione dell'NO consente una migliore comprensione degli effetti dell'NO negli organi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL di siringa orale BD Clear	Becton Dickinson	50382903052177
Provetta a fondo tondo da 14 mL	Falcone	352059
Microprovette da 2,0 ml, assortite	Olympus Plastics	24-283A
30-300 & micro; L pipetta multicanale	Eppendorf	3125000052
Anidride acetica (nel kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400031	98% puro Pericolo: Infiammabile, Corrosivo: ustiona grave della pelle, lesioni agli occhi, tossicità acuta Manipolazione sicura: Tenere lontano da fonti di accensione, lavorare in un'area ventilata, indossare guanti
Tracciante cGMP acetilcolinesterasi (in kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	481020	fosfato di potassio bibasico, cloruro di sodio,  fosfato di potassio monobasico, albumina bovina, azoturo di sodio, EDTA, tracciante AChE cGMP Pericolo: pericolo per la salute: tossicità d'organo da esposizione ripetuta, Corrosivo: lesioni oculari, irritante per la pelle e le vie respiratorie Manipolazione sicura: lavorare in un'area ventilata, Indossa i guanti
Antisiero ELISA cGMP (nel kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	481022	fosfato di potassio bibasico, cloruro di sodio,  fosfato di potassio monobasico, albumina bovina,  sodio azide, EDTA, policlonale anti-cGMP di coniglio Antisiero Pericolo: Pericolo per la salute: tossicità d'organo da esposizione ripetuta, Corrosivo: lesioni oculari, Irritante per la pelle e le vie respiratorie, Tossicità acuta Manipolazione sicura: Lavorare in un'area ventilata, indossare guanti
Standard ELISA cGMP (nel kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	481024	fosfato di potassio bibasico, cloruro di sodio,  fosfato di potassio monobasico, albumina bovina,  sodio azide, EDTA, standard cGMP Pericolo: Pericolo per la salute: tossicità d'organo da esposizione ripetuta, Corrosivo: danni agli occhi, Irritante per la pelle e le vie respiratorie Manipolazione sicura: lavorare in un'area ventilata, indossare guanti
Kit ELISA GMP ciclico	Azienda chimica delle Cayman	581021
Concentrato tampone ELISA 10X (nel kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400060	1 M fosfato, 1% BSA, 4 M cloruro di sodio, 10 mM EDTA, 0,1% sodio azide Pericolo: Pericolo per la salute: tossicità d'organo da esposizione ripetuta, Corrosivo: lesioni oculari, Irritante per la pelle e le vie respiratorie Manipolazione sicura: Lavorare in un'area ventilata, conservare in un contenitore con coperchio richiudibile, indossare i guanti
Serbatoio reagenti ELISA	Pierce (ora Thermo Fisher Scientific)	15075
Reagente di Ellman (in kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400050	fosfato di potassio bibasico, cloruro di sodio, fosfato di potassio monobasico, acetiltiocolina (ioduro), 5,5'-ditiobis-(acido 2-nitrobenzoico) Pericolo: Tossicità acuta, Pericolo per la salute: tossicità d'organo, Corrosivo: lesioni oculari, irritante per la pelle, irritante per la respirazione Manipolazione sicura: lavorare in un'area ventilata, indossare guanti
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	320331	Pericolo: Corrosivo: corrode il metallo, ustiona gravemente la pelle, lesioni agli occhi, irritante per le vie respiratorie Manipolazione sicura: lavorare in un'area ventilata, indossare guanti
Azoto liquido	L'ossigeno di Robert		Azoto Pericolo: Gas compresso: Rischio di ustioni criogeniche, congelamento, soffocamento Manipolazione sicura: Lavorare in un'area ventilata, indossare guanti
Piastra rivestita IgG anti-coniglio per topi (in kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400006	Pericolo: Nessuno
Nuovo bilanciamento MF classico	Mettler Toledo
Agitatore orbitale	Stovall Life Science Inc. (ora IBI Scientific)	15-453-211 (Variabile)
Parafilm	Azienda Bemis, Inc.	3023-4526 (Variabile)
Polisorbato 20 (in kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400035	Pericolo: Nessuno
Idrossido di potassio (in kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400029	85% puro Pericolo: Corrosivo: corrode i metalli e la pelle, Danni agli occhi, Tossicità acuta Manipolazione sicura: Lavorare in un'area ventilata, indossare i guanti
Omogeneizzatore Precellys Evolution	Bertin Tecnologie	PE000062-PEVO0-A
Precellys Kit di lisi Omogeneizzazione dei tessuti duri	Bertin Tecnologie	P000911-LYSK0-A
Lettore di micropiastre Sense	HIDEX	425-301
Centrifuga Sorvall Legend Micro 17R	Thermo Fisher Scientifico	75002441
Polverizzatore per tessuti	Frantumatore di celle	Kit Cellcrusher
Genio del vortice 2	Industrie scientifiche	SI-0246
Bottiglia di lavaggio	Sigma-Aldrich	Z423092
Concentrato tampone di lavaggio 400X (in kit cGMP)	Azienda chimica delle Cayman	400062	fosfato di potassio bibasico, fosfato di potassio monobasico, acqua Pericolo: Corrosivo: Lesioni oculari, Tossicità acuta,Irritante per la pelle, Tossicità d'organo Manipolazione sicura: Lavorare in un'area ventilata, indossare guanti