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Articolo metodologico

L'ipossia altera i livelli di miRNA coinvolti nell'ereditarietà non mendeliana del disturbo dello spettro autistico nei topi

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DOI:

10.3791/68435

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11 luglio 2025

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1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'ipossia nei topi neonatali somministrandoli in ambienti controllati con concentrazioni di ossigeno variabili. I modelli murini sottoposti a variazioni di ossigeno alla nascita hanno variato durevolmente l'espressione dei miRNA coinvolti nell'induzione di cambiamenti fenotipici comportamentali come l'autismo.

Abstract

L'ipossia può verificarsi in varia misura per diversi motivi durante il periodo perinatale, influenzando lo sviluppo. Il nostro obiettivo è quello di esaminare le conseguenze dell'ipossia neonatale da lieve a grave nei topi, concentrandoci sul suo potenziale legame con le disfunzioni cerebrali fetali neurodegenerative correlate al disturbo dello spettro autistico (ASD).

Abbiamo indotto l'ipossia nei topi neonatali partorendoli in ambienti controllati con concentrazioni di ossigeno variabili. I risultati hanno mostrato livelli elevati di HIF-1α (un marcatore di ipossia) nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo, nonché un aumento della neurodegenerazione in queste regioni. Inoltre, abbiamo osservato un'espressione alterata di miRNA correlati all'ASD (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p e miR-499a-5p) in gruppi ipossici, in linea con i risultati ottenuti in precedenti modelli umani e animali di ASD. Queste alterazioni molecolari sono state accompagnate da cambiamenti comportamentali come diminuzione del movimento, della velocità, dell'interazione sociale e dei comportamenti ripetitivi, nonché da una maggiore tendenza a mostrare un comportamento di ricerca dell'angolo nei topi sottoposti a condizioni di ipossia. Sebbene i cambiamenti comportamentali e molecolari fossero rilevabili nel gruppo 12% O2 (ipossia lieve), i cambiamenti più pronunciati sono stati osservati nei gruppi ipossia più gravi, al 10% O2 e all'8% O2.

Nel complesso, i risultati suggeriscono che l'ipossia neonatale può indurre cambiamenti molecolari duraturi associati a malattie neurodegenerative con conseguenze comportamentali. Inoltre, anche in un parto normale, l'esposizione all'ipossia durante lo sviluppo precoce può compromettere la memoria e l'apprendimento. I risultati evidenziano la necessità di una diagnosi precoce e di un intervento nei neonati esposti all'ipossia per prevenire problemi neurologici a lungo termine. I livelli di miRNA sono regolati durante lo sviluppo e le loro modifiche nei tessuti, in particolare nelle cellule germinali, costituiscono un fattore di rischio per la generazione successiva. Le analisi forniscono una base per lo studio delle vie regolatorie che influenzano i cambiamenti funzionali e comportamentali in ipossia.

Introduzione

Definita come uno stato di carenza di ossigeno, l'ipossia può suscitare risposte cellulari e molecolari uniche, fondamentali per comprendere il suo ruolo in varie patologie. Può interrompere le sequenze di sviluppo, portando ad alterazioni e lesioni molecolari, cellulari e neuronali. Inoltre, l'esposizione precoce all'ipossia interrompe lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC), compromettendo la connettività assonale e lo sviluppo delle sinapsi1.

Inoltre, sebbene sia stato dimostrato che l'ipossia ha effetti negativi sullo sviluppo del SNC, può anche svolgere un ruolo fisiologico critico in condizioni specifiche, come durante l'embriogenesi. L'ipossia fisiologica normale si riferisce a una situazione in cui i livelli di ossigeno sono naturalmente bassi durante lo sviluppo embrionale in modo benefico. Questo processo consente alle cellule embrionali di produrre energia promuovendo il metabolismo anaerobico, supporta lo sviluppo del sistema circolatorio accelerando la vascolarizzazione, garantisce il corretto sviluppo del cuore e delle ossa e stimola la migrazione delle cellule della cresta neurale2. Al contrario, l'ipossia che si verifica al di fuori del suo contesto fisiologico può avere effetti negativi sullo sviluppo e sulla salute generale, compreso lo sviluppo embrionale, che può portare alla prematurità o addirittura alla letalità embrionale1. Si tratta, quindi, di un grave problema di salute pubblica, poiché molti neonati sperimentano condizioni di ipossia durante il parto normale, spesso senza un riconoscimento immediato da parte degli operatori sanitari o del personale medico3. Inoltre, le alternanze nella connettività neuronale associate all'ipossia sono legate a disturbi dello sviluppo neurologico, inclusi i disturbi dello spettro autistico (ASD) e le disabilità intellettive1.

Da un punto di vista molecolare, l'ipossia può influenzare il neurosviluppo alterando l'espressione dei geni che regolano le funzioni sinaptiche, interrompendo così la connettività neuronale e contribuendo allo sviluppo di disturbi del neurosviluppo4.

Clinicamente, l'ipossia neonatale influisce sullo sviluppo del SNC attraverso le vie ormonali e metaboliche1. In risposta all'ipossia acuta, l'ipotalamo rilascia rapidamente l'ormone di rilascio della corticotropina e l'arginina vasopressina, che quindi innesca il rilascio dell'ormone adrenocorticotropo dall'ipofisi anteriore, seguito dalla produzione di glucocorticoidi nella corteccia surrenale fetale e il grado di questa risposta è correlato con l'intensità e la durata dell'ipossia. Questa rapida risposta dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) allo stress acuto sottolinea il ruolo critico dei glucocorticoidi nel limitare gli impatti fisiologici dello stress e nel mantenere l'omeostasi fetale influenzando l'espressione genica associata, la sintesi proteica e il metabolismo cellulare 5,6.

La diminuzione dei normali livelli di ossigeno attiva varie risposte all'ipossia, la maggior parte delle quali sono regolate da fattori di trascrizione, fattori inducibili dall'ipossia (HIF) e sensori cellulari di ossigeno come le prolil idrossilasi (PHD)1. HIF-1, un regolatore dell'omeostasi dell'O2 come dimostrato negli studi in vitro 7, è un eterodimero composto da HIF-1α e HIF-1β8. In condizioni di ipossia, la sostituzione dell'atomo di idrogeno con un gruppo ossidrile nel complesso è ridotta, portando all'accumulo di HIF-1α, che poi dimerizza con HIF-1β. Di conseguenza, il dimero HIF-1 trasloca nel nucleo, dove attiva la trascrizione di centinaia di geni1.

La natura dipendente dall'ossigeno dei neuroni li rende particolarmente suscettibili allo stress ipossico. Pertanto, l'ipossia può avere un impatto significativo sulla fisiologia cerebrale, con implicazioni a lungo termine sulla funzione neuronale, compromettendo il pathfinding assonale e lo sviluppo delle sinapsi9. Queste alterazioni delle connessioni neuronali possono predisporre a vari disturbi dello sviluppo neurologico come ASD e disabilità intellettiva 9,10.

L'asfissia perinatale è definita come privazione di ossigeno durante il travaglio e può verificarsi a seguito di eventi perinatali come emorragia materno-fetale, compressione del cordone ombelicale, complicanze placentari, rottura uterina, distocia della spalla o incapacità del neonato di fare il primo respiro. Questo grave evento colpisce circa quattro milioni di neonati in tutto il mondo ogni anno e provoca un milione di morti neonatali 11,12,13. Sebbene la maggior parte dei neonati sopravviva a episodi di ipossia, alcuni pazienti sviluppano encefalopatia ipossico-ischemica, che può portare a problemi neurologici permanenti come disturbi convulsivi, paralisi cerebrale, ritardi cognitivi e deficit motori. Inoltre, l'asfissia e l'ischemia possono causare disfunzioni di vari organi e sistemi come il sistema nervoso centrale (28%), il sistema cardiovascolare (25%), i reni (50%) e i polmoni (23%)11.

Inoltre, l'immaturità del sistema vascolare cerebrale e la scarsa autoregolazione sono fattori che predispongono i neonati ai rischi ischemici. In tali processi, l'infiammazione e lo stress ossidativo sono i principali mediatori del danno ipossico-ischemico neonatale e dei meccanismi di morte cellulare associati. L'apoptosi anomala può esporre il cervello in via di sviluppo a rischi di disturbi motori e cognitivi14.

Data la complessità dell'ASD, è essenziale comprendere la genetica sottostante che sembra avere una struttura poligenica, nonché i fattori ambientali che ne determinano lo sviluppo. In particolare, le basi poligeniche dell'ASD implicano un'eziologia multifattoriale, in cui le predisposizioni genetiche interagiscono con fattori esterni, tra cui l'ipossia. La concordanza del 60%-92% osservata nei gemelli monozigoti evidenzia l'importanza delle influenze genetiche, mentre la discordanza indica che anche i fattori ambientali giocano un ruolo. La prevalenza dell'autismo è stimata in 13/10.000 e si ritiene che questo tasso sia aumentato negli ultimi anni15. Gli studi supportano l'ipotesi che l'esposizione a fattori ambientali durante la gravidanza possa aumentare il rischio di autismo, ma i risultati di questi studi sono spesso incoerenti a causa delle differenze nei criteri diagnostici, nei gruppi di confronto, nella dimensione del campione e nei metodi di valutazione dell'esposizione15,16.

Sebbene i risultati neuropatologici distintivi non siano chiari, gli studi rivelano anomalie cerebrali microscopiche e funzionali. Queste anomalie suggeriscono che il periodo eziologicamente rilevante può essere in utero e che la patogenesi può iniziare durante il periodo prenatale15. Le esposizioni durante la gravidanza sono l'obiettivo principale della ricerca epidemiologica sui potenziali fattori di rischio per l'autismo. In particolare, l'ipotesi che le complicanze ostetriche possano aumentare il rischio di ASD è supportata da molti studi, ma l'entità e le conseguenze di questi effetti variano tra gli studi17.

Oltre ai fattori genetici, i meccanismi epigenetici svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell'espressione genica in condizioni di ipossia. In particolare, i miRNA presentano un meccanismo di regolazione chiave nella risposta cellulare all'ipossia, come il loro impatto sull'HIF. Durante le prime fasi dell'ipossia, cambiamenti specifici nei livelli di miRNA possono contribuire all'accumulo di HIF-1 e al mantenimento di livelli stabili di HIF-2 e HIF-318. Sebbene il profilo di espressione di molti miRNA sia alterato in condizioni di ipossia e ischemia, è stato dimostrato che un numero limitato di miRNA associati all'ipossia svolge un ruolo funzionale e influenza l'espressione di HIF . Questo spiega perché diversi tessuti umani differiscono nelle risposte ipossiche a causa dell'espressione tessuto-specifica del miRNA18.

Dati emergenti indicano anche che specifici miRNA sono stati implicati nella patologia dell'ASD. Nel nostro lavoro precedente, abbiamo dimostrato che miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p e miR-499a-5p, che sono noti per regolare la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e le risposte allo stress nel cancro, mostrano un'espressione aberrante nei pazienti con ASD, influenzando potenzialmente gli esiti dello sviluppo neurologico. Abbiamo poi confermato questi risultati in campioni di sangue, ipotalamo e sperma da modelli murini di ASD, mostrando un'associazione coerente di cambiamenti regolatori genici con la malattia19. Questi risultati indicano che la sottoregolazione di questi miRNA in fasi cruciali della crescita e dello sviluppo può avere un impatto significativo sullo sviluppo di malattie come l'ASD. Ciò dimostra ulteriormente la profonda influenza dell'ipossia neonatale sulle caratteristiche molecolari e comportamentali.

In questo studio, abbiamo testato l'impatto dell'ipossia neonatale da lieve a moderata sul rischio di sviluppare l'autismo in età adulta. Per fare ciò, i topi neonati sono stati esposti a diversi livelli di ipossia. Infatti, i topi che hanno sperimentato l'ipossia alla nascita mostrano cambiamenti comportamentali in età adulta e, soprattutto, a livello molecolare, alterazioni associate all'ASD. Pertanto, i nostri risultati hanno fornito preziose informazioni sugli effetti a lungo termine dell'ipossia.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Etico Locale per gli Esperimenti Animali dell'Università di Erciyes (HAYDEK) ed eseguiti con il numero di licenza 21/216.

1. Soggetti animali

NOTA: Questo studio ha coinvolto topi Balb/c dell'unità transgenica del Betül-Ziya EREN Genome and Stem Cell Center (GENKÖK) dell'Università di Erciyes.

  1. Utilizzare topi Balb/c di 2 mesi con un peso medio di 18-25 g. Mantenere i topi a una temperatura di 20 ± 2°C, con un'umidità del 52 ± 3% in un ciclo luce/buio di 12 ore (6-18 ore).
  2. Nutri i topi con pellet per topi standard, con cambi di lettiera settimanali e consenti l'accesso illimitato a cibo e acqua.
    NOTA: Gli studi molecolari sono stati eseguiti nei laboratori di genomica e ipossia del GENKÖK e nel laboratorio di istologia ed embriologia dell'Università di Bozok. Un "punto di arresto" indica il punto in cui è possibile mettere in pausa e conservare il lavoro alla temperatura specificata.

2. Istituzione del modello di ipossia

  1. Progetta l'esperimento in modo da includere 4 gruppi, inclusi 3 ipossici e 1 gruppo di controllo fittizio.
  2. Accoppiare topi femmine sane con topi maschi sani per formare topi femmine gravide sane, che alla fine saranno classificati nei seguenti gruppi: ipossia grave (8% O2) (n = 4), ipossia moderata (10% O2) (n = 4), ipossia lieve (12% O2) (n = 4) e normossia (21% O2) come gruppo di controllo fittizio (n = 4).
  3. Per indurre l'ipossia, trasferire le tope gravide al laboratorio di ipossia e iniziare a monitorarle 72 ore prima del giorno E21.5.
  4. Rilevare il punto di parto delle tope gravide nei gruppi ipossici e posizionarle immediatamente nelle camere di ipossia. Regolare i livelli di ossigeno per ciascuna camera come descritto per ciascun gruppo (mostrato al punto 2.2.).
  5. Tenere i neonati in condizioni di ipossia solo per 5 minuti, quindi trasferirli immediatamente in condizioni di stabulazione normali.
    NOTA: Mantenere i soggetti in condizioni di ipossia per periodi più lunghi può provocare letalità.
  6. Usa 2 neonati (scelti casualmente) da ogni gruppo per confermare il danno indotto dall'ipossia e determinare il sesso. Tenere i cuccioli rimanenti accanto alle loro madri in condizioni di stabulazione normali fino alla fine del periodo di lattazione per ulteriori test molecolari e comportamentali per la fase adulta (vedere il disegno sperimentale nella Figura 1 supplementare).

3. Determinazione del sesso per valutare le potenziali differenze negli effetti ipossici tra i generi nella fase neonatale

  1. Pesare individualmente ogni topo (selezionato casualmente (x2/gruppo)) per calcolare il dosaggio richiesto di anestetici. Somministrare ketamina a 100 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg per via intraperitoneale.
  2. Una volta che il topo è completamente anestetizzato, procedere con l'eutanasia tramite lussazione cervicale e raccogliere immediatamente i tessuti della coda in provette da 1,5 ml etichettate sterili (un punto di STOP, -80 °C)
  3. Raccogliere e trasferire immediatamente tutti i tessuti cerebrali in provette da centrifuga contenenti il 10% di formaldeide per ulteriori analisi (un punto di STOP, 25 °C).
  4. Preparare i tessuti per l'estrazione del DNA.
    1. Preparare i campioni di coda e scongelarli a 25 °C (se necessario). Aggiungere ai campioni 300 μl di tampone di lisi contenente 1 M Tris, 0,5 M EDTA, 4% SDS, dH2O e proteinasi K.
  5. Omogeneizzare i campioni.
    1. Mescolare accuratamente i campioni mediante vortice e incubare per una notte a 55 °C.
    2. Il giorno successivo, aggiungere 100 μl di acetato di ammonio e mescolare brevemente a vortici. Centrifugare a 12.000 g per 20 min a 25 °C
  6. Eseguire la separazione di fase .
    1. Trasferire con cura la fase acquosa limpida in nuove provette sterili da 1,5 mL etichettate.
    2. Aggiungere 500 μl di isopropanolo e incubare per 5 minuti a 25 °C (un punto di STOP, -20 °C). Centrifugare a 12.000 g per 10 min a 25 °C
  7. Lavare il pellet di DNA.
    1. Dopo aver ispezionato il pellet sul fondo del tubo, scartare con cura il surnatante.
    2. Aggiungere 1000 μl di etanolo al 70% e picchiettare delicatamente la provetta per far galleggiare il pellet. Centrifugare a 7500 g per 10 min a 25 °C
  8. Purificare il DNA.
    1. Dopo aver ispezionato il pellet sul fondo del tubo, scartare con cura il surnatante.
    2. Utilizzare una micropipetta da 10 μl per rimuovere l'etanolo residuo e lasciarlo asciugare completamente.
    3. Aggiungere 100 μl di acqua priva di nucleasi (NFW) per risospendere il pellet. Incubare a +4 °C per 10-15 min.
  9. Quantificare e conservare il DNA.
    1. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro. Conservare i campioni di DNA a +4 °C fino a nuovo utilizzo. (un punto di STOP).
  10. Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR).
    1. Progettare gli inneschi SRY-F, SRY-R e PAX6-F, PAX6-R indiretti (vedere la Tabella supplementare 1).
    2. Preparare una miscela per PCR come segue (per campione): 5 μL di tampone PCR (10x), 4 μL di MgCl2, 4 μL di dNTP, 0,5 μL di ciascuno dei quattro primer, 31 μL di dH2O e 0,5 μL di Taq polimerasi.
      NOTA: La Taq polimerasi deve essere aggiunta per ultima e appena prima dell'uso per garantire un'amplificazione ottimale.
    3. Preparare le provette PCR etichettate e posizionarle su una griglia di raffreddamento a +4 °C. Distribuire 45 μl della miscela nelle provette.
    4. Picchiettare delicatamente il blocco per assicurarsi che le goccioline di miscela PCR si trovino sul fondo della provetta.
    5. Aggiungere 5 μl di campioni di DNA e pipettare brevemente. Agitare brevemente e poi centrifugare le provette.
    6. Posizionare le provette nella macchina PCR e impostare il programma sulle seguenti condizioni: Inizialmente, incubazione a 95 °C per 5 min, 40 cicli di denaturazione a 94 °C per 1 min, ricottura a 57 °C per 45 s e prolungamento a 72 °C per 1 min. Dopo i cicli, un'ultima estensione a 72 °C per 10 minuti, seguita da una tenuta a 40 °C a tempo indeterminato.
  11. Visualizzare i campioni dei risultati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio al 2%.
    NOTA: I campioni che mostrano due bande sono maschi e quelli con una sola banda sono femmine.

4. Conferma del danno da ipossia nei topi neonati

  1. Valutare al microscopio i tessuti cerebrali raccolti da topi sacrificati per confermare il danno ipossico ed esaminare immunoistochimicamente per testare HIF-1α.
    1. Fissare e la paraffina incorporano il tessuto.
      1. Conservare i fazzoletti in formaldeide per 12 ore, quindi lavare in acqua per 6 ore.
      2. Fissare i tessuti disidratando in serie di alcol etilico per 1 giorno per ogni concentrazione: 70%, 80%, 90%, poi 3 ore in alcool etilico al 100%. Metti i fazzoletti nello xilene per 15 minuti per pulirli.
      3. Trasferire i tessuti alle serie di paraffina I, II e III per 1 ora ciascuno. Dopo la terza ora, orientare correttamente i campioni di cervello e incorporarli in paraffina pulita.
      4. Utilizzando un microtomo rotante, tagliare sezioni spesse 5 μm dai blocchi di paraffina.
    2. Prepara le diapositive.
      1. Per la colorazione con ematossilina ed eosina (HE), posizionare le sezioni su vetrini di vetro liscio.
      2. Per l'immunoistochimica, posizionare le sezioni su vetrini caricati positivamente.
        NOTA: (un punto di STOP), le diapositive possono essere archiviate in questa fase per ulteriori valutazioni e lavoro.
    3. Eseguire la colorazione HE.
      1. Immergere i campioni nella soluzione di xilene I per 10 minuti.
      2. Immergere i campioni nella soluzione di xilene II per altri 10 minuti.
      3. Trasferire i campioni a una serie di concentrazioni di alcol decrescenti, ciascuna per 1 minuto: 100%, 96% e 80%.
      4. Lavare i campioni con acqua distillata per 2 minuti.
      5. Immergere i campioni in ematossilina per 8 minuti, quindi lavarli in acqua distillata per 2 minuti.
      6. Dopo il lavaggio, trattare i campioni con alcol acido per 1 s, seguito da un lavaggio di 1 minuto.
      7. Immergere i campioni in acqua ammoniacale per 10 s, quindi ripetere il lavaggio di 1 minuto.
      8. Porre i campioni in alcool al 70% per 30 s.
      9. Immergere i campioni nell'eosina per 10 minuti.
      10. Trasferire gradualmente i campioni aumentando le concentrazioni di alcol per 1 minuto ciascuno: 96%, 96% e 100%.
      11. Immergere i campioni nelle soluzioni di xilene I, xilene II e xilene III per 1 minuto ciascuna.
      12. Coprire con un vetrino coprioggetti.
    4. Esamina usando un microscopio.
      1. Dopo la colorazione HE, esaminare l'intero tessuto cerebrale di ciascun gruppo al microscopio ottico.
      2. Valutare le aree ippocampali e corticali per la degenerazione neuronale e l'edema pericellulare/perivascolare.
  2. Eseguire la colorazione HIF-1α.
    1. Incubare i campioni su vetrini caricati positivamente per una notte a 67 °C in un incubatore per garantire un'adeguata fissazione.
    2. Far passare le sezioni attraverso le soluzioni di xilene I e xilene II per completare la deparaffinazione.
    3. Reidratare le sezioni mettendole in sequenza in soluzioni di etanolo al 100%, 96%, 80% e 70% per 5 minuti ciascuna, quindi risciacquare in acqua distillata per 5 minuti.
    4. Smascherare gli epitopi cuocendo al microonde sezioni in acido citrico 0,01 M (pH 6,0) a 665 W per due cicli di 5 minuti.
    5. Raffreddare le sezioni a temperatura ambiente (RT) per 20 min.
    6. Delineare il perimetro delle sezioni con una penna idrofoba, quindi lavare le sezioni 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuna.
    7. Incubare le sezioni in perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 10 minuti per bloccare l'attività endogena della perossidasi.
    8. Lavare nuovamente le sezioni 3 volte in PBS per 5 minuti ogni volta.
    9. Per prevenire il legame non specifico delle immunoglobuline, incubare le sezioni con un reagente che blocca i raggi UV per 7 minuti.
    10. Incubare le sezioni per una notte a 4 °C con l'anticorpo primario anti-HIF-1α (diluizione 1:200).
    11. Lavare le sezioni 3 volte in PBS per 5 minuti ogni volta.
    12. Applicare l'anticorpo secondario biotinilato alle sezioni e incubare a RT per 40 minuti.
    13. Lavare nuovamente le sezioni 3 volte in PBS per 5 minuti ogni volta.
    14. Applicare la soluzione di streptavidina sulle sezioni e incubare per 30 minuti a RT.
    15. Lavare le sezioni 3 volte in PBS per 5 minuti ogni volta.
    16. Sviluppare la reazione di colorazione applicando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e osservando al microscopio ottico.
    17. Controcolorare le sezioni con una soluzione modificata di ematossilina di Gill II per colorare i nuclei.
    18. Disidratare le sezioni facendole passare attraverso concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 96% e 100% di etanolo).
    19. Eliminare le sezioni incubandole nelle soluzioni di xilene I e xilene II per 10 minuti ciascuna.
    20. Montare le sezioni con un mezzo di montaggio e un vetrino coprioggetti.
    21. Esaminare le sezioni montate al microscopio ottico e valutare le aree dell'ippocampo e della corteccia prefrontale.
    22. Misura i livelli di immunoreattività utilizzando un software di elaborazione delle immagini open source.

5. Esperimenti comportamentali

  1. Dopo la conferma dell'ipossia, consentire ai topi rimanenti di completare il periodo di allattamento con le loro madri.
  2. Esegui la determinazione del sesso il giorno 21 postnatale in base alla distanza anogenitale, quindi alloggia gli animali in gabbie diverse in base al loro sesso. Quando i topi nei gruppi di controllo ipossici e fittizi raggiungono i 2 mesi di età, sottoporli a esperimenti comportamentali.
  3. Prima di eseguire i test comportamentali, acclimatare i soggetti all'ambiente di test per 15-30 minuti prima del test.
  4. Assicurarsi di disinfettare tutti i dispositivi/apparecchiature tra i soggetti e le prove utilizzando il 70% di etanolo.
  5. Eseguire il test di riconoscimento di nuovi oggetti (NOR).
    1. Posizionare la fotocamera in una posizione in cui i soggetti possano essere visti e monitorati chiaramente.
    2. Installa un software di tracciamento video appropriato.
    3. Prepara l'arena di prova (una scatola da 60 cm × 60 × cm × 40 cm) con due oggetti non più grandi del mouse. Assicurarsi che i due oggetti siano di dimensioni e forma simili e facilmente accessibili (10 cm × 10 cm di distanza dalle pareti e paralleli).
    4. Giorno 1: Fase di familiarizzazione:
      1. Posiziona il mouse nell'arena con i due oggetti identici. Consenti al mouse di esplorare liberamente gli oggetti per un determinato periodo di tempo (ad esempio, 10 minuti).
      2. Durante questa sessione, osservare e registrare la quantità di tempo che il mouse ha trascorso con ciascun oggetto. Inoltre, registra il numero di volte in cui il mouse si è girato o ha interagito con ciascun oggetto
    5. Giorno 2: Introduzione al nuovo oggetto:
      1. Sostituisci uno degli oggetti familiari del giorno 1 con un nuovo oggetto (diverso per aspetto, consistenza o forma).
      2. Riporta il mouse nell'arena, permettendogli di esplorare di nuovo liberamente per lo stesso tempo della prima sessione.
    6. Registra il tempo totale che il mouse ha trascorso con l'oggetto familiare (dal giorno 1) e il nuovo oggetto. Registra il numero di volte in cui il mouse si è girato o ha interagito con ciascun oggetto.
    7. Calcola l'indice di discriminazione (DI) per valutare la memoria e l'apprendimento del topo utilizzando la formula:
      Indice di discriminazione (DI) = {(Tempo trascorso con un oggetto nuovo − Tempo trascorso con un oggetto familiare)/(Tempo totale trascorso con entrambi gli oggetti)} × 100.
      NOTA: Un DI più alto indica un maggiore interesse per il nuovo oggetto, suggerendo una migliore memoria e capacità di apprendimento. Una DI vicina a 0 non indica alcuna preferenza, suggerendo uguale interesse o una scarsa memoria per l'oggetto familiare.
    8. Usa l'DI per valutare oggettivamente le capacità di apprendimento e memoria del topo, in base alla sua naturale curiosità e capacità di riconoscere e distinguere tra oggetti familiari e nuovi.
  6. Eseguire il test della sospensione della coda (TST)
    1. Installare la telecamera in una posizione in cui i mouse siano chiaramente visibili e possano essere monitorati. Installa un software di tracciamento video appropriato.
    2. Prepara la configurazione sperimentale con spazio per ospitare 3 topi contemporaneamente.
    3. Utilizzare pannelli di cartone alti 25 cm con intervalli di 20 cm per isolare i topi in modo che non possano vedersi durante il test.
    4. Taglia strisce di nastro adesivo lunghe 12 cm e attaccale con cura alla coda di ogni topo, assicurandoti che la coda sia fissata saldamente senza causare danni. Posizionare il nastro all'estremità della coda (2 cm) in modo che il mouse possa essere sospeso senza ferirsi.
    5. Registra i mouse per 6 minuti mentre sono sospesi.
    6. Al termine della durata, interrompere la registrazione, rimuovere il mouse e rimetterlo nella gabbia dell'alloggiamento. Analizza i video per determinare la durata del movimento attivo e la durata dell'immobilità.
      NOTA: Questo fornirà informazioni sulla risposta allo stress, poiché l'immobilità spesso indica uno stato di impotenza o stress appreso. Il grado di immobilità è comunemente usato per misurare la disperazione comportamentale o la risposta allo stress nei topi, che può essere correlata agli effetti dello stress o degli stati depressivi.
    7. Sulla base dei modelli di movimento e immobilità osservati, valutare lo stato emotivo e i meccanismi di coping dello stress dei topi in risposta alla sospensione forzata.
  7. Eseguire il test di interramento del marmo
    1. Riempi una gabbia vuota (20 cm × 35 cm × 15 cm) con una pannocchia di mais alta 5 cm. Disponi 20 biglie in 5 file con 4 biglie ciascuna. Assicurarsi che le biglie siano distribuite uniformemente sulla superficie.
    2. Posiziona il soggetto in un angolo della gabbia, garantendo il libero accesso a tutta la gabbia.
    3. Dai al topo 20 minuti per esplorare la gabbia. Durante questo periodo, il topo può mostrare un comportamento di seppellimento, cercando di coprire le biglie con pannocchie di mais. Dopo 20 minuti, rimuovere il mouse dalla gabbia.
    4. Conta il numero totale di biglie che il topo ha sepolto sotto la pannocchia di mais durante il periodo di 20 minuti. Registra il numero totale di biglie sepolte, poiché questa è la misura chiave del comportamento.
      NOTA: Il numero di biglie sepolte è comunemente usato come indicatore di ansia, comportamento compulsivo o neofobia nei roditori. Un numero maggiore di biglie sepolte è spesso associato a livelli più elevati di ansia o tendenze compulsive.
    5. Sulla base del numero totale di biglie sepolte, valutare i comportamenti legati all'ansia e le tendenze compulsive nei topi, che possono essere utilizzati per valutare gli effetti dei trattamenti o delle condizioni sperimentali.
  8. Eseguire il test di interazione sociale.
    1. Installare la telecamera in una posizione in cui i mouse siano chiaramente visibili e possano essere monitorati.
    2. Collegare la fotocamera al computer e configurare il software di tracciamento video appropriato. Allestisci una scatola rettangolare (60 cm × 40 cm × 25 cm) con due pareti (40 cm × 25 cm) con due porte (8 cm) per separare le tre camere.
    3. Collocare una gabbia (15 cm × 10 cm) contenente un topo familiare al soggetto dell'esperimento e un'altra gabbia (15 cm × 10 cm) contenente un topo che non ha avuto alcuna interazione precedente con il soggetto dell'esperimento.
    4. Avviare la registrazione e posizionare il soggetto nello scomparto centrale.
      NOTA: I topi utilizzati in questo test diversi dagli animali da esperimento devono essere dello stesso sesso e sani.
    5. Monitora il soggetto per 5 minuti e registralo con la videocamera. Al termine della durata, interrompere la registrazione, rimuovere il mouse e rimetterlo nella gabbia di alloggiamento.
    6. Utilizzando il software SIT, analizza il tempo di interazione sociale e le tendenze alla novità sociale dei topi e confrontali con il gruppo di controllo fittizio.
      NOTA: Più tempo dedicato ai comportamenti sociali (ad esempio, toelettatura o annusare) e meno tempo speso a evitare o mostrare aggressività possono essere interpretati come dimostrazione di un'elevata socievolezza. Evitare l'interazione, trascorrere più tempo in isolamento o mostrare una maggiore aggressività può suggerire ansia, ritiro sociale o ridotta capacità di interagire socialmente.
  9. Eseguire test in campo aperto.
    1. Posizionare la telecamera in modo che i topi possano essere visti chiaramente e monitorati. Collegare la fotocamera al computer e configurare un software di tracciamento video adatto.
    2. Allestisci l'arena di prova (una scatola da 60 cm × 60 cm × 40 cm) e dividi la scatola con linee immaginarie per creare 16 quadrati.
    3. Inizia a registrare e posiziona con cura il mouse al centro dell'arena. Osservare e registrare il comportamento del mouse per 5 minuti.
    4. Al termine della durata, interrompere la registrazione, rimuovere il mouse e rimetterlo nella gabbia dell'alloggiamento.
    5. Utilizzando il software di tracciamento, misurare i comportamenti esterni e interni di camminata, arrampicata, fuga, toelettatura, immobilità, attraversamenti totali, defecazione e minzione per valutare i livelli di ansia, attività locomotoria, esplorativa ed emotiva dei soggetti.
  10. Eseguire il test del labirinto d'acqua di Morris (MWM).
    1. Preparare il labirinto d'acqua di 120 cm di diametro e 60 cm di profondità in una posizione stabile in un laboratorio comportamentale a 23 ± 1 °C.
    2. Dividi il labirinto in quattro quadranti immaginari e appendi diversi segnali visivi (per forma e colore) al centro di ogni quadrante delle pareti del labirinto a circa 20 cm dalla base. Posizionare una piattaforma di 17 cm di lunghezza e 10 cm di diametro a 20 cm dalla parete.
      NOTA: Il labirinto, le stecche e la piattaforma non devono cambiare posizione o posizione in modo che i topi possano allenare accuratamente la loro memoria.
    3. Riempire il labirinto con acqua a 21-26 °C fino a 1 cm sotto la piattaforma e colorarlo con un colorante acrilico multisuperficie nero.
      NOTA: Nel caso in cui si utilizzino altri ceppi di topi, l'acqua deve essere colorata con un colore di contrasto dei topi per poterli monitorare.
    4. Posizionare la telecamera in una posizione che catturi l'intera immagine e collegarla al software MWM sul computer.
      NOTA: Il posto in piattaforma deve essere assegnato nel programma per il quinto giorno di prova.
    5. Il test dura 5 giorni con quattro prove ciascuno. Per i primi quattro giorni, iniziare la registrazione e iniziare la prova posizionando con cura il soggetto in un quadrante diverso ogni giorno, con il viso rivolto verso la parete della vasca.
    6. Assegna la posizione della piattaforma nel programma di test del giorno 5.
      NOTA: Ciò impedisce ai soggetti di formare una memoria associativa. L'attento posizionamento dei soggetti in acqua e il mantenimento della corretta temperatura è fondamentale per evitare di aggiungere stress esterni. Le prove durano 5 minuti e terminano automaticamente quando (i) viene raggiunta la piattaforma (ii) scade il limite di tempo di 5 minuti. Nel corso delle giornate, i soggetti dovrebbero imparare la posizione della piattaforma e trovarla in meno tempo.
    7. Il quinto giorno, rimuovi la piattaforma e posiziona con cura i topi in un quadrato del labirinto come descritto in precedenza.
      NOTA: La versione di prova termina automaticamente quando (i) il mouse trova e mette piede sulla piattaforma, (ii) scade il limite di tempo di 5 minuti. I soggetti sani dovrebbero trovare la posizione della piattaforma precedente. Il software calcolerà automaticamente il tempo impiegato dal mouse per trovare la piattaforma in ogni prova e aiuterà a valutare la memoria a breve e lungo termine e le capacità di apprendimento dei soggetti.

6. Conferma del danno da ipossia per topi adulti

  1. Dopo aver completato il test comportamentale, sacrificare i soggetti mediante lussazione cervicale.
  2. Raccogliere campioni di tessuto e sangue ippocampale da 6 topi di ciascun gruppo, incluso il gruppo di controllo fittizio, per l'analisi molecolare (sezione 7).
  3. Posizionare il cervello dei restanti 4 topi in una soluzione di formaldeide al 10% per esaminare gli effetti dell'esposizione all'ipossia durante il periodo neonatale sulla morfologia del cervello adulto.
  4. Utilizzare la stessa tecnica precedentemente spiegata nel paragrafo 4 per condurre l'analisi istologica del cervello di topo adulto.

7. Isolamento dell'RNA totale da campioni di fase adulti

  1. Aggiungere 500 μL di trizol a ciascun campione di tessuto e 500 μL di sangue.
  2. Per il tessuto cerebrale, omogeneizzare i campioni utilizzando una siringa.
  3. Incubare la miscela a RT per 5 minuti.
  4. Aggiungere 200 μl di cloroformio a ciascuna provetta e incubare per altri 5 minuti a RT.
  5. Centrifugare a 12.000 g per 20 min a +4 °C.
  6. Trasferire con cautela la fase acquosa (RNA) in una nuova provetta sterile.
  7. Aggiungere isopropanolo (rapporto 1:1 con la fase acquosa) e incubare la miscela per una notte. (un punto di STOP/ -20 °C).
  8. Il giorno successivo, centrifugare a 12.000 g per 10 min a +4 °C.
  9. Scartare con cautela il surnatante e aggiungere 1000 μl di etanolo al 75% al pellet.
  10. Centrifugare a 7.500 × g per 5 min a +4 °C.
  11. Ripetere due volte la fase di lavaggio con etanolo.
    NOTA: Se il pellet è troppo piccolo, è sufficiente un lavaggio.
  12. Scartare il surnatante e lasciare asciugare il pellet all'aria a RT.
  13. Una volta completamente asciutto, risospendere il pellet con 50 μL di NFW e incubare su ghiaccio a +4 °C per 10-15 min.
  14. Misurare la concentrazione di RNA spettrofotometricamente.
  15. Conservare i campioni di RNA a -80 °C fino a ulteriori analisi.

8. Sintesi del DNA complementare (cDNA)

  1. Lavorando su un rack di raffreddamento a +4 °C, preparare i campioni di RNA isolati dal sangue e dai tessuti cerebrali.
  2. Preparare le provette PCR etichettate.
  3. Miscelare i reagenti del kit di sintesi del cDNA secondo le istruzioni del produttore.
  4. Preparare un totale di 14 μl della miscela di reazione per ogni campione e distribuirla nelle provette.
  5. Aggiungere 6 μL di campione di RNA alla miscela.
  6. Eseguire la sintesi del cDNA nel dispositivo PCR seguendo le condizioni di temperatura e tempo specificate dal produttore.
    NOTA: Il cDNA sintetizzato in questa fase può essere conservato a -80 °C fino a un nuovo utilizzo.
  7. Diluire il cDNA sintetizzato in un rapporto di 1:5.
  8. Conservare il cDNA diluito a -80 °C per future analisi qPCR.

9. PCR quantitativa in tempo reale per l'espressione di miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p e U6 small nuclear RNA come controllo di normalizzazione)

  1. Progettare i primer per ogni miRNA (vedere la Tabella supplementare 2 per le sequenze).
  2. Preparare la miscela di reazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
  3. Erogare 14 μl della miscela di reazione in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.
  4. Aggiungere 6 μl di cDNA diluito 1:5 a ciascun pozzetto per un volume di reazione totale di 20 μl.
  5. Eseguire la PCR in doppio per ogni campione per ridurre al minimo le variazioni seguendo questo programma: denaturazione iniziale a 95 °C per 120 s, 45 cicli di denaturazione a 95 °C per 10 s, ricottura e amplificazione a 56 °C per 60 s e analisi della curva di fusione a 60 °C per 15 s, quindi a 95 °C.
  6. Analizza i risultati utilizzando i valori Ct (soglia del ciclo) e normalizza i dati utilizzando il metodo 2-ΔΔCt .

10. Analisi statistica

  1. . Valutare la normalità dei dati utilizzando istogrammi, grafici Q-Q e il test di Shapiro-Wilk per analizzare i dati di espressione dei miRNA.
    1. Se i dati sono distribuiti normalmente, utilizzare l'ANOVA unidirezionale.
    2. Se i dati non sono distribuiti normalmente, applicare il test di Kruskal-Walli, il test t di Student o il test U di Mann-Whitney.
  2. Quando si valutano le differenze di genere all'interno di ciascun gruppo, utilizzare il test t dello studente o il test U di Mann-Whitney, a seconda della distribuzione dei dati. La significatività statistica è determinata da un valore p di <0,05.
    NOTA: Tutte le analisi devono essere eseguite utilizzando un software statistico appropriato. In questo caso viene utilizzato GraphPad Prism 8.
  3. Valuta la normalità dei dati utilizzando istogrammi, grafici Q-Q e il test di Shapiro-Wilk per analizzare i risultati degli esperimenti comportamentali.
    1. Se i dati sono distribuiti normalmente, utilizzare un'ANOVA bidirezionale.
    2. Per i dati che normalmente non vengono distribuiti, eseguire il test di Kruskal-Walli, il test t di Student o il test U di Mann-Whitney.
    3. Valutare le differenze di genere all'interno di ciascun gruppo utilizzando il t-test dello studente o il test U di Mann-Whitney, a seconda della distribuzione dei dati. Anche in questo caso, considera i risultati statisticamente significativi se il valore p è < 0,05.
  4. Per le analisi immunoistochimiche, utilizzare l'ANOVA a due vie seguita dal test post-hoc di Tukey per confrontare i gruppi femminili e maschili.
  5. Per confrontare i gruppi femminili e maschili all'interno di ciascuna condizione di ipossia, utilizzare il test post-hoc di Sidak. La significatività statistica è determinata se il valore p è < 0,05.

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Risultati

In questo studio, i topi Balb/c gravidi sono stati esposti a condizioni ipossiche dell'8% O2 (grave), del 10% O2 (moderato) e del 12% O2 (lieve) durante il parto, e i topi neonati sono stati mantenuti in queste condizioni ipossiche per 5 minuti per stabilire modelli di ipossia neonatale lieve, moderata e grave. Il gruppo designato come gruppo di controllo fittizio è stato sottoposto a condizioni di nascita normossiche (21% O2), quindi ...

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Discussione

L'ipossia perinatale, uno dei principali problemi di salute neonatale, può causare cambiamenti molecolari, cellulari e neuronali interrompendo i processi critici dello sviluppo ed è stata associata a vari disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui il disturbo dello spettro autistico (ASD)1. Mentre l'ipossia grave è stata ampiamente studiata per i suoi effetti immediati, le conseguenze a lungo termine dell'ipossia da lieve a moderata durante il periodo perinatale...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato dal Consiglio per la ricerca scientifica e tecnologica della Turchia (TÜBİTAK) e gli autori ringraziano Celalettin Göktaş (Struttura per animali transgenici) e la biologa Selda Taşdemir (Laboratorio comportamentale).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(-20 ° C) FreezerSiemens KD86NAWE0N
(+4 ° C) BloccoBioscienze Antagenhttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 ° C) FrigoriferoSiemens KD86NAWE0N
(-20 ° C) BloccoCleaver Sientifichttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Etanolo AssolutoMerck1070172511
Acetato di ammonioSigma238074-500G
Bilanciamento Analitico  Adam EquipmentLAB214i
CloroformioMerck1024451000
Acido Citrico  Merck100241
ComputerHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
EosinaMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Sistema EthovisionNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Falcon Tubes (15 mL)Isolab078.02.001
FormaldeideMerck104002
Camera di caloreSamsungSC2000
EmatossilinaMerck105175
HIF-1 e alfa; AnticorpiBiossbs-20398R 
Camere dell'ipossia BiospherixCamera A
IsoproponenteMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Gabbia del test di seppellitura in marmoVishnu & nbsp;https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Tubi microcentrifughe (1,5 mL)Greiner616201
Punte per micropipette (100 & micro; L)Greiner774353
Punte per micropipette (1000 & micro; L)Greiner778353
Micropipette (10 & micro; L)GilsonFD10001
Micropipette (100 & micro; L)GilsonFD10004
Micropipette (1000 & micro; L)GilsonFD10003
Punte per micropipette (10 & micro; L)Greiner772353
Micropipette (2 & micro; L)GilsonGFAM00064
MicroscopiaOlympusBx53
Kit RT MIRCURY LNA (Kit di sintesi cDNA)Qiagen339340
Kit PCR verde MIRCURY LNA SYBRQiagen339346
Piastre multipozzoRoche4729692001
Nano SpettrofotometroShimadzuC101-E112
L'arena del Test Riconoscimento degli Oggetti NovelBiotecnologia Globale137
Arena del Test in campo apertoBiotecnologia Globale117
Oxycycler BiospherixA42OC
Paraffina Leica 39602012
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
Dispositivo PCRSensoquestT3-0140
Rotazione a piastraPeqlab91-PSPIN-P
PrismaGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Proteinasi KSigmaP6556-10MG
Reagente di isolamento del reagente di lisi QIAzolQiagen79306
SDSSigma8170342500
Anticorpi secondi & nbsp;AbcamA0545-1ML
Le tre camere del Test di Interazione SocialeBiotecnologia Globale118
SpinGilsonPMC880
Siringa (2 mL)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Configurazione del test della sospensione posterioreSelf Made, puoi trovare qualcosa di simile su Harvard ApparatusSelf Made, puoi trovarlo simile su (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
TermomiscelatoreEppendorf#5355
Base TrizmaSigma1503-1KG
VorticeHeidolph541-10000-00-1
Xileni Isolab 9,90,01,92,501

Riferimenti

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