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Articolo metodologico

Gestione post-trapianto di fegato e raccolta di campioni negli scoiattoli terrestri di Dauria per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

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DOI:

10.3791/68443

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16 settembre 2025

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le procedure per la conservazione a freddo estesa del fegato e il trapianto ortotopico nello scoiattolo terrestre di Dauria (DGS; Spermophilus dauricus), un tipico ibernatore stagionale. Include metodi per la raccolta di innesti epatici e campioni di sangue per valutazioni prognostiche e la loro elaborazione per studi basati su singole cellule.

Abstract

Il recupero funzionale del trapianto e l'immunocompatibilità trapianto-ospite rappresentano i principali problemi prognostici dopo il trapianto di fegato. Criticamente, i modelli convenzionali di roditori che utilizzano ratti o topi offrono una visione limitata dei meccanismi delle lesioni da trapianto indotte dall'ipotermia durante la conservazione. Questo divario sottolinea la necessità di modelli alternativi. Poiché gli innesti di fegato dallo scoiattolo terricolo di Daurian (DGS; Spermophilus dauricus) può sostenere una conservazione prolungata del freddo e quindi supportare un'elevata sopravvivenza nei DGS post-trapianto, di conseguenza, questo protocollo descrive in dettaglio l'essenziale cura degli animali post-chirurgica e il monitoraggio fisiologico richiesto per i soggetti DGS trapiantati. Inoltre, fornisce procedure standardizzate per la preparazione di campioni di trapianto epatico di alta qualità per le tecniche analitiche a valle, tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) per la profilazione trascrittomica e l'esame istopatologico. Generare con successo campioni di innesto DGS ben preparati è il passo iniziale cruciale nell'applicazione di metodologie tradizionali e all'avanguardia per studiare questo modello non convenzionale ma altamente rilevante. Questo protocollo affronta le informazioni multi-omiche per la DGS, facilitando così la ricerca futura sugli interventi chirurgici e sulla modellazione della malattia non solo nei roditori in ibernazione ma anche in altri organismi specializzati.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, sempre più ricercatori hanno riconosciuto che le superiori capacità di adattamento delle specie in letargo offrono opportunità inestimabili per scoprire nuovi meccanismi di adattamento biologico e possono ispirare scoperte in vari campi medici come la conservazione degli organi e la riabilitazione metabolica.. Il primo protocollo chirurgico completo per la conservazione prolungata del freddo epatico e il trapianto ortotopico in un ibernatore, lo scoiattolo terricolo di Dauria (DGS; Spermophilus dauricus), è stato recentemente istituito. Apparentemente, la natura adattativa al freddo del DGS consente una conservazione a freddo prolungata degli innesti dei donatori e un'elevata sopravvivenza post-trapianto degli animali riceventi. Pertanto, è necessario un protocollo di follow-up per monitorare il recupero post-operatorio degli animali e preparare campioni per vari studi istopatologici e omici.

Date le significative differenze fisiologiche tra i DGS e i modelli standard di roditori, e i complessi e dinamici cambiamenti fisiologici post-trapianto di fegato negli animali riceventi, ottenere campioni di alta qualità da essi è fondamentale per le analisi a valle e quindi per la comprensione della fisiologia del trapianto e dell'ospite post-trapianto. Oltre all'approvvigionamento, all'elaborazione e all'esame di campioni di sangue e di tessuto epatico con metodi convenzionali, una dissociazione riuscita delle cellule parenchimali epatiche che sono epatociti e delle cellule non parenchimali (NPC) che includono cellule endoteliali, cellule stellate, cellule di Kupffer e altre cellule immunitarie consentirebbe di chiarire le complesse interazioni cellulari e molecolari post-operative con le multi-omiche basate su singole cellule in rapido sviluppo. A tal fine, il classico metodo basato sulla perfusione della collagenasi è stato sviluppato fin dai primi anni '50 e continuamente perfezionato 9,10,11. Tuttavia, la distinta struttura anatomica del fegato DGS, le aderenze post-operatorie indotte dalla ricostruzione vascolare e le alterazioni fisiologiche innescate dalla chirurgia negli innesti epatici richiedono una messa a punto delle condizioni di estrazione.

Questo protocollo fornisce una linea guida dettagliata per la gestione post-operatoria e la raccolta dei campioni nei DGS dopo il trapianto di fegato. In particolare, questo protocollo consente l'isolamento di epatociti da innesti epatici con elevata resa e vitalità cellulare e descrive in dettaglio la successiva elaborazione di epatociti isolati per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq).

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pechino (LSC-WangSQ-2). I DGS utilizzati in questo studio sono stati prodotti in laboratorio da femmine di DGS gravide catturate nella prateria della città di Zhangjiakou. Gli animali avevano circa 1-2 anni al momento dell'esperimento. I DGS, sia maschi che femmine, e di peso compreso tra 180 g e 400 g, sono stati utilizzati come donatori e riceventi. Il peso della ricevente era leggermente superiore a quello della donatrice, con una differenza inferiore a 50 g. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Assistenza post-trapianto

  1. Alloggiare i DGS post-trapianto di fegato in un ambiente caldo e pulito con un ciclo luce/buio 12:12, con cibo da laboratorio standard e acqua forniti ad libitum.
  2. Monitorare quotidianamente il peso corporeo, valutare l'incisione addominale per il sanguinamento e osservare lo stato mentale e i livelli di attività del ricevente.
  3. Immediatamente dopo l'operazione, somministrare un'iniezione sottocutanea di cefuroxima (16 mg/kg) e buprenorfina (0,05 mg/kg) ogni 12 ore per 3 giorni.
  4. Iniettare per via intramuscolare tacrolimus (1 mg/kg) al giorno fino a 24 ore prima del prelievo tissutale.
    NOTA: Poiché i DGS derivano principalmente da catture selvatiche, i fattori immunologici dei trapianti rimangono non trascurabili. Il trapianto tra DGS è considerato trapianto allogenico (non trapianto singenico). Se lo studio deve escludere fattori immunologici, come il rigetto, assicurarsi che tacrolimus sia standardizzato nel periodo post-operatorio.

2. Preparazione del campione di innesto epatico

  1. Preparazione di soluzioni e strumenti
    1. Preparare 50 mL di HBSS con 500 μM di EGTA ( Ca2+- e Mg2+--free; pH 7,4). Preriscaldare a bagnomaria a 40 °C prima dell'uso.
    2. Sciogliere la collagenasi IV (0,4 mg/mL) in 50 mL di HBSS (con Ca2+ e Mg2+) e incubare a bagnomaria a 40 °C per 30 min.
    3. Soluzione di Percoll: miscelare Percoll con 10× PBS in rapporto 9:1 (v/v) e diluire con 1× PBS in rapporto 9:1 (v/v) in una provetta da 15 ml. Mantenere la soluzione in ghiaccio.
      NOTA: 5 mL di soluzione di Percoll al 90% sono sufficienti per DGS.
    4. Immergere gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% per 30 minuti prima dell'uso.
    5. Assemblare il sistema di perfusione composto da una pompa peristaltica con velocità regolabile, tubo silastico e bagnomaria. Sciacquare il tubo con soluzione fisiologica calda per eliminare le bolle d'aria e collegare un filtro sterile da 0,22 μm all'uscita del tubo.
      NOTA: Prima di spurgare le bolle d'aria, è necessario risciacquare il tubo riutilizzato facendo scorrere accuratamente etanolo al 70% per 15 minuti, seguito da un risciacquo completo con ddH2O per 15 minuti per eliminare l'etanolo residuo.
  2. Procedura per animali
    1. Anestetizzare il DGS post-trapianto mediante iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo al 2,5% alla dose di 1 ml/100 g di peso corporeo. Eseguire test per la perdita di riflessi, come la reazione al pizzicamento delle dita dei piedi, per garantire un'anestesia completa.
    2. Radere il pelo addominale e trattenere il DGS sulla tavola chirurgica con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
    3. Spruzzare etanolo al 70% sulla zona addominale dell'animale e quindi aprire la cavità addominale praticando una grande incisione crociata della pelle e del peritoneo con forbici affilate e pinze dentate.
    4. Spostare delicatamente l'intestino verso l'esterno destro della cavità addominale con un batuffolo di cotone fino a quando l'innesto epatico, la vena porta (PV) e la vena cava inferiore (IVC) sono chiaramente esposti (Figura 1A).
      NOTA: A causa delle aderenze post-operatorie nella cavità addominale dopo il trapianto di fegato, sezionare delicatamente le aderenze utilizzando un batuffolo di cotone umido.
    5. Inserire una siringa da 5 ml nell'IVC sotto lo stoma anastomotico per raccogliere 1-2 ml di sangue e applicare immediatamente una leggera pressione sul sito di puntura con un batuffolo di cotone asciutto per ottenere l'emostasi dopo aver estratto l'ago dal vaso (Figura 1B).
      NOTA: Per ridurre al minimo il sanguinamento, l'ago può essere sostituito con uno da una siringa da 1 ml, che è di circa 30 G.
    6. Con l'orientamento smussato verso l'alto, perforare delicatamente la PV utilizzando un catetere da 22 G con un angolo di 15° rispetto alla superficie del vaso, quindi ritrarre l'ago del catetere. Una volta confermata l'avvenuta perforazione, far avanzare delicatamente la cannula di altri 1-1,5 cm attraverso il vaso. Fissare la posizione della cannula utilizzando una pinza vascolare (Figura 1C).
      NOTA: Se la cannula è posizionata correttamente, sarà visibile un riflusso di sangue. Se l'incannulamento del PV fallisce o incontra problemi tecnici, passare all'incannulamento dell'IVC infraepatico e designare il PV come via di deflusso perfusato.
    7. Avviare la pompa di perfusione con soluzione fisiologica calda a 6-8 mL/min, quindi collegare il filtro da 0,22 μm sopra menzionato alla cannula.
    8. Una volta avviata la perfusione tramite PV, praticare un'incisione nell'IVC per consentire il drenaggio del sangue. Per un'adeguata perfusione sono necessari 50-80 mL di soluzione salina (Figura 1D).
      NOTA: Il successo della perfusione è confermato quando il fegato trapiantato passa a un colore giallo-bianco pallido durante questo processo. Alcune aree di congestione rosso scuro possono rimanere sulla superficie del fegato e non possono essere completamente eliminate, probabilmente a causa di un trauma epatico intraoperatorio come il danno da ischemia-riperfusione.
    9. Dopo un'adeguata perfusione con 50-80 ml di soluzione fisiologica calda, mettere in pausa la pompa.
    10. Legare il lobo laterale sinistro alla sua base utilizzando una sutura di seta 2-0, seguita dall'escissione del lobo distalmente al sito di legatura. Allo stesso modo, il lobo mediano viene legato alla sua base e resecato utilizzando lo stesso metodo (Figura 1E, F).
      NOTA: L'epatectomia parziale viene eseguita per massimizzare l'utilizzo del fegato trapiantato per molteplici scopi sperimentali e per ridurre il consumo di tampone collagenasi, facilitando al contempo la digestione completa del fegato.
    11. Dividere il tessuto epatico resecato in più pezzi: una porzione viene utilizzata per l'isolamento dell'NPC seguita da scRNA-seq, le altre porzioni vengono fissate in paraformaldeide al 4% per il sezionamento istologico o congelate in azoto liquido per altri esperimenti.
      NOTA: Il passaggio 2.2.11 può essere eseguito da un'altra persona contemporaneamente ai passaggi successivi per risparmiare tempo.
    12. Isolamento degli NPC. Tagliare i tessuti in circa 1-2 mm3 pezzi nel terreno RPMI-1640 e digerirli enzimaticamente con gentleMACS secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). La vitalità e la concentrazione cellulare sono state determinate utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
      NOTA: Il passaggio 2.2.12 e i passaggi 2.2.13-2.3.5 procedono contemporaneamente.
    13. Tagliare il diaframma e bloccare l'IVC sopraepatico (Figura 1G).
    14. Trasferire il tubo di ingresso nel tampone EGTA preriscaldato. Riavviare la pompa a una velocità di 6-8 ml/min.
    15. Bloccare periodicamente l'IVC per 5-10 s per facilitare la distribuzione uniforme della soluzione di perfusione in tutto il parenchima epatico. Il fegato si gonfia visibilmente durante il clampaggio e si rilassa al momento del rilascio.
      NOTA: È fondamentale evitare l'interruzione prolungata del drenaggio, poiché l'ostruzione prolungata rischia di rompere il sottile tessuto connettivo che circonda il fegato, interrompendo la perfusione o la fluidodinamica nel letto capillare epatico. Inoltre, l'ostruzione prolungata può compromettere la vitalità cellulare e ridurre la resa a causa della sensibilità degli epatociti alle forze meccaniche.
    16. Dopo la perfusione con 40-50 mL di soluzione di EGTA, iniziare la perfusione del tampone collagenasi a una velocità di 4-6 mL/min per 8-10 min. Clamp brevemente il vaso sanguigno dell'effluente come nei passaggi precedenti (Figura 1H).
      NOTA: Dopo 5-6 minuti di perfusione di collagenasi, il fegato diventa notevolmente più morbido e compaiono ragadi superficiali. Se queste alterazioni morfologiche sono assenti, ridurre la velocità di perfusione a 3-4 mL/min e prolungare il tempo totale di digestione a 12-13 min. Al completamento della perfusione di 50 ml di collagenasi, il fegato mostra una consistenza friabile, simile al tofu, che è un indicatore di una digestione sufficiente (Figura 1I).
    17. Arrestare la pompa e rimuovere la cannula. Tagliare il fegato dal corpo, metterlo in un piatto di 5 cm con 10 ml di terreno DMEM/F12 ghiacciato.
  3. Purificazione degli epatociti
    1. Strappare il fegato fino a rilasciare le cellule e trasferire la soluzione cellulare in un conico da 50 ml con un filtro da 70 μm posizionato sopra.
    2. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare a 50 x g per 3 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet con 20 mL di PBS 1×. Ripeti questo passaggio 3 volte. Risospendere il pellet della cella con 5 mL di terreno DMEM/F12 dopo l'ultima centrifugazione.
    3. Miscelare delicatamente la sospensione cellulare con un volume uguale di soluzione di Percoll al 90% in una provetta da 15 mL. Centrifugare a 200 x g per 10 min a 4 °C.
      NOTA: Dopo la centrifugazione di Percoll, la miscela si separa in tre strati distinti: lo strato superiore (circa 0,5-1 mL) contiene le cellule morte, mentre gli epatociti vitali sono concentrati nello strato inferiore (circa 0,5-0,8 mL) (Figura 2). Con questo protocollo si ottiene tipicamente una resa di 5-8 × 107 epatociti vitali con vitalità del >80%. (Figura 3A, B).
    4. Aspirare con cura le cellule morte e il surnatante, evitando di disturbare vigorosamente gli strati, e risospendere le cellule vitali con 10 mL di terreno DMEM/F12. Centrifugare a 50 x g per 5 min a 4 °C.
    5. Scartare il surnatante e risospendere gli epatociti purificati con 1-5 mL di PBS 1× integrato con siero fetale bovino al 2% ad una concentrazione finale di 500-1200 cellule/μL.
    6. Mescolare gli epatociti e le NPC in un rapporto di quantità 1:1, cioè la sospensione cellulare è stata preparata mescolando 10.000 epatociti e 10.000 NPC.
  4. ScRNA-seq
    NOTA: I passaggi 2.4.1-2.4.3 sono stati eseguiti secondo la guida per l'utente del kit di preparazione della libreria di espressione genica 3' a singola cellula 3' basato su goccioline12. È stata impiegata la piattaforma di partizionamento e codifica a barre di singole cellule microfluidiche basata su goccioline, che comprende le fasi critiche della generazione di microsfere in emulsioni di gel (GEM), la costruzione della libreria di cDNA e il sequenziamento Illumina seguendo protocolli standard.
    1. Per eseguire la generazione di GEM e la codifica a barre, utilizzare una sospensione cellulare contenente 20.000 epatociti e NPC. L'efficienza di cattura delle celle non è inferiore al 60%.
    2. Per l'amplificazione del cDNA, pulire i campioni post-GEM-RT secondo la guida per l'utente12.
    3. Costruzione della biblioteca
    4. Sequenziare librerie di RNA a singola cellula utilizzando una piattaforma di sequenziamento per raggiungere una profondità di 150 Gb per campione; Demultiplexare i file di chiamata di base non elaborati in file FASTQ utilizzando Cell Ranger (v8.0.0).
    5. Allineare i file FASTQ al genoma di Ictidomys tridecemlineatus (accesso NCBI: GCF_016881025.1) per la quantificazione dell'espressione, completando il flusso di lavoro sperimentale.

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Risultati

L'esame istologico degli innesti conservati a 4 °C per 24 ore e trapiantati in DGS ha rivelato un'architettura normale del lobulo epatico con segni minimi di infiammazione, necrosi o colestasi nei giorni post-operatori 3 e 6, paragonabile al gruppo operato con sham (Figura 4A-C).

L'isolamento degli epatociti primari dal DGS post-operatorio richiede circa 1 ora. Utilizzando il protocollo descritto, si possono ottenere oltre 5 × 10<...

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Discussione

Seguendo il protocollo che descrive la conservazione e il trapianto del freddo di fegato del donatore nei DGS, le procedure qui descritte descrivono in dettaglio il monitoraggio post-operatorio e la gestione farmacologica personalizzata dei DGS trapiantati con un fegato conservato a freddo per almeno 24 ore. Questo protocollo consente la sopravvivenza del ricevente oltre i 7 giorni dopo il trapianto, mostrando chiari vantaggi degli ibernati come modelli di ricerca per la conservazione de...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dal progetto principale per le malattie croniche non trasmissibili-Scienza e tecnologia nazionale (2023ZD0507600), dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), dal programma nazionale di ricerca e sviluppo (2024YFA0916804) e dalla Zhejiang University Education Foundation Academician Shusen Lanjuan Talent Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1&volte; PBSServicebioG4202
10&volte; PBSServicebioG4207
4% ParaformaldeideBiosharpBL539A
BuprenorfinaShafeiH12020276
Cannula (22 G)BBRAUNNumero 4254090B
CefuroximaSelleckE 4838
Piatto per colture cellulari (60 mm)NIDO705001
Collagenasi IVSigma-AldrichCodice: C5138
Provetta conica (15 mL)NIDO601052
Provetta conica (50 mL)NIDO602052
Bastoncino cotonatoNegozio di articoli per la casa
Countstar Conteggio Automatico CelleRuiyuCountstar Rigel S2
DMEM/F12GibicoC11330500BT
EGTASigma-AldrichE4378
FBSGibco10099-141
Filtro (0,22 μ m)Merck MilliporeSLGP033RB
Filtro (70 μ m)Biologix15-1070
delicatoMACSMiltenyi130-093-235
HBSS (con Ca2+ e Mg2+)ServicebioG4204
HBSS (senza Ca2+ e Mg2+)ServicebioG4203
Kit di dissociazione NPCMiltenyi130-096-730
PercollCitiva17-0891-09
Pompa peristalticaYuyanBT100
RPMI-1640GibicoC11875500BT
SalinoSRBSRB009
SequenziatoreIllumina NovaSeq X Plus
Tubi SilasticTygonE-3603
Sutura in setaETHICONSA845G
Siringa (1mL)Scienza del legnoLG05-124Sarà necessario solo l'ago della siringa
Siringa (2mL)Scienza del legnoLG05-124Sarà necessario solo il barilotto della siringa
TacrolimusSelleckS5003
Pipetta di trasferimentoBiologix30-0138A1
Alcool tribromoetilicoSigma-AldrichT48402
BagnomariaConcedereSAP2

Riferimenti

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