Articolo metodologico

Conservazione a freddo e trapianto di fegato negli scoiattoli di terra di Dauria adattabili al freddo

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DOI:

10.3791/68444

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3 luglio 2025

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1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, 3NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 4Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Organ Transplantation Clinical Medical Research Center of Hubei Province, 6Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University, 7Guangdong Province engineering laboratory for transplantation medicine, Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, 8Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 9College of Life Science, Shenyang Normal University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello di conservazione a freddo e trapianto di fegato a lungo termine nello scoiattolo terricolo di Dauria (DGS), che è stato tecnicamente impegnativo nei modelli standard di roditori.

Abstract

Nel trapianto di fegato, il recupero funzionale degli innesti di donatori dopo una conservazione a freddo prolungata è una sfida importante. Lo stesso ostacolo si applica ai modelli standard di roditori (ad esempio, topi e ratti) per il trapianto di fegato nonostante i loro protocolli chirurgici ben consolidati, limitando così la ricerca su argomenti chiave come il recupero funzionale post-trapianto e l'immunocompatibilità ospite-trapianto. Qui, abbiamo stabilito con successo un nuovo modello di trapianto di fegato utilizzando un ibernatore obbligato, lo scoiattolo terricolo di Dauria (DGS; Spermophilus dauricus), che dimostra un adattamento intrinseco alle transizioni ultra profonde di ipotermia-riscaldamento e ischemia-riperfusione. Nelle nostre mani, il trapianto di innesti epatici dopo 24 ore di conservazione a freddo ha portato a una sopravvivenza del 100% dei riceventi DGS entro il periodo di osservazione di 7 giorni, mentre la stessa procedura nei ratti Sprague-Dawley (SD) ha avuto una sopravvivenza dello 0% 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Pertanto, il DGS e altri modelli di mammiferi adattabili al freddo forniscono una piattaforma unica e robusta per studiare i meccanismi alla base dell'adattamento al freddo degli organi e della tolleranza al trapianto, che possono supportare lo sviluppo di nuove strategie di trattamento o chirurgia nel campo della medicina dei trapianti.

Introduzione

Il riscaldamento a freddo e l'ischemia-riperfusione contribuiscono in modo significativo al danno da trapianto epatico, aumentando il rischio di disfunzione precoce dell'allotrapianto. Sebbene il trapianto di fegato in organismi roditori standard come topi e ratti sia stato stabilito con successo 1,2, poiché gli studi su queste specie intolleranti al freddo forniscono informazioni limitate sui meccanismi di adattamento al freddo, i progressi nella conservazione degli organi e nella medicina dei trapianti sono stati ostacolati.

Lo sviluppo di modelli di ricerca sui trapianti in specie adattabili al freddo può colmare tale lacuna. Ad esempio, i mammiferi in letargo si sono evoluti per sopravvivere a lunghi periodi di bassa temperatura ambiente e/o scarsità di cibo 3,4. Durante il letargo, la loro fisiologia passa in cicli di stati di torpore e di eccitazione interbout in modo che siano ben adattati a mantenere una bassa temperatura corporea interna e a sopportare un rapido riscaldamento e riperfusione sanguigna. Sorprendentemente, gli scoiattoli di terra che possono andare in letargo dimostrano una maggiore resilienza alle lesioni da ischemia-riperfusione anche nel loro stato attivo ed eutermico rispetto ai ratti 5,6. Negli ultimi anni, studi ispirati all'ibernazione hanno svelato alcuni meccanismi di adattamento al freddo e bersagli farmacologici che possono essere modulati per alleviare significativamente le lesioni indotte dalle celle frigorifere e migliorare il recupero funzionale di tessuti e organi isolati da specie non in letargo 7,8,9,10,11.

Adattato dai protocolli sviluppati per il trapianto di fegato nei ratti 12,13,14, qui introduciamo un protocollo per l'approvvigionamento del fegato, la conservazione a freddo statica e il trapianto nello scoiattolo terricolo di Dauria (DGS; Spermophilus dauricus), una specie di roditore in letargo che risiede nel nord della Cina. Nelle nostre mani, i riceventi di innesti DGS avevano una sopravvivenza post-trapianto del 100% con innesti da donatori eutermici (attivi) o ipotermici (torpidi) conservati a 4 °C in soluzione dell'Università del Wisconsin (UW) per 24 ore. In netto contrasto, il tasso di sopravvivenza nei ratti Sprague-Dawley (SD) sottoposti allo stesso flusso di lavoro è stato dello 0%, mostrando chiaramente il vantaggio del modello di trapianto di fegato DGS. Ci aspettiamo che la conservazione a freddo a lungo termine e il trapianto di altri organi in DGS o in altre specie adattative al freddo allevate in laboratorio, come lo scoiattolo terricolo a 13 linee (Ictidomys tridecemlineatus) e il criceto siriano (Mesocricetus auratus), possano essere raggiunti, fornendo così opportunità uniche per i ricercatori di studiare il recupero funzionale a lungo termine del trapianto e la compatibilità ospite-trapianto e testare nuovi farmaci.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pechino (LSC-WangSQ-2). Gli strumenti appropriati utilizzati per lo studio sono elencati nella Tabella dei materiali e illustrati nella Figura 1.

NOTA: La manipolazione e l'allevamento di specie di roditori in letargo catturate in natura, come gli scoiattoli di terra a 13 linee, in un ambiente di laboratorio è stata descritta15,16. I DGS utilizzati in questo studio sono stati prodotti in laboratorio da donne DGS gravide catturate nelle praterie della città di Zhangjiakou. Avevano circa 1-2 anni al momento dell'esperimento. Per quanto riguarda le femmine di DGS gravide originarie, i parassiti erano stati espulsi prima che gli animali arrivassero in laboratorio. La quarantena e l'ispezione per i virus comuni sono state condotte all'arrivo degli animali e quelli con risultati negativi al test sono stati allevati nella struttura.

1. Preparazione preoperatoria

  1. Animali da esperimento
    1. Utilizzare DGS adulti, di 1-2 anni, sia maschi che femmine, di peso compreso tra 180 g e 400 g come donatori e riceventi. Il peso della ricevente era leggermente superiore a quello della donatrice, con una differenza inferiore a 50 g.
    2. Utilizzare ratti SD adulti, di 8-10 settimane, sia maschi che femmine, del peso di 200-300 g, come donatori e riceventi nel gruppo di controllo. Durante l'intera procedura sperimentale, indossare maschere chirurgiche, camici da laboratorio e guanti in nitrile, nonché guanti di pelle extra pesanti durante la manipolazione e il trasferimento degli animali DGS.
  2. Realizzare i polsini per la vena porta (PV) e la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC) utilizzando rispettivamente guaine introduttrici 6 F e 8 F. Ogni gambetto comprendeva un corpo principale e prolunghe di 2 mm di lunghezza. Crea più scanalature attorno alla circonferenza del bracciale bloccandolo delicatamente con una pinza per zanzare (Figura 2).
    NOTA: I diametri del PV e dell'IHIVC variano in modo significativo a seconda delle dimensioni e del sesso del DGS. Pertanto, si consiglia di preparare i bracciali 5-F, 6-F, 7-F e 8-F prima dell'intervento per una selezione appropriata. In genere, un bracciale 5-F o 6-F è adatto per il PV, mentre un bracciale 7-F o 8-F è appropriato per l'IHIVC.
  3. Realizzare stent per il dotto biliare (3 mm) e l'arteria epatica (2 mm) tagliando i cateteri endovenosi da 22 G e 24 G in tubi inclinati su entrambi i lati utilizzando un bisturi.
    NOTA: Evitare di applicare una pressione eccessiva agli stent, in quanto ciò potrebbe portare al restringimento o all'occlusione del lume, compromettendo la sopravvivenza del ricevente.

2. Operazione del donatore

  1. Primi passi
    1. Utilizzare una concentrazione di isoflurano del 5% a una velocità del flusso d'aria di 1 L/min per indurre l'anestesia e del 2% a 1 L/min per il mantenimento.
    2. Posizionare il DGS in posizione supina su una tavola. Radere il pelo dalla zona addominale e sterilizzare la pelle utilizzando iodio povidone ed etanolo al 70%.
  2. Isolamento epatico prima della perfusione
    1. Praticare un'incisione crociata che si estende dal processo xifoideo alla sinfisi pubica e lateralmente alle linee medio-ascellari. Ritrarre il processo xifoideo utilizzando una pinza per zanzare e posizionare una siringa da 5 ml sotto la schiena come supporto.
    2. Sezionare il legamento falciforme. Isolare la vena diaframmatica sinistra dalla vena cava inferiore sopraepatica (SHIVC) e legarla con una sutura 7-0. Cauterizzare il legamento epato-splenico.
    3. Liberare con cura l'IHIVC sopra la vena renale destra dai tessuti circostanti utilizzando tamponi di cotone. Ligate le vene surrenaliche e lombari destre drenanti nell'IHIVC vicino al fegato con suture 7-0.
    4. Fai una piccola incisione sulla parete anteriore del dotto biliare comune (CBD). Inserire lo stent del dotto biliare e fissarlo con una sutura di seta 7-0. Lasciare un'estremità della sutura di circa 5 mm di lunghezza per facilitare la successiva anastomosi con il CBD del ricevente.
    5. Isolare l'arteria epatica corretta (PHA), l'arteria gastroduodenale (GDA) e l'arteria epatica comune (CHA) dai tessuti circostanti.
    6. Somministrare 1,5 mL di soluzione salina eparinizzata (300 UI/mL) nella vena del pene (donatori maschi) o nell'IHIVC (donatori femmine).
  3. Perfusione epatica
    1. Isolare l'aorta addominale sotto la vena renale sinistra. Inserire un ago endovenoso da 7 G nell'aorta e fissarlo con una pinza.
    2. Incidere il diaframma e posizionare un morsetto vascolare sull'aorta toracica.
    3. Perfondere il fegato attraverso la cannula aortica con 20-30 mL di soluzione fredda di UW a una velocità di 180-210 mL/h utilizzando una pompa per infusione. Incidere la vena cava intratoracica e l'IHIVC sopra la vena renale destra per consentire l'efflusso del perfusato.
      NOTA: Regolare la posizione dei lobi epatici utilizzando tamponi di cotone per garantire una perfusione uniforme, prestando particolare attenzione ai lobi medio e destro. La perfusione è completa quando l'intero fegato mostra un pallore uniforme.
    4. Durante la perfusione, asportare la cistifellea.
      NOTA: A differenza dei ratti, i DGS possiedono una cistifellea. La rimozione della cistifellea e il lavaggio dei dotti biliari con una soluzione UW sono essenziali per prevenire l'ostruzione biliare postoperatoria dovuta alla coagulazione biliare.
  4. Prelievo di innesti epatici post-perfusione
    1. Utilizzando una micro-pinza, isolare il PV dal tessuto connettivo circostante. Legare e sezionare la vena pilorica con una sutura 7-0. Sezionare il tronco fotovoltaico a livello della vena splenica.
    2. Legare e sezionare distalmente la GDA. Crea una piccola incisione sulla parete anteriore del CHA. Inserire lo stent dell'arteria epatica nell'IC e fissarlo con una sutura di seta 7-0, lasciando un'estremità lunga circa 5 mm per facilitare la successiva anastomosi con l'ICA del ricevente.
    3. Sezionare lo SHIVC il più vicino possibile al diaframma.
    4. Sezionare gli attacchi tra il lobo caudato e lo stomaco. Dopo aver reciso i legamenti dorsali, mobilizzare completamente il fegato.
    5. Mettere il fegato in una ciotola di acciaio di 7 cm contenente una soluzione UW fredda. Trasferite la ciotola in frigorifero a 4 °C per la conservazione.
      NOTA: Per la conservazione del freddo epatico superiore a 24 ore, aggiungere antibiotici alla soluzione UW per ridurre il rischio di infezione; prendere in considerazione la sostituzione della soluzione UW ogni 24 ore.

3. Preparazione dell'innesto ex vivo

NOTA: Preparare un contenitore per il ghiaccio aperto. L'intera preparazione del tavolo posteriore è stata fatta sul ghiaccio.

  1. Fissare l'impugnatura del bracciale PV con un morsetto vascolare e stabilizzarla utilizzando una pinza antizanzare. Infilare delicatamente il PV attraverso il bracciale, assicurandosi che non si verifichino torsioni. Piegare il PV sul bracciale e fissarlo con una sutura 7-0 (Figura 3).
  2. Ripetere la procedura sopra (passaggio 3.1) per il bracciale IHIVC.
  3. Perfondere il dotto biliare attraverso il dotto cistico con 2 mL di soluzione UW. Successivamente, legare il dotto cistico.
  4. Lavare l'innesto epatico con 8-10 ml di soluzione salina fredda attraverso la cuffia PV per rimuovere la soluzione UW residua dopo la conservazione a freddo.
  5. Posizionare una singola sutura di seta 7-0 attorno all'IHIVC tra la cuffia attaccata e il lobo inferiore destro del fegato.
  6. Ruota il fegato per esporre il suo aspetto superiore. Posto 8-0 suture di stazionamento su entrambi gli angoli laterali dello SHIVC, inserendosi dall'esterno verso l'interno.

4. Operazione del destinatario

  1. Per i passaggi iniziali, fare riferimento al protocollo operativo del donatore e ripetere il passaggio 2.1.
  2. Isolamento epatico del ricevente
    1. Eseguire un'incisione sulla linea mediana dal processo xifoideo alla sinfisi pubica. Ritrarre cranialmente il processo xifoideo utilizzando una pinza per zanzare e posizionare una siringa da 5 ml sotto per sollevare lo SHIVC. Ritrarre lateralmente gli archi costali bilaterali.
    2. Eseguire la gestione dei legamenti e dei vasi sanguigni come descritto al punto 2.2.2.
    3. Isolare IHIVC come descritto nel passaggio 2.2.3.
    4. Recidere gli attacchi legamentosi tra il fegato e il retroperitoneo. Passa con cautela una pinza smussata dietro lo SHIVC e posiziona una sutura di seta 7-0 attorno ad essa.
    5. Legare il CBD prossimalmente con una sutura di seta 7-0 e sezionarlo sopra la legatura. Utilizzare una punta di cotone per separare delicatamente il dotto biliare dal PV.
    6. Sezionare il GDA e il PHA tra le legature. Create una biforcazione a forma di Y alla fine del CHA. Lasciare una lunghezza di 2 cm di sutura sulla legatura PHA per un uso successivo.
    7. Libera i rami destro e sinistro del PV. Posizionare 5 cm, punti di sutura 7-0 su ciascun ramo per la successiva manipolazione.
  3. Rimozione del fegato ricevente
    1. Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0,5% con un flusso d'aria di 0,5 L/min.
      NOTA: Mantenere una frequenza respiratoria di circa un respiro al secondo regolando il vaporizzatore di isoflurano. Valutare continuamente la profondità dell'anestesia durante la fase anepatica per prevenire la consapevolezza intraoperatoria o l'eccessiva anestesia che porta alla depressione respiratoria.
    2. Bloccare l'IHIVC sopra la vena renale destra, quindi bloccare il PV sopra la vena pilorica. Iniettare 1,5 mL di soluzione fisiologica nel PV destro in 10 s utilizzando una siringa da 2 mL per eliminare il sangue dal fegato.
    3. Ritrarre delicatamente il diaframma tirando la sutura di seta 7-0 posizionata attorno allo SHIVC, quindi applicare un morsetto bulldog allo SHIVC, inclusa una parte del diaframma.
    4. Sezionare lo SHIVC appena sopra il fegato. Fissare le suture di stazionamento 7-0 su entrambi i rami PV e sezionare il PV sopra queste legature. Sezionare l'IHIVC vicino al parenchima epatico. Rimuovere prontamente il fegato recidendo eventuali attacchi legamentosi rimanenti.
  4. Ricostruzione SHIVC
    1. Posizionare l'innesto di fegato ortotopicamente all'interno della cavità addominale. Utilizza l'allegato 8-0 suture per posizionare le suture di sostegno su entrambi gli angoli del SHIVC del ricevente, inserendole dall'interno verso l'esterno, e fissandole con nodi.
    2. Tirare delicatamente lateralmente l'estremità libera della sutura destra utilizzando una clip vascolare per allineare lo SHIVC.
    3. Sutura la parete posteriore con 8-10 punti continui, iniziando dall'angolo sinistro. Procedere alla chiusura della parete anteriore con 10-12 punti di sutura, spostandosi da destra a sinistra utilizzando la stessa sutura. Prima di completare la chiusura della parete anteriore, sciacquare la cavità SHIVC per espellere l'aria e prevenire l'embolia gassosa (Figura 4).
  5. Ricostruzione fotovoltaica
    1. Sollevare il PV utilizzando le suture di sostegno da 5 cm posizionate su entrambe le biforcazioni, applicando una leggera trazione verso l'alto con i morsetti dei vasi. Fai un'incisione nel punto medio dei rami PV.
    2. Lavare il lume PV con soluzione salina eparinizzata (300 UI/mL), quindi inserire il bracciale nel PV e fissarlo con una sutura di seta 7-0.
    3. Rilasciare in sequenza i morsetti su PV e SHIVC per ristabilire la perfusione dell'innesto e terminare la fase anepatica (Figura 5).
  6. Eseguire l'anastomosi IHIVC in modo simile alla procedura PV. Rilasciare prima la sutura 7-0 attorno al lato donatore, quindi rimuovere il morsetto dal lato ricevente.
  7. Ricostruzione dell'arteria epatica
    1. Applicare una clip microvascolare per occludere il flusso sanguigno nell'ICA del ricevente.
    2. Creare una piccola incisione alla biforcazione della configurazione Y al termine del CHA del ricevente. Lavare il lume dell'ICA con soluzione fisiologica eparinizzata (300 UI/mL), quindi inserire lo stent nell'ICA e fissarlo con una sutura di seta 7-0.
    3. Legare le suture di soggiorno su entrambi i lati del donatore e del ricevente per evitare lo spostamento dello stent. Rilasciare la clip microvascolare per ripristinare il flusso arterioso (Figura 6).
  8. Ricostruzione del dotto biliare:
    1. Fai una piccola incisione sulla parete anteriore del CBD del ricevente. Inserisci lo stent del dotto biliare nel lume del CBD del ricevente e fissalo con una sutura di seta 7-0.
    2. Legare le suture di stazionamento su entrambi i lati del donatore e del ricevente per evitare lo spostamento dello stent (Figura 7).
  9. Chiudere l'incisione addominale in due strati utilizzando suture 3-0 a corsa continua dopo il completamento delle procedure di ricostruzione (Figura 8).

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Risultati

La durata media delle procedure chirurgiche è stata la seguente: la chirurgia del donatore è stata in media di 24,8 ± 2,3 minuti, l'operazione al tavolo posteriore 15,4 ± 1,3 minuti, la chirurgia del ricevente 52,7 ± 5,1 minuti e la fase anepatica 14,2 ± 1,5 minuti.

I riceventi di innesti epatici conservati in soluzione fredda di UW per 24 ore hanno mostrato un tasso di sopravvivenza del 100% a ...

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Discussione

Basandosi sulla tecnica 2 della doppia cuffiadi Kamada, abbiamo stabilito con successo il primo modello di trapianto di fegato ortotopico in DGS. A causa delle differenze anatomiche tra il DGS e i modelli di ratto tradizionali, sono essenziali considerazioni specifiche nella preparazione del materiale, nelle procedure chirurgiche e nella gestione postoperatoria.

Fattori come il letargo e le riserve di grasso contribuiscono a significati...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto principale per le malattie croniche non trasmissibili-Scienza e tecnologia nazionale (2023ZD0507600) e dalla Fondazione nazionale per le scienze naturali della Cina (82371794 e 82170671). Il lavoro è stato sponsorizzato anche dalla Zhejiang University Education Foundation, dall'accademico Shusen Lanjuan Talent Foundation. Vorremmo anche ringraziare la professoressa Dana K. Merriman dell'Università del Wisconsin, Oshkosh, per il suo lavoro sull'allevamento degli scoiattoli di terra a 13 linee e per aver generosamente condiviso utili intuizioni ed esperienze nell'allevamento in laboratorio di modelli di roditori in letargo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Suture 3-0 con aghiJinhuan Medical Products Co., LtdR315Per la chiusura della pelle
Sutura di seta 7-0Braintree, sci, incSUT-S103
Guaina introduttore 7F Beijing Demax Medical Technology Co., Ltd.DQ07083818SManciale per IHIVC
8-0 Suture con aghiJinhuan Medical Products Co., Ltd.H821Per l'anastomsi SHIVC
Guaina introduttore 8F  Beijing Demax Medical Technology Co., Ltd.DQ08083818SManciale per IHIVC
Macchina per anestesiaRWD life Science Co.R500
Cautery di Fermo del SangueNingbo Shunye Medical Co., Ltd.BDD-YE-DT-1
Pinza Bulldog (leggermente curva)Jinzhong Medical Products Co., Ltd.XEC120SHIVC
BuprenorfinaIstituto di Ricerca Farmaceutica di Tianjin Pharmaceutical Co., LtdH12020275Antidolorifico
Cefuroxim sodioEsseti FarmaceuticiS.r.lH20160013Antibiotico
Cotton bobFuqing Health & Medicina Integrale20230R
Pinze microcurveRWD life Science Co.F11031-11Strumento chirurgico
Microforbici curve66 Vision Tech Co., Ltd.54108BStrumento chirurgico
Tampone di garzaYubei Medical Materials Co., LTD21080274
Iniezione di eparina sodioNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
Pompa di infusioneHowkmed Co., Ltd.HK-400
IsofluranoRWD life Science Co.21070201
Micro portaagoWorld Precision Instruments Co., Ltd.555408NTStrumento chirurgico
Clip micro recipienteRWD life Science Co.R31005-06PV e IHIVC
Applicatore a clip micro recipientiRWD life Science Co.R34001-14Strumento chirurgico
PortaaghiRWD life Science Co.F31025-13Chiusura addominale
Soluzione salinaZhejiang Tianrui Pharmaceutical Co., Ltd716092103
Pinza micro drittaRWD life Science Co.F11029-11Strumento chirurgico
Microscopio chirurgicoLeicaM650
Piattaforma chirurgicaN/AN/APersonalizzato, magnetico
Pinze tissutaliRWD life Science Co.F12002-12Strumento chirurgico
Forbici tissutaliRWD life Science Co.S12003-09Strumento chirurgico
Soluzione UWSistemi di recupero degli organiSPS-1Perfusione e conservazione dell'organo 

Riferimenti

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